專利名稱：一種重組蛋白a基因及其表達產物的制備方法和用途的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，具體的說，涉及一種重組蛋白A基因，以及含有這種重組基因的載體、轉化的菌株和重組蛋白A基因表達的產物，及其制備方法和用途。
背景技術：
葡萄球菌蛋白A(Staphylococal Protein A，SPA)是一種從金黃色葡萄球菌細胞壁分離的蛋白質。1940年，Vevwey發現在某些金黃色葡萄球菌中，含有一種物質，在雙向擴散試驗中，能與正常人血清形成沉淀。Jensen(1959)也發現了類似現象，將其命名為A抗原。
1963年Lofkvist等分離了A抗原，并證明它是一種蛋白質，且與糖有區別；Grov(1960)將其命名為葡萄球菌蛋白A，簡稱SPA蛋白A(ProteinA)。編碼SPA的基因于1983年被克隆并在大腸桿菌中表達(Duggleby，C.J and Jones，SAcloning and expression of the Staphylococcus aureus protein A gene in Escherichiacoli.Nucl Acids Res.11(1983)3065-3076；Lofdahl，S.，Guss，B.，et al；Gene forStaphylococcal protein A.Proc.Natl.Acid.Sci.USA 80(1983)697-701)。對SPA結構和功能的研究發現，SPA分子包含A、B、C、D、E五個同源結構域，每個結構域都有能與IgG自主結合的能力。SPA基因有1600bp。
由于葡萄球菌蛋白A上有5個結構域可以與IgG的Fc區結合，具有與大多數哺乳動物IgG的Fc段結合的能力。作為一種親和配基，蛋白A被固定在瓊脂糖上面，它上面的5個結構域就可以與IgG的Fc自由結合，一分子固定的蛋白A可以與兩分子的IgG結合，重組蛋白A其C端有一個胱氨酸，結合IgG的能力更強。重組蛋白A被廣泛應用于單克隆抗體或多克隆抗體的分離純化和檢測。在使用含有proteinA的親和層析技術時，存在親和力低、純化效率低等問題，因此在使用該親和層析技術時，需要一種改進的ProteinA，來實現更高的親和力，提高純化的效果。

發明內容
本發明需要解決的技術問題之一是提供一種新的重組蛋白A的基因序列，以克服現有技術的不足。
本發明需要解決的技術問題之二是提供該重組蛋白A的氨基酸序列，以克服現有技術的不足。
本發明需要解決的技術問題之三是提供含有該重組蛋白A基因的載體。
本發明需要解決的技術問題之四是提供被含有重組蛋白A基因的表達載體轉化宿主細胞。
本發明需要解決的技術問題之五是提供該重組蛋白A的制備方法。
本發明需要解決的技術問題之六是提供該重組蛋白A的用途。
本發明需要解決的技術問題之七是提供一種由該重組蛋白A和層析介質載體組成的親和層析介質。
本發明的技術方案如下本發明提供的重組蛋白A基因是以3個人工合成的重組蛋白A基因單體串連而成，5‘端Ala-Asp突變成Val-Asp，以形成Accl酶切位點(GTAGAC)，各重組蛋白A基因單體間以AccI酶切位點相連，其中第一個重組蛋白A基因單體前端加入與表達載體相連的NcoI酶切位點，6個His(用于親和層析，與鎳柱結合，減少純化步驟)和EK酶切位點(將His和DDDDK切去，形成正確的ProteinA)，最后一個重組蛋白A基因單體末端加入中止密碼子TAA和與表達載體pET32a相連的BamH I酶切位點。該基因由621個核苷酸構成，編碼180個氨基酸。該基因序列及其編碼的氨基酸序列見序列表SEQ ID No.1和SEQ ID No.2。
本發明還構建了含有上述重組蛋白A基因的載體，這些載體的構建方法是按照常規方法，將通過人工合成的重組蛋白A基因單體酶切后接入相應載體的相應酶切位點之間，再以Acc I內切酶酶切，連接成包含多個串連重組蛋白A基因單體的重組蛋白A基因表達載體。
上述含重組蛋白A基因的大腸桿菌表達載體優先由本發明合成的重組蛋白A基因與大腸桿菌表達載體PET32構建成的重組表達載體，命名為pET32a-P。
本發明還提供了利用上述含大腸桿菌重組表達載體的大腸桿菌重組株生產重組蛋白A的方法，該方法是將菌種進行培養發酵使其高效表達重組蛋白A，再收集菌體，經分離純化得到重組蛋白A產品。
本發明上述能表達重組蛋白A的大腸桿菌菌株優先為由含有重組蛋白A基因的表達載體pET32a-P轉化大腸桿菌BL21/DE3得到的菌株，命名為BL21/pET32a。
本發明生產的重組蛋白A表達于大腸桿菌胞周質中，有利于表達產物的分離純化。利用本發明表達生產重組蛋白A，具有表達效率高，表達量大(占細菌可溶性蛋白總量的60-80％)，表達時間短(僅3-5小時)，易于純化等優點。
本發明采用大腸桿菌表達系統生產重組蛋白A，還具有生產周期短(1天)，生產成本低的特點，有利于基因工程重組蛋白A的產業化應用。
本發明的重組蛋白A基因的表達產物重組蛋白A用于與各種不同的層析介質載體如瓊脂糖凝膠、葡聚糖、纖維素、帶羥基的高分子聚合物、硅膠等偶聯成為親和層析介質用于抗體的分離純化。
本發明生產的重組蛋白A具有蛋白結合特異性強，親和力高，純化效率大大改善的優點，與市售的ProteinA Sepharose 4 Fast Flow相比，其動態吸附載量明顯提高。


圖1是本發明構建的重組表達載體pET32a-P，是在載體pET32a中連入proteinA基因。
圖2菌體的SDS-PAGE凝膠電泳結果，其中泳道1和5是marker；泳道2是空載體；泳道3是經誘導的BL21/pET32a的碎菌后的上清；泳道4是經誘導的BL21/pET32a的碎菌后的沉淀。
圖3重組蛋白A瓊脂糖凝膠5S CP從小鼠腹水中分離純化IgG2aSDS-PAGE電泳結果泳道1為標準蛋白Marker，泳道2為腹水，泳道3為本發明的重組蛋白A瓊脂糖凝膠5S CP親和介質的洗脫峰。
圖4重組蛋白A葡聚糖凝膠從小鼠腹水中分離純化IgG2aSDS-PAGE電泳結果泳道1為標準蛋白Marker，泳道2為腹水，泳道3為本發明的重組蛋白A葡聚糖凝膠親和介質所裝的柱子的洗脫峰，泳道3中，上、下兩條帶分別是IgG2a的重鏈和輕鏈。
具體實施例方式
實施例1 重組蛋白A基因單體的合成通過化學合成的方法，設計合成重組蛋白A基因一個重復片段的序列，其序列包括長度為168bp，前端加入與表達載體相連的NcoI酶切位點，6個His(用于親和層析，與鎳柱結合，減少純化步驟)和EK酶切位點，以及用于連入多個重復片段的AccI酶切位點。另外，還包括終止密碼子TAA，及克隆用BamH I限制性內切酶接頭共9bp。還須通過化學合成的方法，設計合成重組蛋白A基因一個重復片段的序列，其序列包括長度為168bp，兩端為AccI酶切位點，用于構建含有多個重復片段的序列。
實施例2 含一個重組蛋白A基因單體的pET32a載體的構建用限制型內切酶NcoI和BamH I將上述重組蛋白A基因單體切下，與經NcoI及BamHI酶切的載體pET32a連接，轉化大腸桿菌，篩選具有氨芐青霉素抗性的轉化子，經質粒提取，酶切鑒定后證明重組蛋白A基因單體已克隆至pET32a中。
實施例3 含有重組蛋白A基因的pET32a-P載體的構建將上述含一個重組蛋白A基因單體的pET32a載體及重組蛋白A基因單體以AccI酶切，回收相應片段后連接，轉化大腸桿菌，篩選具有氨芐青霉素抗性的轉化子，經質粒提取，酶切篩選獲得含有3個蛋白A基因單體的重組蛋白A的pET32a-P載體。
實施例4 表達重組蛋白A的大腸桿菌菌株BL21/pET32a的構建用CaCl2法將pET32a-P轉化BL21/DE3，在含有氨芐青霉素的LB平板上篩選轉化子，經質粒檢測和酶切分析獲得含有pET32a的重組轉化子BL21/pET32a。
實施例5 利用大腸桿菌工程菌BL21/pET32a生產重組蛋白A1)菌種的培養發酵挑取大腸桿菌工程菌BL21/pET32a，接種于LB培養基中，接種量1～2％V/V，于30℃培養過夜，次日在無菌條件下將上述培養好的種子培養基按1∶10-1∶5接種于發酵培養基上，30℃發酵至O.D600達到0.4～0.8，升溫至42℃誘導，3～5小時后離心收菌；取少量細胞加2×上樣緩沖液，按標準做SDS-PAGE凝膠電泳，結果如說明書附圖2，經誘導的BL21/pET32a的碎菌后的上清在20kD的位置出現一條新的蛋白帶(見圖2泳道3)，轉化PET32空載體的BL21/DE3菌和經誘導的BL21/pET32a的碎菌后的沉淀中不出現此帶(見圖2泳道2和4)，證明重組蛋自A已在BL21/pET32a中誘導可溶表達。
2)表達的重組蛋白A的純化將上述收集菌體用NaCl十磷酸鹽緩沖液(pH7.0-8.0)懸浮，超聲破碎，4℃離心，收集上清，得粗提液。
經SDS-PAGE電泳檢測表明，用本法提取表達于大腸桿菌胞周質的重組蛋白A效果很好，粗提后大部分重組蛋白A被粗提，殘存于菌體的量極微將粗提液進行Sephacryl 5200分子篩純化，收集特征峰(第二洗脫峰)即為純化的重組蛋白A，其純度可達90％以上。
實施例6 ELISA方法檢測重組蛋白A與抗體結合活性的試驗1)包被在96孔板中每孔包被重組蛋白A樣品100ul，37℃，1h；2)封閉每孔以100ul的1％的BSA封閉，37℃，1h；3)加一抗每孔加入約100ug人IgG抗體，37℃，1h；4)加二抗每孔加入約100ul 1∶1000辣根過氧化物酶標記抗體，37℃，1h；5)顯色。
經ELISA檢測表明本發明提取的重組蛋白A與人IgG抗體結合活性強，每孔包被4.5ng重組蛋白A即可獲得明顯的檢測信號，結果顯示本發明提供的重組蛋白A可用于抗體的檢測。
實施例7 重組蛋白A瓊脂糖凝膠5S CP的制備1、用環氧氯丙烷、氫氧化鈉與瓊脂糖(5％的交聯瓊脂糖凝膠)在水介質中進行反應，在30-60℃的溫度下反應2-3小時，反應完后用蒸餾水清洗至中性后抽干；2、將上述產物與本發明的重組蛋白A在5-25℃溫度下反應15-20小時，反應完后清洗再抽干，即得到重組蛋白A瓊脂糖凝膠5S CP重組蛋白A瓊脂糖凝膠5S CP具有以下特性1)特點基團脫落少，結合特異性強；2)配基密度≈6mg重組蛋白A/ml；3)吸附載量3～30mg鼠IgG2a/ml；4)親和介質的顆粒大小30-180μm；5)最大流速250cm/h6)pH范圍2-11；7)保存溫度4-8℃；8)保存液體20％乙醇。
如果待分離純化的抗體與親和層析介質間的吸附力比較弱，則可適當提高吸附緩沖液的pH值和鹽濃度，即可獲得較好的分離效果。
實施例8 重組蛋白A瓊脂糖凝膠5S CP從小鼠腹水中分離純化IgG2a1、重組蛋白A瓊脂糖凝膠5S CP裝柱，1.6×20cm，柱床體積為10ml；2、用緩沖液A(20mM磷酸鹽緩沖液，pH7.4，即pH7.4的PBS溶液。配制0.2M NaH2PO419ml，0.2M Na2HPO4 81ml，NaCl 9g加水至1000ml。)平衡5-10個床體積，流速為1ml/min；3、將2ml小鼠腹水用緩0沖液A稀釋到20ml，0.45μm濾膜過濾，上樣。流速為1ml/min；4、用緩沖液A再洗5-10個床體積，流速為1ml/min；5、用緩沖液B(20mM檸檬酸緩沖液，pH4.0。配制檸檬酸2.1g加水950ml，用5MNaOH調至pH4.0，加水至1000ml)洗脫，流速為1ml/min，收集洗脫峰；6、用純水流洗10個柱床體積，再用20％的乙醇流洗10個柱床體積，流速為2ml/min，柱子置于4-8℃環境中保存；7、將分離純化的IgG2a與對照品同時進行SDS-PAGE電泳分析；(柱子每使用幾次后應該用以緩沖液C(0.5M醋酸緩沖液，pH3.0。配制0.5M醋酸溶液用固體NaOH調至pH 3.0)流洗1次，以便將吸附更牢的蛋白去除。)結果SDS-PAGE電泳分析結果見圖3，泳道1為標準蛋白Marker，泳道2為腹水，泳道3為本發明的重組蛋白A瓊脂糖凝膠5S CP親和介質所裝的柱子的洗脫峰。泳道3中，上、下兩條帶分別是IgG2a的重鏈和輕鏈。試驗結果表明了本發明的重組蛋白A瓊脂糖凝膠5S CP親和層析介質一步就可以得到純度大于95％的IgG2a。
實施例9 重組蛋白A葡聚糖凝膠的制備1、用環氧氯丙烷、氫氧化鈉與葡聚糖凝膠在水介質中進行反應，在30-60℃的溫度下反應2-3小時，反應完后用蒸餾水清洗至中性后抽干；2、將上述產物與本發明的重組蛋白A在5-25℃溫度下反應15-20小時，反應完后清洗再抽干，即得到重組蛋白A葡聚糖凝膠。
重組蛋白A葡聚糖凝膠具有以下特性1)特點基團脫落少，結合特異性強；
2)配基密度≈6mg重組蛋白A/ml；3)吸附載量3～30mg鼠IgG2a/ml；4)親和介質的顆粒大小20-130μm；5)最大流速200cm/h6)pH范圍2-11；7)保存溫度4-8℃；8)保存液體20％乙醇。
如果待分離純化的抗體與親和層析介質間的吸附力比較弱，則可適當提高吸附緩沖液的pH值和鹽濃度，即可獲得較好的分離效果。
實施例10 重組蛋白A葡聚糖凝膠從小鼠腹水中分離純化IgG2a1、重組蛋白A葡聚糖凝膠裝柱，1.6×20cm，柱床體積為10ml；2、用緩沖液A(20mM磷酸鹽緩沖液，pH7.4，即pH7.4的PBS溶液。配制0.2M NaH2PO419ml，0.2M Na2HPO4 81ml，NaCl 9g加水至1000ml。)平衡5-10個床體積，流速為1ml/min；3、將2ml小鼠腹水用緩沖液A稀釋到20ml，0.45μm濾膜過濾，上樣。流速為1ml/min；4、用緩沖液A再洗5-10個床體積，流速為1ml/min；5、用緩沖液B(20mM檸檬酸緩沖液，pH4.0。配制檸檬酸2.1g加水950ml，用5M NaOH調至pH4.0，加水至1000ml)洗脫，流速為1ml/min，收集洗脫峰；6、用純水流洗10個柱床體積，再用20％的乙醇流洗10個柱床體積，流速為2ml/min，柱子置于4-8℃環境中保存；7、將分離純化的IgG2a與對照品同時進行SDS-PAGE電泳分析；(柱子每使用幾次后應該用以緩沖液C(0.5M醋酸緩沖液，pH3.0。配制0.5M醋酸溶液用固體NaOH調至pH3.0)流洗1次，以便將吸附更牢的蛋白去除。)結果SDS-PAGE電泳分析結果見圖4，泳道1為標準蛋白Marker，泳道2為腹水，泳道3為本發明的重組蛋白A葡聚糖凝膠親和介質所裝的柱子的洗脫峰。泳道3中，上、下兩條帶分別是IgG2a的重鏈和輕鏈，試驗結果表明了本發明的重組蛋白A葡聚糖凝膠親和層析介質一步就可以得到純度大于95％的IgG2a。
實施例11 重組蛋白A瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝膠及市售ProteinA Sepharose 4Fast Flow對人IgG1動態吸附載量的測定比較1、用緩沖液A(20mM磷酸鹽緩沖液，pH7.4，即pH7.4的PBS溶液。配制0.2M NaH2PO419ml，0.2M Na2HPO481ml，NaCl 9g加水至1000ml。)平衡5-10個床體積，流速為1ml/min；2、已知濃度人IgG1(按中國發明專利01132225.X中公開的實施例得到)上樣，流速為1ml/min，至10％穿透時停止；3、根據樣品濃度、上樣體積及柱體積計算出10％穿透時各凝膠的動態吸附載量。
根據結果(見表1)可以判斷，本專利提供的重組蛋白A瓊脂糖凝膠及重組蛋白A葡聚糖凝膠對人IgG1的動態吸附載量均高于市售ProteinA Sepharose 4 FastFlow。
表1各凝膠IgG1動態吸附載量比較

序列表<110>上海中信國健藥業有限公司<120>一種重組蛋白A基因及其表達產物的制備方法和用途<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>180<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)...(180)<223>重組蛋白A氨基酸序列<400>2Ala Gln His Asp Glu Ala Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln5 10 15Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln20 25 30Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala35 40 45Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys50 55 60Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile65 707580Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln85 90 95Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala100105110Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Val Asp Asn Lys Phe Asn115120 125
Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu130 135 140Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro145 150 155 160Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala165170 175Gln Ala Pro Lys180<210>2<211>621<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)...(621)<223>重組蛋白A基因序列<400>2CCATG GTCAC CATCA CCATC ATCAT GATGA CGATG ACAAG GCGGA CAACA AATTC 60AACAA AGAAC AACAA AACGC GTTCT ATGAG ATCTT ACATT TACCT AACTT AAACG 120AAGAA CAACG AAACG GCTTC ATCCA AAGTT TAAAA GATGA CCCAA GCCAA AGCGC 180TAACC TTTTA GCAGA AGCTA AAAAG CTAAA TGATG CTCAG GCGCC GAAAG CGGAC 240AACAA ATTCA ACAAA GAACA ACAAA ACGCG TTCTA TGAGA TCTTA CATTT ACCTA 300ACTTA AACGA AGAAC AACGA AACGG CTTCA TCCAA AGTTT AAAAG ATGAC CCAAG 360CCAAA GCGCT AACCT TTTAG CAGAA GCTAA AAAGC TAAAT GATGC TCAGG CGCCG 420AAAGC GGACA ACAAA TTCAA CAAAG AACAA CAAAA CGCGT TCTAT GAGAT CTTAC 480ATTTA CCTAA CTTAA ACGAA GAACA ACGAA ACGGC TTCAT CCAAA GTTTA AAAGA 540TGACC CAAGC CAAAG CGCTA ACCTT TTAGC AGAAG CTAAA AAGCT AAATG ATGCT 600CAGGC GCCGA AATAA GGATC C 62權利要求
1.一種重組蛋白A基因，其特征在于，它具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
2.一種重組蛋白A，其特征在于，它具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
3.一種重組表達載體，其特征在于，它含有權利要求1所述的核苷酸序列以及與該序列操作性相連的表達調控序列。
4.根據權利要求3所述的表達載體，其特征在于，所述及的重組表達載體是pET32a-P。
5.一種宿主細胞，其特征在于，它被權利要求3或4所述的表達載體轉化。
6.根據權利要求5所述的宿主細胞，其特征在于，所述及的宿主細胞是大腸桿菌。
7.根據權利要求6所述的宿主細胞，其特征在于，所述及的大腸桿菌是BL21/DE3。
8.一種制備權利要求2所述的重組蛋白A的方法，其特征是，該方法包括a)構建含有重組蛋白A基因的表達載體；b)將步驟a)的表達載體轉入大腸桿菌BL21/DE3；c)在適合條件下培養步驟b)所得到的菌株，誘導表達重組蛋白A；和d)分離純化得到所述重組蛋白A。
9.一種如權利要求2所述的重組蛋白A的用途，其特征是，所述的重組蛋白A用于抗體檢測、分離、純化。
10.一種親和層析介質，其特征在于，所述及的親和層析介質由權利要求2所述的重組蛋白A與層析介質載體組成。
11.根據權利要求10所述的親和層析介質，其特征為，所述的層析介質載體是瓊脂糖凝膠、葡聚糖、纖維素、硅膠或帶羥基的高分子聚合物。
全文摘要
本發明提供了一種重組蛋白A基因，具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列，及由該基因編碼的重組蛋白A。本發明還提供了表達該重組蛋白A基因的重組表達載體PET32a－P，和被它所轉化的的大腸桿菌BL21/DE3，以及制備重組蛋白A的方法。本發明提供的重組蛋白A用于抗體檢測、分離、純化，并能與層析介質載體組成親和層析介質。本發明生產的重組蛋白A具有蛋白結合特異性強，親和力高，純化效率大大改善的優點，與市售的ProteinA Sepharose 4 Fast Flow相比，其動態吸附載量明顯提高。
文檔編號C07K14/31GK101050464SQ200710085148
公開日2007年10月10日 申請日期2007年3月14日 優先權日2006年3月17日
發明者談珉, 胡輝, 郭亞軍 申請人:上海中信國健藥業有限公司