一種酪氨酸酚裂解酶工程菌及其構建方法與應用
【專利摘要】本發明涉及一種酪氨酸酚裂解酶工程菌及其構建方法與應用，將酪氨酸酚裂解酶基因構建表達質粒，同時導入伴侶蛋白表達質粒所得到，鑒定為大腸埃希氏菌，命名為大腸埃希氏菌 FPLF8（Escherichia coli HPLF8），保存于中國典型培養物保藏中心，保藏日期為2016年2月19日，保藏編號為CCTCCNO：M 2016065。利用該工程菌，可以通過發酵、轉化合成左旋多巴，表達高效，表達產物穩定、活性高，可以在提供相關底物下，轉化合成左旋多巴，工藝簡單，成本低廉，產率高，同時三廢排放少，具有工業化生產的應用價值。CCTCC NO: M2019
【專利說明】
一種酪氨酸酚裂解酶工程菌及其構建方法與應用
技術領域
[0001] 本發明涉及一種工程菌及其構建方法，具體是一種酪氨酸酚裂解酶工程菌及其構 建方法與應用，屬于基因工程領域。
【背景技術】
[0002] 左旋多巴（3，4-dihydroxyphenyl-L-ananine，簡稱L-D0PA)的化學名稱為3，4_二 羥基苯基丙氨酸，其結構式為：
作為一種重要的生物活性物質，L-D0PA是從L-酪氨酸到兒茶酚或黑色素的生化代謝途 徑過程中的重要中間產物。
[0003] 上世紀60年代，國外許多學者開始致力于微生物酶法合成L-D0PA的研究。為了提 高L-D0PA產量和底物轉化率，研究者們對微生物酶法合成L-D0PA的工藝方法進行了大量研 究。
[0004] 酪氨酸酸裂解酶（Tyrosine phenol lyase，TPL，E.C.4.1.99.2)，又名β-酪氨酸 酶，以磷酸吡咳醛(pyridoxal_phosphate，PLP)為輔酶，以鉀離子和氨離子為輔助因子，TPL 可以催化L-酪氨酸發生β-消去反應生成苯酚、丙酮酸和氨。由于這個反應是可逆的，將鄰苯 二酚代替苯酚后，可由鄰苯二酚、丙酮酸和氨可在TPL催化下生成L-D0PA。左旋多巴的前體 在較高濃度時對酶活都有抑制作用，其中鄰苯二酚及丙酮酸除了有強抑制作用外，還會導 致酶的不可逆失活，反應條件難以控制，副產物多，L-D0PA的產率低。
[0005] 也有一些利用自然界中的細菌，如i?scAericAia、Pro ieus(變形菌屬）、 ?SYizoJoWufflAassjbo和i?rri/3ia(歐文氏菌屬)等，來合成L-D0PA，如左旋多巴酶法合成綜述 報道，TPL大腸桿菌基因工程菌轉化30h，轉化生成29.6g/L的L-D0PA。又如，Jang-Young Lee 等人克隆來源于Escherichia coli W(ATCC11105)的對羥基苯乙酸-3-羥基化酶（口-hydroxyphenylacetate 3-hydroxylase，PHAH)，轉化L-酪氨酸為L-D0PA，產物累積至 10g/ L，該技術申請了專利US5837504。研究者發現這些重組菌株雖然TPL的表達量高于野生菌 株，但最終的L-D0PA合成能力卻沒有明顯提高甚至低于野生菌株。這可能因為要獲得較高 的L-D0PA合成能力，菌株除了具備TPL高活性外，還要有相對完善的底物、產物出入細胞膜 的轉運機制以及對底物鄰苯二酚抑制酶活的耐受力等。總體來說，反應條件難以控制，穩定 性差，副產物多，L-D0PA的產率低。

【發明內容】

[0006] 本發明的目的之一是提供一種工程菌；鑒定為大腸埃希氏菌，命名為大腸埃希氏 菌FPLF8(Escherichia coli FPLF8)，保存于中國典型培養物保藏中心，保藏地址:武漢大 學武昌珞珈山，保藏日期為2016年2月19日，保藏編號為CCTCCNO:M 2016065。
[0007] 本發明的目的之一是提供所述工程菌的構建方法，將酪氨酸酚裂解酶基因構建表 達質粒，同時導入伴侶蛋白表達質粒，得到大腸埃希氏菌FPLF8。
[0008] 本發明的目的之三是提供所述工程菌的應用，利用該工程菌，可以通過發酵、轉化 合成左旋多巴，產率高、副產物少，穩定性好，品質好，三廢排放少。
[0009] 為了達到上述目的，本發明采用如下技術方案： 所述工程菌是將酪氨酸酚裂解酶基因連入表達載體上，構建表達質粒PFPL，再將表達 質粒pFPL導入受體菌大腸桿菌中得到。
[0010]作為優選，向導入有表達質粒PFPL的大腸桿菌中再導入伴侶蛋白表達質粒，獲得 大腸埃希氏菌FPLF8。導入伴侶蛋白表達質粒，可以起到促進大腸埃希氏菌FPLF8酶的可 溶性表達，從而提高單位菌體的酶活，和發酵酶活性單位的穩定，后續轉化合成左旋多巴 時，投菌量少，反應快速，保持高產率，后續轉化合成左旋多巴穩定。
[0011]進一步，所述伴侶蛋白表達質粒為PG-KJE8,效果更明顯，大腸埃希氏菌FPLF8目 的酶表達更佳。
[0012] 作為優選，所述酪氨酸酚裂解酶基因來源于弗氏檸檬酸桿菌，連入表達載體上融 合性好，后續表達穩定，表達產物更高效地、更專一的合成左旋多巴，副產物少，給后續的分 離純化帶來了很大的方便，并簡化了分離步驟，有效的降低了生產成本。
[0013] 作為優選，所述表達載體采用pET24a，與目的基因片段融合性更好，后續表達更穩 定。
[0014] 作為優選，所述受體菌大腸桿菌采用BL21 (DE3)，酶表達效率高，而且表達穩定，產 率高，遺傳穩定性高。
[0015] 作為優選，構建方法具體包括:（1)將克隆得到的酪氨酸酚裂解酶全基因片段整合 進表達載體pET24a上，并將整合后的重整質粒轉化進入BL21 (DE3 )，獲得FPL菌；（2 )將伴侶 蛋白表達質粒導入FPL菌中，獲得FPLF8菌。
[0016]上述方案通過優選表達載體和受體菌，可以有效提尚目的基因片段的表達效率， 表達穩定性，借助伴侶蛋白表達質粒，提高工程菌表達產生酪氨酸酚裂解酶活性以及穩定 性。
[0017]上述所得到的工程菌大腸埃希氏菌FPLF8,用于在底物溶液存在條件下，轉化產 生L-多巴。
[0018]具體操作步驟包括： (1) 挑單菌落接種到含LB培養基的試管中，加卡納霉素（100mg/L)、氯霉素(25mg/L)， 35-37°C，220rpm，培養 12-16h，得到一級種子； (2) 將所述一級種子接種到含發酵培養基的搖瓶中，35-37°C，200-250rpm，培養2-5h， 加 IPTG至終濃度1-1.5mM，23-27°C，180-220rpm，培養10-12h;所述發酵培養基組分如下:胰 蛋白胨128/1、酵母提取物248/1、甘油58/1，磷酸二氫鉀2.318/1、三水磷酸氫二鉀16.43 g/L； (3) 離心收菌，得到菌體； (4) 菌體60g，加入底物溶液，攪勻，25°C，密封震蕩反應;所述底物溶液包括14-16g/L的 丙酮酸鈉、l〇_12g/L的鄰苯二酚、40-45g/L的氯化銨、2-5 g//L的亞硫酸鈉、l_3g/L的EDTA，調 pH7.5-8.5； 作為優選，步驟(4)中反應期間，多次添加底物鄰苯二酚和丙酮酸鈉，控制鄰苯二酚濃 度不超過l〇g/L。
[0019] 本發明的有益效果如下:本發明得到工程菌，表達高效，表達產物穩定、活性高，可 以在提供相關底物下，轉化合成左旋多巴，工藝簡單，成本低廉，產率高，同時三廢排放少， 具有工業化生產的應用價值。
【具體實施方式】
[0020] 下面結合實施例對本發明進一步加以說明。
[0021] 實施例1: 1.將BL2UDE3)制備成感受態細胞 使用TAKARA感受態細胞制備試劑盒，按說明書操作，制備獲得BL21 (DE3)感受態。
[0022] 2.全基因合成酪氨酸酚裂解酶基因片段 根據Gene ID:X66978.1提供的序列，合成來源的酪氨酸酚裂解酶全基因片段。
[0023] 3.構建酪氨酸酶表達質粒pFPL 將酪氨酸酶全基因片段亞克隆至pET24a質粒，酶切位點BamHI，Xhol。
[0024] 4.表達質粒pFPL導入感受態細胞 1) 感受態從-70度取出后立刻插入冰水浴中3min; 2) 超凈臺中取1微升的質粒pFPL加入感受態，輕彈混勻，立刻插入冰水浴25min，靜置； 3) 將感受態輕輕轉移至42度水浴熱激1.5min，立刻輕輕轉移至冰水浴5min; 4) 加700微升左右的LB，150rpm，37度，60min復蘇； 5 )3500rpm*3min，棄上清600-700微升，剩余菌液吹吸混勻，涂布加氨芐青霉素（100mg/ L)LB平板，37°C培養16h，獲得大腸埃希氏菌FPLF8。
[0025] 實施例2: 1.將BL2UDE3)制備成感受態細胞 使用TAKARA感受態細胞制備試劑盒，按說明書操作，制備獲得BL21 (DE3)感受態。 [0026] 2.全基因合成酪氨酸酚裂解酶基因片段 根據Gene ID:X66978.1提供的序列，合成來源的酪氨酸酚裂解酶全基因片段。
[0027] 3.構建酪氨酸酶表達質粒pFPL 將酪氨酸酶全基因片段亞克隆至pET24a質粒，酶切位點BamHI、Xh〇I。
[0028] 4.表達質粒pFPL導入感受態細胞 6) 感受態從-70度取出后立刻插入冰水浴中3min; 7) 超凈臺中取1微升的質粒pFPL加入感受態，輕彈混勻，立刻插入冰水浴25min，靜置； 8) 將感受態輕輕轉移至42度水浴熱激1.5min，立刻輕輕轉移至冰水浴5min; 9) 加700微升左右的LB，150rpm，37度，60min復蘇； 10) 3500rpm*3min，棄上清600-700微升，剩余菌液吹吸混勻，涂布加氨芐青霉素 (100mg/L)LB 平板，37°C 培養 16h，獲得 FPL 菌； 5. FPL菌感受態制備 使用TAKARA感受態細胞制備試劑盒，按說明書操作，制備獲得BL21 (DE3)感受態。
[0029] 6.伴侶蛋白表達質粒導入FPL感受態細胞 1) 感受態從-70度取出后立刻插入冰水浴中3min; 2) 超凈臺中取1微升的伴侶蛋白表達質粒PG-KJE8加入感受態，輕彈混勻，立刻插入冰 水浴25min，靜置； 3) 將感受態輕輕轉移至42度水浴熱激1.5min，立刻輕輕轉移至冰水浴5min; 4) 加700微升左右的LB，150rpm，37度，60min復蘇； 5 )3500rpm*3min，棄上清600-700微升，剩余菌液吹吸混勾，涂布加卡納霉素（100mg/ L)、氯霉素(25mg/L)LB平板，37 °C培養16h，獲得FPLF8菌。
[0030] 實施例3: 與實施例2的不同之處在于，伴侶蛋白表達質粒選用pKJE7。
[0031] 實施例4: 1.將BL2UDE3)制備成感受態細胞 使用TAKARA感受態細胞制備試劑盒，按說明書操作，制備獲得BL21 (DE3)感受態。
[0032] 2.全基因合成酪氨酸酚裂解酶基因片段 根據Gene ID:X66978.1提供的序列，合成來源的酪氨酸酚裂解酶全基因片段。
[0033] 3.構建酪氨酸酶表達質粒pFPL 將酪氨酸酶全基因片段亞克隆至pET24a質粒，酶切位點BamHI，Xhol。
[0034] 4.表達質粒pFPL導入感受態細胞 11) 感受態從-70度取出后立刻插入冰水浴中3min; 12) 超凈臺中取1微升的質粒pFPL加入感受態，輕彈混勾，立刻插入冰水浴25min，靜 置； 13) 將感受態輕輕轉移至42度水浴熱激1.5min，立刻輕輕轉移至冰水浴5min; 14) 加700微升左右的LB，150rpm，37度，60min復蘇； 15) 3500rpm*3min，棄上清600-700微升，剩余菌液吹吸混勻，涂布加氨芐青霉素 (100mg/L)LB 平板，37°C 培養 16h，獲得 FPL 菌； 5. FPL菌感受態制備 使用TAKARA感受態細胞制備試劑盒，按說明書操作，制備獲得BL21 (DE3)感受態。 [0035] 6.伴侶蛋白質粒導入FPL感受態細胞 6) 感受態從-70度取出后立刻插入冰水浴中3min; 7) 超凈臺中取1微升的伴侶蛋白表達質粒PG-KJE8加入感受態，輕彈混勻，立刻插入冰 水浴25min，靜置； 8) 將感受態輕輕轉移至42度水浴熱激1.5min，立刻輕輕轉移至冰水浴5min; 9) 加700微升左右的LB，150rpm，37度，60min復蘇； 10) 3500rpm*3min，棄上清600-700微升，剩余菌液吹吸混勻，涂布加卡納霉素（100mg/ L)、氯霉素(25mg/L)LB平板，37 °C培養16h，獲得FPLF8菌； 7.發酵產生酪氨酸酚裂解酶 LB培養基:胰蛋白胨10g/L、酵母提取物0.5 g/L、氯化鈉10g/L、純水。
[0036]發酵培養基:胰蛋白胨12g/L、酵母提取物24g/L、甘油5g/L，磷酸二氫鉀2.31 g/L、 三水磷酸氫二鉀16.43 g/L、純水。
[0037] 1)挑單菌落接種4ml LB培養基試管中，加卡納霉素（100mg/L)、氯霉素（25mg/L)， 37°C，220rpm，培養12h，得到一級種子； 2) -級種子接種到100ml的發酵培養基的搖瓶中，37 °C，220rpm，培養4h，加 IPTG至終濃 度lmM，25°C，220rpm，培養 12h; 3) 步驟(2 )中菌液離心收菌體，放置-20 °C冰箱。
[0038] 8.酪氨酸酚裂解酶轉化產生L-多巴 1) 1L底物溶液：14g/L的丙酮酸鈉、10g/L的鄰苯二酚、40g/L的氯化銨、2g/l的亞硫酸 鈉、lg/L 的 EDTA，調 PH8.0; 2) 菌體60g，加入1L底物溶液，攪勻，25 °C，密封震蕩反應； 3) 當鄰苯二酚殘留濃度至lg/L以下，停止反應，L-多巴濃度累積至85g/L以上。
[0039] 實施例5: 與實施例4的不同之處在于： 1.發酵產生酪氨酸酚裂解酶 4) 挑單菌落接種4ml LB試管，加卡納霉素（100mg/L)、氯霉素（25mg/L)，35°C，200rpm， 培養14h，得到一級種子； 5) -級試管種子接種100ml的TB搖瓶，35 °C，200rpm，培養2h，加 IPTG至終濃度1.5mM，23 °C，180rpm，培養10h;發酵培養基:胰蛋白胨12g/L、酵母提取物24g/L、甘油5g/L，磷酸二氫 鉀2.31 g/L、三水磷酸氫二鉀16.43 g/L。
[0040] 6)離心收菌，放置-20 °C冰箱。
[00411 2.酪氨酸酚裂解酶轉化產生L-多巴 4) 1L底物溶液：15g/L的丙酮酸鈉、llg/L的鄰苯二酚、43g/L的氯化銨、3g//L的亞硫酸 鈉、2g/L 的 EDTA，調 PH7.5; 5) 菌體60g，PLP-100mg，加入1L底物溶液，攪勻，25 °C，密封震蕩反應； 6) 轉化過程補加底物鄰苯二酚和丙酮酸鈉，保持鄰苯二酚濃度8g/L; 7) L-多巴累積至65g/L，停止增加底物，當鄰苯二酚殘留濃度至lg/L以下，停止反應，L-多巴濃度累積至85g/L以上。
[0042] 實施例6: 與實施例4的不同之處在于： 在底物溶液存在條件下，發酵、轉化產生L-多巴的具體操作步驟包括： (1) 挑單菌落接種到含LB培養基的試管中，加卡納霉素（100mg/L)、氯霉素(25mg/L)， 36°C，250rpm，培養16h，得到一級種子； (2) 將所述一級種子接種到含發酵培養基的搖瓶中，36°C，250rpm，培養2-5h，加 IPTG至 終濃度ImM，27°C，220rpm，培養1 lh;所述發酵培養基組分如下:胰蛋白胨12g/L、酵母提取物 24g/L、甘油5g/L，磷酸二氫鉀2.31 g/L、三水磷酸氫二鉀16.43 g/L; (3) 步驟(2)中菌液離心收集菌體； (4) 菌體60g，加入底物溶液，攪勻，25°C，密封震蕩反應;所述底物溶液包括16g/L的丙 酮酸鈉、12g/L的鄰苯二酚、45g/L的氯化銨、5g/L的亞硫酸鈉、3g/L的EDTA，調pH8.5; (5 )當鄰苯二酚殘留濃度至0.5g/L以下，停止反應。
【主權項】
1. 一種酪氨酸酚裂解酶工程菌，名稱為大腸埃希氏菌FPLF8(ESCheriChia coli FPLF8)，保存于中國典型培養物保藏中心，保藏日期為2016年2月19日，保藏編號為 CCTCCN0：M 2016065〇2. 根據權利要求1所述一種酪氨酸酚裂解酶工程菌，其特征在于，所述工程菌是將酪氨 酸酚裂解酶基因連入表達載體上，構建表達質粒PFPL，再將表達質粒pFPL導入受體菌大腸 桿菌中得到。3. 根據權利要求2所述一種酪氨酸酚裂解酶工程菌，其特征在于，向導入有表達質粒 PFPL的大腸桿菌中再導入伴侶蛋白表達質粒，獲得大腸埃希氏菌FPLF8。4. 根據權利要求3所述一種酪氨酸酚裂解酶工程菌的構建方法，其特征在于，所述伴侶 蛋白表達質粒為PG-KJE8。5. 根據權利要求1所述一種酪氨酸酚裂解酶工程菌，其特征在于，所述酪氨酸酚裂解酶 基因來源于弗氏檸檬酸桿菌。6. 根據權利要求1所述一種酪氨酸酚裂解酶工程菌，其特征在于，所述表達載體采用 pET24a〇7. 根據權利要求1所述一種酪氨酸酚裂解酶工程菌，其特征在于，所述受體菌大腸桿菌 采用 BL2UDE3)。8. 如權利要求1所述一種酪氨酸酚裂解酶工程菌的構建方法，其特征在于，包括：（1)將 克隆得到的酪氨酸酚裂解酶全基因片段整合進表達載體pET24a上，并將整合后的重整質粒 轉化進入BL21 (DE3)，獲得FPL菌；（2)將伴侶蛋白表達質粒導入FPL菌中，獲得FPLF8菌。9. 如權利要求1所述一種酪氨酸酚裂解酶工程菌的應用，其特征在于，用于在底物溶液 存在條件下，發酵、轉化產生L-多巴。10. 根據權利要求9所述一種酪氨酸酚裂解酶工程菌的應用，其特征在于，在底物溶液 存在條件下，發酵、轉化產生L-多巴的具體操作步驟包括： (1) 挑單菌落接種到含LB培養基的試管中，加卡納霉素（100mg/L)、氯霉素（25mg/L)， 35-37°C，200-250rpm，培養 12-16h，得到一級種子； (2) 將所述一級種子接種到含發酵培養基的搖瓶中，35-37°C，200-250rpm，培養2-5h， 加 IPTG 至終濃度 1-1.5111]\1，23-27°(：，180-220印111，培養10-1211; (3) 步驟(2)中菌液離心收集菌體； (4) 菌體60g，加入底物溶液，攪勻，25°C，密封震蕩反應;所述底物溶液包括14-16g/L的 丙酮酸鈉、l〇_12g/L的鄰苯二酚、40-45g/L的氯化銨、2-5 g//L的亞硫酸鈉、l_3g/L的EDTA，調 pH7.5-8.5； (5) 當鄰苯二酚殘留濃度至lg/L以下，停止反應。
【文檔編號】C12N15/70GK105886450SQ201610287965
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年5月4日
【發明人】儲消和, 吳黎誠, 余煒, 方明山, 徐順清, 周衛國, 張擁軍
【申請人】浙江綠創生物科技有限公司, 浙江野風藥業股份有限公司