一種耐酸性高溫α?淀粉酶及其基因、工程菌和制備方法
【專利摘要】本發明公開一種耐酸性高溫α?淀粉酶的基因、工程菌及其制備方法，該耐酸性高溫α?淀粉酶在pH4.2?4.6、95℃條件下較文獻報道的突變體熱穩定性增強，并且表達量是現有耐酸性高溫α?淀粉酶的50倍，將該酶應用于化工、食品、醫藥等領域，可以在強酸性和高溫條件下高效降解淀粉，并能簡化工藝、減少環境污染，具有廣闊的應用前景。同時本發明使用的這種結合結構預測的合理設計對于提高工業酶的熱穩定性具有重要指導意義。
【專利說明】
一種耐酸性高溫α-淀粉酶及其基因、工程菌和制備方法
技術領域
[0001] 本發明屬于生物工程領域，涉及基因的定點突變和DNA重組技術，尤其是一種耐酸 性高溫淀粉酶的基因、工程菌及其制備方法。
【背景技術】
[0002] α-淀粉酶在工業生產尤其是淀粉深加工中具有極其重要的作用。淀粉深加工通常 包括液化和糖化兩個步驟。液化時，將濕淀粉顆粒與酶混勻后l〇5°C蒸汽加熱，然后在90°C 水解1-1.5h，液化前將淀粉漿或玉米漿的pH值由自然的pH4.5調到pH5.8-6.2，糖化過程時 再將它降為PH4.2-4.5。而α-淀粉酶的使用受最適溫度及最適反應pH局限。在工業上使用的 主要是來源于芽孢桿菌、耐高溫放線菌屬和高溫單胞菌屬的淀粉酶。目前工業上應用最 廣泛的α-淀粉酶為來自地衣芽孢桿菌的耐高溫α-淀粉酶(BLA)，其作用條件為95°C，ρΗ6.0， 作用過程中需要添加鈣離子以保持其活力及熱穩定性。由于pH的調節需要添加酸堿，最后 還需要除鹽，這些都會增加水蒸氣和成本以及伴隨pH調整不當而產生的副產物，如果使用 耐酸耐高溫的淀粉酶將大大改善這一現狀。
[0003] 因此，國內外許多實驗室均開展了耐酸性高溫α-淀粉酶的研究。早期有1981年摩 爾根從嗜中溫地衣芽孢桿菌中分離得到的一種極耐高溫的α-淀粉酶，其最適pH為6、最適溫 度為90°C，隨后即得到廣泛的應用。運用基因工程手段構建耐酸性高溫α_淀粉酶生產菌是 各國研究者最常用的方法。日本一項專利報道的BLA4480其最適pH為4.0-5.5，最適溫度為 90-110°(：。阻也(*丨118〇11等人研究發現81^突變體]\1151'/!1133￥/附885/^209￥(了￥5￥)在?!15.0， 83°C，5mM CaCl2存在的條件下的半衰期是野生型BLA的23倍;DayAG等人在此突變基礎上又 添加了兩個突變位點S148N和A379S，得到的突變體(TYNSVS)被證明在pH4.85,83°C條件下 半衰期比TYSV提高了2倍。Mischa Machius等人在2003年發表的文章中介紹，在BLA中引入 H133I/N190F/A209V/Q264S/N265Y五個位點突變，使得突變體的失活溫度較野生型升高13 。(:并且在85°C的半失活時間較野生型BLA增加32倍。在2003年，Nathalie Declerck等人在 BLA 中引入 H133I/H156Y/A181T/N190F/A209V/Q264S/N265Y 七個位點突變，與野生型相比， 其半失活溫度升高了23°C、在85°C失活時間增加了 100倍以上。Manuel Heriberto Rivera 等人發現：引入V286Y單點突變使得突變體水解淀粉的活力較野生型提高5倍。國內也有學 者對耐酸性及耐高溫α-淀粉酶開展了研究，但是獲得的α-淀粉酶仍不能兼具耐熱和耐酸的 特性，不能滿足淀粉深加工工業的要求，因此需要開發一種在低pH和高溫條件下具有高穩 定性的耐酸性高溫α-淀粉酶以滿足淀粉工業條件要求。

【發明內容】

[0004] 本發明提供一種耐酸性高溫α_淀粉酶的基因、工程菌，具有良好的熱穩定性，在 ρΗ4.2-4.6，95°C下保溫120min殘余活力仍保持在100% ;同時該耐酸性高溫α-淀粉酶的表 達量較已知報道中其他耐酸性高溫α-淀粉酶高。
[0005] 本發明進一步公開了一種耐酸性高溫α-淀粉酶的基因、工程菌的制備方法，滿足 淀粉深加工工業需求的耐酸性高溫α-淀粉酶及其基因、工程菌的制備。
[0006] 本發明所述的一種耐酸性高溫α-淀粉酶基因，其基因序列見如SEQ no. 1。
[0007] 本發明所述的一種耐酸性高溫α-淀粉酶工程菌，含有如權利要求1所述的耐酸性 高溫淀粉酶基因。
[0008] 而且，所述工程菌的宿主細胞為短小芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌。
[0009] 而且，所述工程菌為胞外蛋白酶缺失的短小芽孢桿菌Brevibacillus choshinensis sp3
[0010] 而且，所述工程菌中的表達載體為PNY326。
[0011] 本發明所述的一種耐酸性高溫α-淀粉酶，具有權利要求1所述的基因編碼的蛋白 序列。
[0012] 而且，所述的耐酸性高溫α-淀粉酶在ΡΗ4.2-4.6，95°C條件下具有高的熱穩定性。
[0013] 而且，所述的耐酸性高溫α-淀粉酶在工程菌中表達量高。
[0014] 本發明所述的一種耐酸性高溫α-淀粉酶的制備方法，其特征在于:步驟如下：
[0015] 1)出發序列為耐高溫α-淀粉酶(BLA)基因；所述BLA基因序列見如SEQ ηο·2;
[0016] 2)根據文獻報道的BLA突變位點，構建了五個具有耐酸耐高溫特性的BLA突變體：
[0017] BLA-L134R/S320A(簡寫為 BLA-4480)、
[0018] BLA-M15T/H133Y/L134R/N188S/A209V/S320A(簡寫為BLA-m6)、
[0019] BLA-M15T/H133Y/L134R/S148N/N188S/A209V/S320A/A379S(簡寫為 BLA-m8)、
[0020] BLA-H133I/L134R/H156Y/A181T/N190F/A209V/Q264S/N265Y/S320A(簡寫為 BLA-m7)、
[0021] BLA-H133I/L134R/H156Y/A181T/N190F/A209V/Q264S/N265Y/S320A(簡寫為 BLA-m9)；
[0022] 3)分別對這五個BLA突變體進行表達純化，測定其在pH4.5條件下的熱穩定性；
[0023] 4)利用SWISS-MODEL軟件對上述五個BLA突變體及耐高溫α-淀粉酶進行結構模 擬，獲得其空間結構，對其進行結構分析和動力學模擬分析；
[0024] 5)通過對淀粉酶結構分析、分子動力學模擬分析及熱穩定性分析結果，確定構建 耐酸性高溫α_淀粉酶基因的突變位點；
[0025] 6)設計突變引物，將BLA基因進行定點突變，突變位點為權利要求10(5)所述位點， 獲得耐酸性高溫淀粉酶基因；
[0026] 7)將上述耐酸性高溫α-淀粉酶基因與表達載體ΡΝΥ326連接、構建獲得帶有耐酸性 高溫淀粉酶基因的重組載體；
[0027] 8)將含有耐酸性高溫α_淀粉酶基因的重組載體轉化入宿主菌株短小芽孢桿菌中， 構建獲得重組菌株；
[0028] 9)將重組菌株進行分泌表達，獲得耐酸性高溫α-淀粉酶；
[0029] 10)對耐高溫α-淀粉酶及耐酸性高溫α-淀粉酶的酶學性質和熱穩定性進行分析驗 證。
[0030] 本發明的積極效果如下：提供了一種新的耐酸性高溫α-淀粉酶基因、工程菌及耐 酸性高溫α-淀粉酶，該耐酸性高溫α-淀粉酶在ΡΗ4.2-4.6、95°C條件下較文獻報道的突變體 熱穩定性增強，并且表達量是現有耐酸性高溫α-淀粉酶的50倍，將該酶應用于化工、食品、 醫藥等領域，可以在強酸性和高溫條件下高效降解淀粉，并能簡化工藝、減少環境污染，具 有廣闊的應用前景。同時本發明使用的這種結合結構預測的合理設計對于提高工業酶的熱 穩定性具有重要指導意義。
【附圖說明】
[0031] 圖1:ρΝΥ326載體質粒圖譜；
[0032]圖2 :BLA的3D空間結構及突變位點示意圖；
[0033]圖3:突變前后，淀粉酶熱穩定性變化趨勢。
【具體實施方式】
[0034]為了便于理解本發明，特例舉以下實施例。其作用被理解為是對本發明的闡釋而 非對本發明的任何形式的限制。
[0035] 實施例1:
[0036]耐酸性高溫α-淀粉酶基因的構建 [0037] 1、BLA突變體的構建
[0038]根據文獻報道的BLA突變位點，設計相應的定點突變引物(表1 )，以BLA為出發序 列，采用全質粒PCR的方法構建五個BLA突變體，將這五種突變體在同一表達載體。同一宿 主細胞中進行表達，獲得五種突變耐酸性高溫淀粉酶；
[0039] 2、BLA突變體的酶學性質測定及分析
[0040] 根據酶學性質分析發現，BLA_m9和BLA_m6在ρΗ4.5的條件下熱穩定性最好，BLA_m9 在pH4.0-5.0的范圍內具有較高比活力，耐酸性好；
[00411 3、BLA突變體的結構分析
[0042] 通過SWISS-MODEL對BLA的五個突變體進行同源建模，構建了 BLA-4480、BLA-m6、 BLA-m7、BLA-m8、BLA-m9的模型，BLA的三級結構以及選擇的突變位點如圖2所示。將兩個最 優穩定性的突變體的突變位點進行組很可能產生協同作用從而獲得酸性條件下熱穩定性 最佳的突變體，分別構建突變體BLA-m9-M15T、BLA-m9-N188S和BLA-m9-M15T/N188S的結構 模型，發現三個突變體的分子內氫鍵總數較BLA-m9都有所增加，這預示著蛋白整體穩定性 的提高;分子動力學模擬結果顯示BLA-m9-M15T在300K和370K的RMSD差值較BLA-m9小，同樣 預示著其在高溫下的結構穩定性；
[0043] 4、耐酸性高溫α-淀粉酶的突變位點的確立
[0044] 通過對BLA突變體的結構分析結合pH4.5、95°C條件下的熱穩定性分析，確定了以 BLA-m9為模板的耐酸性高溫α-淀粉酶的兩個突變位點M15T和N188S(突變組合BLA-M15T/ H133I/L134R/H156Y/A181T/N190F/A209V/Q264S/N265Y/S320A、BLA-H133I/L134R/H156Y/ A181T/N188S/N190F/A209V/Q264S/N265Y/S320A和BLA-M15T/H133I/L134R/H156Y/A181T/ N188S/N190F/A209V/Q264S/N265Y/S320A)；
[0045] 5、耐酸性高溫α-淀粉酶基因的構建
[0046] 根據確定的耐酸性高溫α-淀粉酶的突變位點，根據BLA-m9的基因序列，設計相應 的定點突變引物(表1);
[0047] 采用pfu酶利用全質粒PCR的方法對BLA-m9進行突變，獲得BLA-m9-M15T，BLA-m9- N188S，BLA-m9-M15T/N188S三個突變體的PCR產物;將全質粒PCR產物用Dpn I進行模板消 化;將消化掉模板后的全質粒PCR產物，電轉入短小芽孢桿菌感受態細胞中，擴培增幅獲得 含有耐酸性高溫淀粉酶基因的質粒。
[0048] 實施例2:
[0049] 耐酸性高溫α-淀粉酶工程菌的制備
[0050] 1.構建重組表達質粒
[00511將突變質粒上的目的片段用Pst I和Hind III進行雙酶切，酶切反應體系：10yL質 粒+lyL Pst I+lyL Hind III+10yL buffer+15yL ddH20,反應條件：37°C，3h;將酶切目的 片段用膠回收試劑盒進行純化回收；
[0052] 將pNY326載體質粒（圖1)用Pst I和Hind III進行雙酶切和去磷酸化處理，酶切反 應體系：10yL質粒+lyL Pst I+lyL Hind III+10yL buffer+15yL ddH20,反應條件：37°C， 3h; pNY酶切片段用堿性磷酸酶(CIAP)進行磷酸化處理，反應體系：20yL雙酶切反應液+2yL CIAP+3yL buffer+5yL ddH20，反應條件：37°C，3h;將磷酸化處理后的pNY酶切片段用膠回 收試劑盒進行純化回收；
[0053]將膠回收后的目的片段和的PNY326片段進行連接，方法如下：目的片段膠回收產 物3yL、載體膠回收產物2yL、solution I lyL依次混勻，4°C過夜連接；
[0054]將連接產物轉化進入短小芽孢桿菌感受態細胞，按下述方法進行操作：
[0055] ①準備100yL感受態細胞與5yL質粒DNA(約100ng)冰浴，將質粒加至感受態中輕柔 混勻;將混合液加入到1mm冰浴預冷的電擊杯中，冰浴1 〇min;設置參數1400V、5ms進行電擊； [0056] ②電擊后迅速轉移入lmL MT培養基充分混勻，于30°C，150rpm培養3h;取100yL細 胞培養液涂布于淀粉MTNm平板，剩余培養液5000rpm離心10min后棄掉部分上清，留約100yL 液體重懸后涂布于淀粉MTNm平板;平板37 °C恒溫倒置培養過夜；
[0057]③挑取帶透明圈的單菌落，獲得耐酸性高溫α-淀粉酶重組菌株，即為耐酸性高溫 α_淀粉酶工程菌。
[0058] 實施例3:
[0059]耐酸性高溫α-淀粉酶的制備
[0060] 按照下述方法表達純化耐酸性高溫α-淀粉酶:將耐酸性高溫α-淀粉酶重組菌株接 種于20mLMTNm培養基中，37 °C，180rpm恒溫振蕩培養約12h，至0D600為1.0獲得種子液;將種 子液以2%的接種量接種于含2L的TMNm培養基的5L發酵罐中，恒溫30°C，轉速200rpm培養 72h，通氣量為lOvvm;發酵過程中實時監測pH值，自動補充酸堿維持培養液pH值在6.86左 右;培養72h后離心取上清液即為粗酶液;將粗酶液進行純化制備獲得電泳純的耐酸性高溫 α_淀粉酶；
[0061] 表 1
[0062]
[0063]
[0064] 檢測例1:
[0065] 實施例3制備的耐酸性高溫α-淀粉酶的表達量測定
[0066]同時構建了該耐酸性高溫α-淀粉酶與日本專利描述的BLA-4480描述的耐酸性高 溫淀粉酶，將二者在同一研究條件下進行表達、純化，將純化獲得的蛋白適當稀釋后用 BCA試劑盒進行蛋白含量測定。該耐酸性高溫α-淀粉酶的表達量(2g/L)是日本專利BLA-4480中描述耐酸性高溫α-淀粉酶突變體(40mg/L)的50倍。
[0067] 檢測例2:
[0068]實施例3制備的耐酸性高溫α-淀粉酶酶活力測定 [0069] (1)反應體系：
[0070] 酶反應底物為0.2 %可溶性淀粉，終止反應液為0.5Μ鹽酸，顯色溶液為稀碘液 (10mM hand 10mM ΚΙ)，吸收波長定位595nm。
[0071] (2)標準曲線繪制：
[0072] 分別取淀粉溶液0、2、4、6、8、10、15、20、25、30、35、40、45、5(^1^，1^水補至5(^1^加 入緩沖溶液50yL混勻，放入50°C水浴，同時開始計時；30min后取出加入50yL的0.4M HC1終 止反應;加入50yL稀碘液顯色；分別取160yL至96孔板中，用酶標儀在595nm下測吸光度值； 以A595對淀粉毫克數制作標準曲線。
[0073] (3)酶活測定步驟：
[0074] 將純化后的酶液用緩沖溶液稀釋至合適濃度;取稀釋酶液50yL，加入淀粉溶液50μ L混勻，放入50°C水浴，同時開始計時；30min后取出加入50yL的0.4Μ HC1終止反應;加入50μ L稀碘液顯色;分別取160yL至96孔板中，用酶標儀在595nm下測吸光度值。
[0075] (4)酶活計算
[0076] 酶活力定義:單位時間內單位體積酶液水解淀粉的毫克數定義為一個酶活單位U
[0077] 酶活力U/mL= (A595對照-A595測量)/斜率/30min/0 · 05mL*稀釋倍數 [0078]比活力U/mg =酶活/蛋白濃度
[0079] 檢測例2:
[0080] 實施例3制備的耐酸性高溫α-淀粉酶酶學性質分析
[0081 ] (1)溫度對酶活力的影響：
[0082]純化后的酶液分別用pH為4.5的檸檬酸-磷酸氫二鈉(200mM)緩沖溶液稀釋到合適 濃度。在不同溫度（40、50、60、70、80、90°〇水浴鍋中反應測定酶活力，將最高活力定為 100 %計算相對活力。
[0083] BLA-m9-M15T的最適溫度較BLA的50°C升高到70°C。
[0084] (2)pH對酶活力的影響：
[0085] 純化后的酶液分別用不同？!1(4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)的檸檬 酸-磷酸氫二鈉(200mM)緩沖溶液稀釋到合適濃度，在50°C水浴鍋中反應測定酶活力，將最 高活力定為100 %計算相對活力。
[0086] BLA的最適pH為7 · 5,而BLA-m9-M15T最適pH降低為4.5。
[0087] (3)pH4.5條件下熱穩定性的測定：
[0088]純化后的酶液分別用pH為4.5的檸檬酸-磷酸氫二鈉(200mM)緩沖溶液稀釋到合適 濃度，酶稀釋液中加入終濃度為10%的糊精。將稀釋后酶液分別放入95°c水浴鍋水浴0、5、 10、20、30、40、60、80、100、12011^11，到時間后迅速取出、冰浴，各自測定其殘余酶活力。以熱 處理Omin為100%，計算相對活力，以相對活力對時間作圖。
[0089] 結果如圖3所示，耐高溫α-淀粉酶BLA在pH4.5，95 °C條件下保溫5min剩余16 %的殘 余活力，保溫120min僅保持1 %的殘余活力，BLA-m6和BLA-m9在相同條件下保溫120min保持 60%的殘余活力；而制備的三個組合突變體中，穩定性最好的組合突變體BLA-M15T/H133I/ L134A/H156Y/A181T/N190F/A209V/Q264S/N265Y/S320A 在 pH4.5,95°C 條件下保溫 120min 仍 能保持100%的殘余活力，另外兩個突變體在相同條件下保溫120min后能保持大約90%的 剩余活力，達到了在酸性條件下保持高熱穩定性的目的，穩定性最好的組合突變體：
[0090] BLA-M15T/H133I/L134A/H156Y/A181T/N190F/A209V/Q264S/N265Y/S320ASP 為權 利要求書中要保護的耐酸性高溫淀粉酶。
[0091] 由此說明，BLA 基因經 M15T/H133I/L134A/H156Y/A181T/N190F/A209V/Q264S/ N265Y/S320A位點突變后，構建獲得耐酸性高溫α-淀粉酶基因，經克隆、酶切、連接到載體 ρΝΥ上，轉化入胞外蛋白酶缺失的短小芽孢桿菌中，實現耐酸性高溫α-淀粉酶的高分泌表 達，成功制備獲得一種耐酸性高溫淀粉酶，其在酸性條件下的熱穩定性極高，可以滿足一 定條件的工業需求。
【主權項】
1. 一種耐酸性高溫α-淀粉酶基因，其基因序列如SEQ no. 1。2. 如權利要求1所述的耐酸性高溫α-淀粉酶基因的制備方法，其特征在于：以耐高溫α-淀粉酶基因為出發序列，進行如下位點突變： M15T/H133I/L134A/H156Y/A181T/N190F/A209V/ Q264S/N265Y/S320A得到的突變基 因。3. -種耐酸性高溫α_淀粉酶的工程菌，其特征在于:含有權利要求1所述的耐酸性高溫 淀粉酶基因。4. 如權利要求3所述的工程菌，其特征在于:所述工程菌的宿主細胞為短小芽孢桿菌或 地衣芽孢桿菌。5. 如權利要求3所述的工程菌，其特征在于:所述工程菌為胞外蛋白酶缺失的短小芽 fSIf iSl5-Tevibacillus choshinensis6. 如權利要求3所述的工程菌，其特征在于:所述工程菌中的表達載體為pNY326。7. -種耐酸性高溫α-淀粉酶，其特征在于：具有權利要求1所述的基因編碼的蛋白序 列。8. 如權利要求7所述的耐酸性高溫α-淀粉酶，其特征在于:所述α-淀粉酶在ρΗ4.2-4.6， 95°C條件下具有高的熱穩定性。9. 如權利要求7所述的耐酸性高溫α-淀粉酶，其特征在于:所述α-淀粉酶在權利要求3 所述的工程菌中表達量高。10. 如權利要求7所述的耐酸性高溫α-淀粉酶的制備方法，其特征在于:步驟如下： 1)出發序列為耐高溫淀粉酶基因；其基因序列見如SEQ no.2; 2 )構建了五個耐酸性耐高溫的BLA(地衣芽孢桿菌來源的耐高溫α-淀粉酶)突變體： BLA-L134R/S320A； BLA-M15T/H133Y/L134R/N188S/A209V/S320A； BLA-M15T/H133Y/L134R/S148N/N188S/A209V/S320A/A379S； BLA-H133I/L134R /H156Y/A181T/N190F/A209V/Q264S/N265Y/S320A； BLA-H133I/L134R /H156Y/A181T/N190F/A209V/Q264S/N265Y/S320A； 3) 分別對這五個BLA突變體進行表達純化，測定其在ρΗ4.5條件下的熱穩定性； 4) 利用SWISS-MODEL軟件對上述五個BLA突變體及耐高溫α-淀粉酶進行結構模擬，獲得 其空間結構，對其進行結構分析和動力學模擬分析； 5) 通過對淀粉酶結構分析、分子動力學模擬分析及熱穩定性分析結果，確定構建耐酸 性高溫α-淀粉酶基因的突變位點； 6) 設計突變引物見表1，將BLA基因進行定點突變，突變位點步驟5)所述位點，獲得耐酸 性高溫α-淀粉酶基因； 7) 將上述耐酸性高溫α-淀粉酶基因與表達載體ΡΝΥ326連接、構建獲得帶有耐酸性高溫 α_淀粉酶基因的重組載體； 8) 將含有耐酸性高溫α-淀粉酶基因的重組載體轉化入宿主菌株短小芽孢桿菌中，構建 獲得重組菌株； 9 )將重組菌株進行分泌表達，獲得耐酸性高溫α-淀粉酶。
【文檔編號】C12N1/21GK106086048SQ201610670173
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年8月16日 公開號201610670173.3, CN 106086048 A, CN 106086048A, CN 201610670173, CN-A-106086048, CN106086048 A, CN106086048A, CN201610670173, CN201610670173.3
【發明人】謝秋宏, 師瑞琳, 相宏宇, 劉玲
【申請人】吉林大學