專利名稱：一種鏈酶親和素結合功能熒光磁性納米顆粒的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及基因重組蛋白和納米材料的應用領域，具體說是一種鏈酶親和素結合功能熒光磁性納米顆粒的應用。
背景技術：
細胞凋亡在保證多細胞生物的健康生存過程中扮演著關鍵角色，對個體的正常發育及細胞凋亡紊亂在病理學研究中的重要作用，引起了人們對其機制和組分的廣泛而深入地研究，成為目前生命科學界最為熱門話題之一，也是生命科學界乃至社會各界爭相投入的研究領域。隨著這方面研究的持續升溫，涌現出了大量新的技術和方法對細胞凋亡進行檢測，商品化的產品出現也大大加速了研究的進程。其中，凋亡細胞的早期檢測，主要通過細胞表面磷脂酰絲氨酸的表達作為免疫識別標志，可以通過一系列Armexin V產品，結合熒光標記技術和流式細胞儀進行檢測。隨著納米技術的快速發展，磁性納米粒子以其獨特的尺寸效應和磁場操作特性， 在生物醫學領域受到了廣泛的關注。通過不同的功能化修飾，結合熒光標記，酶聯免疫以及信號放大等技術，越來越多的多功能磁性納米粒子應運而生。中國專利“一種鏈酶親和素結合功能熒光磁性納米顆粒的制備方法，201010261766. 7，2010. 08. 20”，提供了一種結合基因重組技術和納米技術的鏈酶親和素結合功能熒光磁性納米顆粒，為生物活性物質提供新技術的同時，也為凋亡細胞的可視化富集、分離提供了新的工具。

發明內容
本發明目的在于提供一種鏈酶親和素結合功能熒光磁性納米顆粒的應用。為實現上述目的，本發明采用的技術方案為一種鏈酶親和素結合功能熒光磁性納米顆粒的應用，采用鏈酶親和素結合功能熒光磁性納米顆粒檢測凋亡細胞。將鏈酶親和素修飾的熒光磁性納米顆粒投加于含有生物素標記凋亡細胞的細胞懸浮液中，通過酶聯免疫反應，使鏈酶親和素修飾的熒光磁性納米顆粒特異結合生物素標記的凋亡細胞，并于磁力作用下(即外置磁鐵)分離出與凋亡細胞特異性結合鏈酶親和素結合功能熒光磁性納米顆粒。將上述分離出的與凋亡細胞特異性結合鏈酶親和素結合功能熒光磁性納米顆粒進行離心去除游離的顆粒，即得到凋亡細胞特異性結合鏈酶親和素結合功能熒光磁性納米顆粒。所述與含有生物素標記的凋亡細胞特異性結合的鏈酶親和素結合功能熒光磁性納米顆粒是，將3. 0-4. 0毫克鏈酶親和素結合功能熒光磁性納米顆粒投入1-3毫升含鏈酶親和素的PBS溶液中，室溫振蕩5-10分鐘后，用PBS洗三次后，待用；所述含鏈酶親和素的 PBS溶液為每毫升PBS溶液內含0. Olmg鏈酶親和素。所述含有生物素標記凋亡細胞將8_10 微升濃度為0. lmg/ml的Armexin V-biotin加入1毫升約含1 X IO6個細胞的懸浮液中，室溫培育10-15分鐘后，280-300g離心5_6分鐘，而后用PBS洗三次后，即得到含有生物素標記凋亡細胞的細胞懸浮液。所述通過磁分離實現游離的鏈酶親和素結合功能熒光磁性納米顆粒及與凋亡細胞特異性結合的鏈酶親和素結合功能熒光磁性納米顆粒的分離后，再通過 ^0-300g，5-6分鐘的離心處理去除游離的顆粒，得到與凋亡細胞特異性結合的鏈酶親和素結合功能熒光磁性納米顆粒。本發明所具有的優點本發明采用鏈霉親和素結合功能熒光磁性納米顆粒作為工具，結合酶聯免疫技術實現了凋亡細胞的識別分離及成像，充分利用了鏈霉親和素-生物素之間的特異結合作用及信號放大作用，以及鏈霉親和素結合功能磁性納米顆粒的磁分離特性及熒光成像作用，實現了凋亡細胞的可視化富集、分離和成像。


圖1為本發明實施例提供的待分離細胞懸浮液涂片成像圖，其中a，可見光成像， b，熒光成像。圖2為本發明實施例提供的鏈霉親和素修飾熒光磁性納米顆粒的涂片成像圖，其中a，可見光成像，b，熒光成像。圖3為本發明實施例提供的顆粒與細胞懸浮液共培育后10-15分鐘后，懸浮液涂片成像圖，其中a，可見光成像，b，熒光成像。圖4為本發明實施例提供的磁分離游離的未結合細胞的顆粒及顆粒-凋亡細胞復合物的混合物成像圖，其中a，可見光成像，b，熒光成像。圖5為本發明實施例提供的離心去除游離顆粒后，顆粒-凋亡細胞復合物成像圖， 其中a，可見光成像，b，熒光成像。
具體實施例方式實施例11，向1毫升含有約IO6個細胞的PBS溶液中，力卩入10微升0. lmg/ml AnnexinV-biotin (Medical and Biological Laboratories Co. , LTD. Japan),室溫共培育
10-15分鐘，300g離心5分鐘收集細胞，0.5ml PBS/次，洗三次，得到含有生物素標記凋亡細胞的細胞懸浮液(參見圖Ia圖lb)；2，將4. 0毫克鏈酶親和素結合功能熒光磁性納米顆粒投加入1毫升0. 0lmg/ml鏈酶親和素的PBS溶液中，室溫共培育5分鐘，磁分離，0. 5ml PBS/次，洗三次，得到鏈酶親和素修飾的熒光磁性納米顆粒，即備即用(參見圖加圖2b)；鏈酶親和素結合功能熒光磁性納米顆粒的制備過程參見申請號為 20101(^61766. 7，一種鏈酶親和素結合功能熒光磁性納米顆粒的制備方法的專利申請案， 具體為1)通過PCR反應將Mi^pII標簽基因分別連在別藻藍蛋白APC的α和β亞基脫輔基蛋白基因的N末端，分別得到Mi^pII-apcA和乂1~印II-apcB基因片段，待用；2)將Mi^p II-apcA基因片段插入到帶有6XHis基因的載體A中6XHis基因的下游，同時將藻膽素生物合成酶基因ho 1和pcyA插入到載體上，得到ρ⑶F-Mr印
11-apcA-hol-pcyA,待用；將Mi^p II-apcB基因片段插入到帶有6XHis基因的載體B中6XHis基因的下游，同時將色基裂合酶基因cpcS和cpcU插入到載體上，得到pRSF-Str印 II-apcB-cpcS-cpcU,待用；3)將步驟2~)所得兩個表達載體同時轉化大腸桿菌，篩選獲得同時表達上述基因的工程菌；4)將上述工程菌誘導培養后分離純化，得到雙標簽重組APC熒光蛋白質；5)將所得雙標簽重組APC熒光蛋白質與鋅離子修飾的超順磁性硅殼納米顆粒振蕩混合，即得到鏈酶親和素結合功能熒光磁性納米顆粒。3，將鏈霉親和素修飾的熒光磁性納米顆粒投入含有生物標記凋亡細胞的細胞懸浮液中，室溫共培育10-15分鐘(參見圖3a圖3b)，通過外置磁力作用下磁分離得到游離的未與細胞結合的鏈霉親和素修飾的熒光磁性納米顆粒及顆粒-生物素標記凋亡細胞的復合物的混合物(參見圖如圖4b)；4，將磁分離得到的游離的未與細胞結合的鏈霉親和素修飾的熒光磁性納米顆粒及顆粒-凋亡細胞復合物的混合物，懸浮于0. 5毫升PBS溶液中，300g離心5分鐘，上清回收游離的未與細胞結合的鏈霉親和素修飾的熒光磁性納米顆粒，沉淀為顆粒-凋亡細胞復合物，將顆粒-凋亡細胞復合物涂片，在熒光顯微鏡下熒光成像(參見圖fe圖5b)。實施例2與實施例1不同之處在于所述與含有生物素標記的凋亡細胞特異性結合的鏈酶親和素結合功能熒光磁性納米顆粒是，將3. 0毫克鏈酶親和素結合功能熒光磁性納米顆粒投入3毫升含鏈酶親和素的PBS溶液中，室溫振蕩10分鐘后，用PBS洗三次后，待用；所述含鏈酶親和素的PBS溶液為每毫升PBS溶液內含0. Olmg鏈酶親和素。所述含有生物素標記凋亡細胞將8微升濃度為0. lmg/ml的ArmexinV-biotin加入1毫升約含ι χ IO6個細胞的懸浮液中，室溫培育10-15分鐘后，280g離心6分鐘，而后用 PBS洗三次后，即得到含有生物素標記凋亡細胞的細胞懸浮液。所述通過磁分離實現游離的鏈酶親和素結合功能熒光磁性納米顆粒及與凋亡細胞特異性結合的鏈酶親和素結合功能熒光磁性納米顆粒的分離后，再通過^Og, 6分鐘的離心處理去除游離的顆粒，得到與凋亡細胞特異性結合的鏈酶親和素結合功能熒光磁性納米顆粒。
權利要求
1.一種鏈酶親和素結合功能熒光磁性納米顆粒的應用，其特征在于采用鏈酶親和素結合功能熒光磁性納米顆粒檢測凋亡細胞。
2.按權利要求1所述的鏈酶親和素結合功能熒光磁性納米顆粒的應用，其特征在于 將鏈酶親和素修飾的熒光磁性納米顆粒投加于含有生物素標記凋亡細胞的細胞懸浮液中， 通過酶聯免疫反應，使鏈酶親和素修飾的熒光磁性納米顆粒特異結合生物素標記的凋亡細胞，于磁力作用下(分離出與凋亡細胞特異性結合鏈酶親和素結合功能熒光磁性納米顆粒。
3.按權利要求2所述的鏈酶親和素結合功能熒光磁性納米顆粒的應用，其特征在于 將上述分離出的與凋亡細胞特異性結合鏈酶親和素結合功能熒光磁性納米顆粒進行離心去除游離的顆粒，即得到凋亡細胞特異性結合鏈酶親和素結合功能熒光磁性納米顆粒。
4.按權利要求1或2所述的鏈酶親和素結合功能熒光磁性納米顆粒的應用，其特征在于所述與含有生物素標記的凋亡細胞特異性結合的鏈酶親和素結合功能熒光磁性納米顆粒是，將3. 0-4. 0毫克鏈酶親和素結合功能熒光磁性納米顆粒投入1-3毫升含鏈酶親和素的PBS溶液中，室溫振蕩5-10分鐘后，用PBS洗三次后，待用；所述含鏈酶親和素的PBS溶液為每毫升PBS溶液內含0. Olmg鏈酶親和素。
5.按權利要求2所述的鏈酶親和素結合功能熒光磁性納米顆粒的應用，其特征在于 所述含有生物素標記凋亡細胞將8-10微升濃度為0. lmg/ml的Armexin V-biotin加入1 毫升約含1 X IO6個細胞的懸浮液中，室溫培育10-15分鐘后，280-300g離心5_6分鐘，而后用PBS洗三次后，即得到含有生物素標記凋亡細胞的細胞懸浮液。
6.按權利要求2所述的鏈酶親和素結合功能熒光磁性納米顆粒的應用，其特征在于 所述通過磁分離實現游離的鏈酶親和素結合功能熒光磁性納米顆粒及與凋亡細胞特異性結合的鏈酶親和素結合功能熒光磁性納米顆粒的分離后，再通過^0-300g，5-6分鐘的離心處理去除游離的顆粒，得到與凋亡細胞特異性結合的鏈酶親和素結合功能熒光磁性納米顆粒。
全文摘要
本發明涉及基因重組蛋白和納米材料的應用領域，具體說是一種鏈酶親和素結合功能熒光磁性納米顆粒的應用。采用鏈酶親和素結合功能熒光磁性納米顆粒檢測凋亡細胞。本發明采用鏈霉親和素結合功能熒光磁性納米顆粒作為工具，結合酶聯免疫技術實現了凋亡細胞的識別分離及成像，充分利用了鏈霉親和素-生物素之間的特異結合作用及信號放大作用，以及鏈霉親和素結合功能磁性納米顆粒的磁分離特性及熒光成像作用，實現了凋亡細胞的可視化富集、分離和成像。
文檔編號G01N21/64GK102174635SQ201010622840
公開日2011年9月7日 申請日期2010年12月31日 優先權日2010年12月31日
發明者吳寧, 姜鵬, 崔玉琳, 李富超, 秦松, 陳華新, 陳英杰 申請人:中國科學院海洋研究所