愛格氏菌、s-雌馬酚產生工程菌及其構建方法和應用
【專利摘要】本發明公開了一種愛格氏菌、S?雌馬酚產生工程菌及其構建方法和應用，涉及微生物技術領域。愛格氏菌HAU?JLC44，保藏號為CGMCC No.12354。S?雌馬酚產生工程菌的構建方法為：從愛格氏菌HAU?JLC44中克隆參與雌馬酚合成的三個轉化酶基因：E?dgr、E?dhdr和E?thdr；將E?dhdr、E?thdr和這兩個基因中間的145 bp非編碼區序列按一個基因克隆下來，稱為E?tdhdr；將E?dgr和E?tdhdr克隆至pETDuet?1上，在BL21(DE3)中表達，獲得工程菌。本發明使用共表達三個基因的大腸桿菌工程菌將底物黃豆苷原或黃豆素轉化為S?雌馬酚，轉化性能穩定，方法簡單。CGMCC No.15CGMCC No.15
【專利說明】
愛格氏菌、S-雌馬酚產生工程菌及其構建方法和應用
技術領域
[0001 ]本發明涉及微生物技術領域。
【背景技術】
[0002]大豆異黃酮(Soy isoflavones)是大豆等豆科植物在其生長過程中生成的一類次生代謝產物，其中染料木素(Genistein)、黃豆苷原(Daidzein)為大豆異黃酮主要游離型苷元。大豆異黃酮具有抗氧化、抗癌、減少骨質疏松、減輕心腦血管發病率等多種生理功能。體內及體外試驗結果表明，被人體或其他動物攝入體內的大豆異黃酮將被寄居在胃腸道的微生物菌群代謝為各種不同代謝產物。大量研究結果證實，雌馬酚的類雌激素、抗氧化、預防骨質疏松、抗癌(如乳腺癌和前列腺癌)等生物活性均顯著高于大豆異黃酮本身或大豆異黃酮的其他微生物轉化產物。
[0003]雌馬酚化學名稱為7-羥基-3-(4-羥苯基)_苯并二氫吡喃，屬異黃酮類非類固醇雌激素。然而，雌馬酚在自然界中并不存在，只能通過化學氫轉移或微生物生物轉化法進行合成。值得一提的是，雌馬酚為手性化合物，通過化學方法合成的雌馬酚為R-和S-兩種對映異構體等量共存的外消旋體，而通過微生物轉化法合成的雌馬酚則全部為S-雌馬酚(Wang etal, 2005)，之后美國營養學家Setchell研究小組也證實人體內的雌馬酚全部為S-雌馬酚(Setchell et al，2005)。有關R-雌馬酚是否會對人體產生副作用目前尚不清楚，但可以肯定的是，S-雌馬酚對人體和其他動物起重要的有益調節作用。此外，人工合成外消旋體雌馬酚時需要價格昂貴的化學催化劑鈀，因而利用微生物轉化法合成S-型雌馬酚顯得尤為重要。迄今國內外報道了一系列能將底物黃豆苷原或二氫黃豆苷原轉化為雌馬酚的細菌菌株，但絕大部分菌株為嚴格厭氧細菌菌株。本實驗室曾從雞新鮮糞樣中分離得到一株能將底物染料木素轉化為左旋-5-0H-雌馬酚的嚴格厭氧菌株Slackia sp.AUH-JLC159(ZL201310043107.X)，但該菌株的轉接和培養均必須在嚴格厭氧條件下完成。2007年日本學者Uchiyama等報道了一株兼性厭氧乳酸菌20-92，菌株20-92既能在無氧條件下生長也能在有氧條件下生長，但只能在厭氧條件下才能將底物黃豆苷原轉化為S-雌馬酚。2010至2012年，日本學者從乳酸菌20-92中克隆了參與雌馬酚合成的功能基因1-dznr，1-dhdrJ-thdr和1-ddrc，并證明工程菌的粗酶液能夠將底物黃豆苷原轉化為雌馬酚。專利CN104031875A公布了一種S-雌馬酚產生工程菌，該工程菌含有兩個質粒(雙質粒系統)，每個質粒上分別攜帶2個參與雌馬酸合成的基因(即質粒I為Ι-ddrc和Ι-dznr;質粒2為1-dhdr和1-thdr)，功能基因是完全根據已報道的20-92中的功能基因進行人工合成的。
[0004]基因共表達包括多質粒共表達系統和單質粒共表達系統。多質粒共表達系統既要考慮表達質粒的相容性，又要考慮因質粒丟失而影響工程菌應用。

【發明內容】

[0005]本發明要解決的技術問題是提供一種愛格氏菌、S-雌馬酚產生工程菌及其構建方法和應用，用于制備S-雌馬酚，工藝簡便；S-雌馬酚產生工程菌發酵簡單、使用方便、體系穩定，具有潛在的產業化價值；S-雌馬酚產生工程菌在S-雌馬酚合成過程使用重組大腸桿菌S-雌馬酚產生工程菌全細胞進行轉化，并且可以在有氧條件下完成轉化過程，生產過程無高溫高壓反應，無有毒化學品，適合工業化生產。
[000?]本發明的目的在于提供一種愛格氏菌(Eggerthella sp.)HAU_JLC44，保藏號為CGMCC N0.12354。
[0007]本發明的另一目的在于提供一種愛格氏菌HAU-JLC44在S-雌馬酚合成中的應用:愛格氏菌HAU-JLC44在厭氧條件下將底物黃豆苷原轉化為S-雌馬酚。
[0008]本發明第三個目的在于提供一種愛格氏菌HAU-JLC44在S-雌馬酚合成中的另一種應用:用愛格氏菌HAU-JLC44基因組DNA作模板，克隆雌馬酚生物合成基因，構建S-雌馬酚產生工程菌，并用S-雌馬酚產生工程菌合成S-雌馬酚。
[0009]本發明第四個目的在于提供一種S-雌馬酚產生工程菌:S-雌馬酚產生工程菌為大腸桿菌(Escherichia coli)，是用愛格氏菌HAU-JLC44的基因組DNA作模板，克隆雌馬酚生物合成基因，構建而成，命名為S-雌馬酚產生工程菌HAU-JLC44，保藏號為CGMCC N0.12353。
[0010]本發明中的愛格氏菌(Eggerthel la sp.)HAU_幾C44、S-雌馬酚產生工程菌HAU-幾044已于2016年04月15日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)保藏，保藏號分別為CGMCC N0.12354,CGMCC N0.12353。中國科學院微生物研究所菌種保藏中心地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號。
[0011]本發明第五個目的在于提供一種S-雌馬酚產生工程菌的構建方法，包括如下步驟:
(I)從如權利要求1所述的愛格氏菌HAU-JLC44中克隆參與雌馬酚合成的三個轉化酶基因:黃豆苷原還原酶E-dgr、二氫黃豆苷原還原酶E-dhdr和四氫黃豆苷原還原酶E-thdr(即將黃豆苷原還原為二氫黃豆苷原的E-dgr;將二氫黃豆苷原還原為四氫黃豆苷原的E-dhdr;將四氫黃豆苷原轉化為雌馬酸的E-thdr)；所述E-dgr、E_dhdr和E-thdr的核苷酸序列如SEQ.1D.N0:1、SEQ.1D.NO:2和SEQ.1D.NO:3所示；基因E-dhdr和E-thdr之間有145 bp非編碼區核苷酸序列，將基因E-dhdr、基因E-thdr和這兩個基因中間的145 bp非編碼區序列按一個基因克隆下來，將其命名為整合基因E-tdhdr，整合基因E-tdhdr含有兩個開放讀碼框，所述整合基因E-tdhdr的核苷酸序列如SEQ.1D.NO:4所示;整合基因E-tdhdr與基因E-tdhdr為相同序列，本發明中將整合基因E-tdhdr簡稱為基因E-tdhdr或E-tdhdr;
(2 )提取愛格氏菌HAU-JLC44的基因組DNA，設計引物將E_dgr和E-tdhdr兩個基因用PCR法擴增下來，在基因E-dgr的N端和C端分別加上Bgl II和Kpn I酶切位點，在整合基因E-tdhdr的N端和C端分別加上BamH I和Hind ΙΠ酶切位點；
(3)將帶有BglII和Kpn I酶切位點的基因E_dgr，克隆至用Bgl II和Kpn I酶切過的T7雙啟動子共表達質粒pETDuet-Ι上，得到重組質粒pETDuet-1-dgr;
(4)將帶有BamHI和Hind III酶切位點的整合基因E-tdhdr，克隆至用BamH I和HindΠI酶切過的重組質粒pETDuet-l-dgr上，得到重組質粒pETDuet-l-dgr-tdhd;r;
(5)將重組質粒pETDuet-1-dgr-tdhdr轉入大腸桿菌Trans109，得克隆菌，送測序公司進行測序；
(6)將重組質粒pETDuet-1-dgr-tdhdr從測序正確的克隆菌中提取出來，轉化大腸桿菌BL2UDE3)，獲得S-雌馬酚產生工程菌。
[0012]優選的，S-雌馬酚產生工程菌的構建方法:步驟(2)中擴增E-tdhdr和E-dgr兩個基因設計的引物的序列如下:引物I的上、下游序列如SEQ.1D.N0:5和SEQ.1D.N0:6所示;引物2的上、下游序列如SEQ.1D.N0:7和SEQ.1D.N0:8所示。
[0013]本發明第六個目的在于提供一種S-雌馬酚產生工程菌在S-雌馬酚合成中的應用，包括以下步驟:
a、S_雌馬酚產生工程菌的種子液制備；
b、催化底物黃豆苷原轉化生成S-雌馬酚；
C、催化豆粉浸液中的黃豆素轉化生成S-雌馬酚。
[0014]優選的，S-雌馬酚產生工程菌在S-雌馬酚合成中的應用，步驟a包括以下步驟:使用LB液體培養基，加入終濃度為100 yg/mL的氨芐青霉素，搖床轉數為120 rpm，37 0C培養12h后，獲得種子液，用于接種。
[0015]優選的，S-雌馬酚產生工程菌在S-雌馬酚合成中的應用，步驟b包括以下步驟:取LB固體培養基粉末2.5 g，用100 mL pH值為6.5的PBS緩沖液溶解，分裝成2 mL/管，121°C高溫高壓滅菌15 min，得到培養基I，待用；將步驟a中的種子液以體積濃度10%的接種量接種到培養基I中，同時加入終濃度為100 yg/mL的氨芐青霉素，搖床轉數為120 rpm，37°C培養10 h后，加入山梨醇至終濃度為1.0% w/v、加入檸檬酸至終濃度為2 g/L和加入100 mg/L的底物黃豆苷原，繼續培養2 h后，加入氯霉素至終濃度為85 yg/mL，37°C繼續培養48 h后，通過高效液相色譜HPLC檢測S-雌馬酚的生成量。
[0016]優選的，S-雌馬酚產生工程菌在S-雌馬酚合成中的應用，步驟c包括以下步驟:向100 mL蒸餾水中加入黃豆粉1.5 g，80 °C水浴I h，冰箱中靜置過夜，取出上清液即為豆粉浸液，加入pH值為7.0的磷酸緩沖鹽，S卩22.21 g/LNa2HP04和5.93 g/L NaH2PO4,完全溶解后分裝成2 mL/管；115 °C下滅菌15 min后加入過濾除菌的乳糖或山梨醇至終濃度為1.0% w/V，得培養基2;將步驟a中的種子液以體積濃度10%的接種量接種到培養基2中，同時加入終濃度為100 yg/mL的氨芐青霉素，搖床轉數為120 rpm，37°C培養72 h后，通過高效液相色譜HPLC檢測S-雌馬酚的生成量。
[0017]高效液相色譜法(HPLC)檢測工程菌對底物的轉化情況，包括以下步驟:(I)取轉化液100 μ?，加入500 μ?乙酸乙酯充分震蕩混勻。
[0018](2)常溫8000 rpm離心 10 min，取400 μ?上清液。
[0019](3)將400 yl上清液在真空旋轉蒸發儀中蒸干，加入80 yl無水甲醇溶解，并過孔徑為0.45 μπι的有機膜后備用。
[0020](4)質譜及手性高效液相色譜檢測。
[0021]全波長掃描儀、質譜儀和手性高效液相檢測工程菌轉化后生成產物的紫外吸收圖譜、分子量和絕對立體構型。
[0022]采用美國SCIEX公司生產的ESI源4000 QTRAP LC/MS/MS SYSTEM陽離子阱質譜儀測定產物的分子量。
[0023]手性高效液相條件-----美國Waters公司，1525型雙栗，2487UV檢測器;色譜柱:
Sumi Chiral 0A-7000手性分析柱(5μηι，250 mm x 4.6 mm);流動相:40%乙臆-60% KH2PO4溶液(20 mM);檢測波長:280 nm;流速:1.0 mL/min;進樣量:20 μ?ο
[0024]本實驗室從雞新鮮糞樣中分離得到一株能將底物黃豆苷原轉化為左旋-S-雌馬酚的嚴格厭氧愛格氏菌屬菌株Eggerthe I la sp.HAU-幾C44。以愛格氏菌HAU-幾C44基因組DNA為模板，克隆參與雌馬酚生物合成的黃豆苷原還原酶(E-dgr)、二氫黃豆苷原還原酶(E-dhdr)和四氫黃豆苷原還原酶(E-thdr)基因，并將基因E-dgr、E_dhdr和E-thdr整合，將三個不同功能的基因在同一個質粒上進行共表達，實現了 S-雌馬酚的有氧生物合成。基因共表達包括多質粒共表達系統和單質粒共表達系統。多質粒共表達系統既要考慮表達質粒的相容性，又要考慮因質粒丟失而影響工程菌應用。因此，單質粒共表達體系更具有研究和應用價值。
[0025]本發明S-雌馬酚產生工程菌的構建方法，使用的質粒為T7雙啟動子共表達質粒pETDuet-Ι，該質粒能夠保證克隆到該質粒上面的兩個基因擁有各自獨立的T7啟動子，在工程菌中通過T7RNA聚合酶啟動轉錄。本發明將來源于愛格氏菌屬的菌株HAU-JLC44(Eggerthella sp.)的三個轉化酶基因(E_dgr、E_dhdr和E-thdr)從菌株HAU-JLC44的基因組DNA上擴增出來，需指出的是，本發明是將E-dhdr和E-thdr—起擴增出來，作為一個整合基因(E-tdhdr)，然后再將第一個酶基因E-dgr和整合基因E-tdhdr克隆到質粒pETDuet-1中，導入大腸桿菌BL2UDE3)，得到產S-雌馬酚的大腸桿菌工程菌。
[0026]采用上述技術方案所產生的有益效果在于:
(I)本發明提供一種發酵簡單、使用方便、體系穩定的S-雌馬酚產生工程菌，具有潛在的產業化價值。利用T7啟動子使S-雌馬酚三個合成酶基因同時在大腸桿菌中串聯異源表達，將底物黃豆苷原和黃豆素轉化成S-雌馬酚。
[0027](2)S_雌馬酚產生工程菌在S-雌馬酚合成過程使用重組大腸桿菌S-雌馬酚產生工程菌全細胞進行轉化，并且可以在有氧條件下完成轉化過程。生產過程無高溫高壓反應，無有毒化學品。
[0028](3)S-雌馬酚產生工程菌能夠轉化100 mg/L的黃豆苷原生成34.30 mg/L的二氫黃豆苷原和34.27 mg/L的S-雌馬酚，S-雌馬酚轉化率高達49.48%，有工業化潛力。
【附圖說明】
[0029]下面結合附圖對本發明作進一步詳細的說明；
圖1為重組質粒pETDuet-1-dgr-tdhdr的圖譜；
圖2 A為S-雌馬酚產生工程菌酶切鑒定結果圖；
圖2 B為S-雌馬酚產生工程菌蛋白電泳結果圖；
其中圖2A是將工程菌質粒和空載體分別使用BamH I和Hind III雙酶切(泳道I和4)、Bgl II和Kpn I雙酶切(泳道2和5)、Bgl 11,Kpn 1.BamH I和Hind III四酶切(泳道3和6);圖2B是對照菌E.coli BL21/pETDuet-l全蛋白(泳道I)和S-雌馬酚產生工程菌E.coliBL21/pETDuet-l-dgr_tdhdr的全蛋白(泳道I)電泳圖；
圖3A為高效液相色譜法(HPLC)檢測野生型菌株HAU-JLC44轉化合成雌馬酚的圖譜；
圖3B為高效液相色譜法(HPLC)檢測大腸桿菌工程菌轉化合成雌馬酚的圖譜；
圖3C為高效液相色譜法(HPLC)檢測以黃豆苷原、二氫黃豆苷原和外消旋體雌馬酚標準品的圖譜；
圖3D為大腸桿菌工程菌轉化黃豆苷原所生成產物的紫外吸收圖譜；
圖4是工程菌轉化底物黃豆苷原后所生成產物的質譜圖； 圖5A為化學合成的外消旋體雌馬酚的手性液相色譜圖；
圖5B為工程菌轉化底物黃豆苷原后生成雌馬酚的手性液相色譜圖；
圖6為工程菌對不同底物黃豆苷原的轉化能力圖；
圖7為工程菌對豆粉浸液培養基中黃豆素和黃豆苷原的轉化能力圖；
其中圖7中左側柱狀圖是在豆粉浸液培養基中添加了乳糖;右側柱狀圖是在豆粉浸液培養基中添加山梨醇。
【具體實施方式】
[0030]下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護范圍并不僅限于此:
實施例1:愛格氏菌(Eggerthella sp.)HAU_JLC44的分離篩選、種屬鑒定和菌株HAU-JLC44轉化底物黃豆苷原所生成產物的結構鑒定
1、菌株HAU-幾C44是從公雞新鮮糞便中分離得到的一株革蘭氏陽性嚴格厭氧細菌菌株，該厭氧細菌對底物黃豆苷原有轉化作用，菌株HAU-JLC44的分離篩選過程為:
1)用已滅菌的棉簽挑取公雞新鮮糞便，放入ImL新鮮BHI液體培養基中，并放置在37°C厭氧工作站內，以此作為篩選特定功能微生物菌株的微生物菌群；
2)對MlI液體培養基內的微生物菌群進行梯度稀釋，分別稀釋到濃度為10—^ΙΟ'ΙΟ—3、10—4、10—5、10—6、10—7、10—8，再分別將 100 μ?濃度分別為 10—5、10—6、10—7、10—8的微生物菌群稀釋液均勻涂在預先備好的BHI固體培養基上，將涂有微生物菌群稀釋液的BHI固體培養基置于厭氧工作站內培養24-48 h后，分別從BHI固體培養基上挑取數十至數百個單菌落置BHI固體培養皿上，并對所挑取的單菌落進行隨機編號；
3)將已編號的單菌落隨機取10個一組，將每組的10個已培養在BHI固體培養基上的單菌落接種到盛有I mL BHI液體培養基的同一試管內，再分別加入10 mM黃豆苷原母液10 μI，在厭氧工作站內培養3天，取100 μ?培養液并用1000 yl乙酸乙酯進行萃取，萃取液蒸干后加入100%甲醇，用HPLC檢測有無產物生成；
4)一旦某試管中的培養物被檢測出有產物生成，立即將接種到該試管的事先已編號的1個已培養在BHI固體培養基上的單菌落，重新分別接種到1個盛有I mL BHI液體培養基的不同小試管中，再分別加入10 mM黃豆苷原母液10 μ?，共同培養3天后，取100 μ?培養液加入1000 yl乙酸乙酯進行萃取。萃取液蒸干后加入100%甲醇，用HPLC進行檢測，最終確定出具有轉化活性的10個菌落的混合培養物中能轉化底物黃豆苷原的單菌落。將篩選出的具有轉化功能的單菌落在BHI固體培養基上劃線培養，長出單菌落后，再對長出的單菌落進行劃線，重復至少三次以上，確保長出的單菌落形態一致；
5)經高效液相檢測，發現一株細菌對底物黃豆苷原具有轉化作用，在保留時間8.50min左右出現的底物黃豆苷原的峰明顯減少，而在保留時間15.28 min出現一新物質峰，且隨底物濃度加倍，該新物質峰的峰面積也成比例增加，因此，我們將出現在15.28 min的新物質峰確定為菌株HAU-JLC44轉化底物黃豆苷原后生成的產物。
[0031]2、有關菌株HAU-JLC44的種屬鑒定:
以單一功能微生物菌株菌體總DNA為模版，以通用引物27F/1492R為引物對16S rDNA序列進行PCR擴增，PCR擴增產物送交上海生工生物工程有限公司進行DNA測序。通過BLAST比對，菌株 JLC44 與愛格氏菌屬菌株 Eggerthella lenta strain AUH_Julong365、Eggerthella lenta strain ZL3和Eggerthella sp.MVAl的 16S rDNA序列相似性均高達99%，表明菌株HAU-JLC44可能為愛格氏菌屬的一個分類單元。通過16S rDNA序列，結合菌株HAU-JLC44的生理生化特征，我們初步將菌株HAU-JLC44鑒定為愛格氏菌屬的不定種菌株，BPEggerthella sp.HAU-JLC44。該菌株對氧氣非常敏感，只能在嚴格厭氧環境(如厭氧工作站)中生長和發揮轉化功能。
[0032]3、菌株HAU-JLC44轉化底物黃豆苷原所生成產物的結構鑒定
在厭氧工作站內，將菌株說1]-幾044與0.6 mM的底物黃豆苷原共培養3天，然后用等體積的乙酸乙酯將培養物萃取2次，萃取液蒸干后，加入100%甲醇溶解，過孔徑為0.45 μπι有機膜，用半制備高效液相色譜將產物峰用干凈三角瓶收集，并將三角瓶收集的液體用旋轉蒸發儀蒸干。用分析型高效液相色譜柱測定產物峰純度，并與標準品雌馬酚比對高效液相保留時間。此外，還對產物的紫外吸收圖譜、質譜和核磁共振氫譜(1H-NMR)進行了測定。
[0033]經高效液相色譜檢測，產物的出峰時間與標準品雌馬酚基本一致(僅比標準品出峰慢0.1 min);經全波長掃描，所純化的黃豆苷原代謝產物僅在280 nm處有一最大紫外吸收峰，這恰與已報道的雌馬酚的紫外吸收圖譜一致;經ESI陽離子質譜測定，發現在243 nm處有一分子離子峰，表明該產物的分子量應為242，這恰與雌馬酚(C15H14O3)的分子量相一致;為進一步準確鑒定產物的化學結構，還對該產物進行了核磁共振氫譜分析，該代謝產物的核磁共振氫譜解析結果為= 1H-NMR ((CD3)2⑶，400 MHz): 2.93(m, 2H, H-4)，3.07(m, 1H, H-3), 3.93 (m, 1H, H—2), 4.19 (m, 1H, H—2), 6.29 (d, 1H, J=2.4 Hz, H-8)， 6.38 (dd, H-37), 7.17 (d, 2H, J=8.5 Hz, H-67), 8.19 (s, 1H, OH), 8.29 (s,1H, OH)o
[0034]根據高效液相保留時間、紫外吸收圖譜，質譜以及核磁共振氫譜的解析結果，最終將愛格氏菌Eggerthella sp.HAU-JLC44轉化底物黃豆苷原后所生成的產物準確鑒定為雌馬酚。
[0035]經手性高效液相色譜檢測，愛格氏菌Eggerthella sp.HAU-JLC44轉化底物黃豆苷原所生成的產物僅在保留時間15.26 min出現一個物質峰，該產物峰的高效液相保留時間與S-雌馬酚的保留時間完全一致，因此，愛格氏菌Eggerthella sp.HAU-JLC44轉化底物黃豆苷原所生成的雌馬酚為S-雌馬酚。
[0036]實施例2: S-雌馬酚產生工程菌的構建及驗證
本發明利用本實驗室分離得到的野生型菌株愛格氏菌(Eggerthella sp.)HAU_JLC44的基因組DNA克隆S-雌馬酚生物合成基因，將不同功能基因連接在同一質粒上，構建了一種S-雌馬酚產生工程菌，該工程菌的構建主要包括以下步驟:
1、雌馬酚生物合成基因的獲得
采用基因組DNA克隆法來獲得目的基因，愛格氏菌株HAU-JLC44為嚴格厭氧細菌菌株，使用BHI培養基(美國Bacto公司)37°C培養于Concept 400厭氧工作站(英國Ruskinn公司)，取ImL菌液，使用基因組提取試劑盒(北京全式金生物技術有限公司)提取HAU-JLC44的基因組DNA，設計帶有酶切位點同時攜帶一段載體重復序列的引物，PCR法擴增E-dgr基因和E-tdhdr整合基因，使得E-dgr基因的N端和C端分別加上Bgl II和Kpn I酶切位點，E-tdhdr整合基因的N端和C端分別加上BamH I和Hind III酶切位點。電泳檢測目的條帶的大小，基因E-dgr大小為1935 bp，整合基因E-tdhdr大小為2467 bp。
[0037]PCR體系和條件:TaKaRa PrimeSTAR Premix(2X)25 μ?;引物上游序列(10 μΜ)2μ?;引物下游序列(10 μΜ)2 μ?;基因組DNA I μ?;滅菌蒸餾水補足50 μ?。
[0038]PCR引物(下劃線部分為酶切位點，斜體部分為與載體重復的序列)
引物I上游序列:
5’-CATCACCACAGCCAGGATCCATGGCAAAATTCGATGTTGAGTATGATCTTG-3，
引物I下游序列:
5’-CATTATGCGGCCGCAAGCTTCTAGACCTCGATCTCGCCC-3，
引物2上游序列:
5’-GGAGATATACATATGGCAGATCTATGAAGAACAAGTTCTATCCGAAGACC-3’
引物2下游序列:
5’-CAGACTCGAGGGTACCCTACAGGTTGCAGCCAGC-3，
弓丨物I為E-tdhdr的引物，引物2為E-dgr的引物。
[0039]PCR條件I(擴增E-tdhdr):98°C, 5min，I個循環;98°C，1s，56.1°C，5s，72°C，15s，30個循環;72 °C，I Omin，一個循環。
[0040]PCR條件2(擴增 E-dgr): 98°C，5min，I個循環;98°C，1s，55.2°C，5s，72°C，1s，30個循環;72°C , 1min,一個循環。
[0041 ] 2、質粒與工程菌的構建
將E-dgr基因克隆到大腸桿菌表達載體pETDue t-Ι (購自中國質粒載體菌株細胞株基因保藏中心)的MCS2中，獲得重組質粒pETDuet-1-dgr;將E-tdhdr整合基因克隆到pETDuet-1-dgr的MCSl 中，獲得重組質粒pETDuet-1-dgr-tdhdr。然后將重組質粒pETDuet-1-dgr-tdhdr轉入到大腸桿菌表達宿主菌BL21(DE3)(購自全式金生物技術有限公司)，然后在含有氨芐青霉素(100 yg/mL)的LB(生工生物工程(上海)有限公司)平板上篩選具有抗性的陽性表達菌，獲得S-雌馬酚產生工程菌。
[0042]具體操作步驟如下:首先將載體pETDuet-Ι線性化，即使用內切酶Bgl 11(寶生物工程(大連)有限公司)和Kpn 1(寶生物工程(大連)有限公司)雙酶切質粒，利用膠回收試劑盒(生工生物工程(上海)有限公司)將酶切產物回收。使用閃電克隆試劑盒(購自北京博奧龍免疫技術有限公司)將帶有Bgl II和Kpn I酶切位點的E-dgr基因克隆至線性化的載體pETDuet-Ι上，連成環狀重組質粒pETDuet-1-dgr;其次，將重組質粒pETDuet-1-dgr作為載體進行線性化，即使用內切酶BamH 1(寶生物工程(大連)有限公司)和Hind 111(寶生物工程(大連)有限公司)對質粒進行雙酶切，利用膠回收試劑盒回收酶切產物，使用閃電克隆試劑盒將帶有BamH I和Hind III酶切位點的E-tdhdr整合基因克隆至線性化的載體pETDuet-Ι-dgr上，連成環狀重組質粒pETDuet-1-dgr-tdhdr;然后，采用熱激法(42°C水浴90s)將質粒pETDuet-1-dgr-tdhdr轉化到大腸桿菌克隆宿主菌Trans 109(購自全式金生物技術有限公司)中，在含有氨芐青霉素(100 yg/mL)、IPTG(24 yg/mL)和X_gal(40 yg/mL)的LB固體平板上篩選陽性克隆，獲得克隆菌，送該克隆菌株到北京六合華大基因科技股份有限公司進行測序，對測序正確的菌株接種至LB培養基，37°C培養過夜后，8000 rpm離心3 min后收集菌體，使用質粒提取試劑盒(上海生工生物工程有限公司)提取重組質粒pETDuet-1-dgr-tdhdr，取5 μ?重組質粒pETDuet-l-dgr-tdhdr溶液熱激轉化大腸桿菌表達宿主菌BL21(DE3)(購自全式金生物技術有限公司)，然后在含有氨芐青霉素(100 yg/mL)的LB平板上篩選具有抗性的陽性表達菌，獲得S-雌馬酚產生工程菌，所構建三基因共表達重組質粒pETDuet-1-dgr-tdhdr的圖譜如圖1所不。
[0043]載體線性化酶切體系:10 X QuickCut Buffer 5 μ?; Bgl ΙΙ(或BamH I)和KpnI(SHind III)各I μ?;載體質粒6 μ?;滅菌蒸餾水補足50 μ?。
[0044]酶切條件:37°C水浴15 min。
[0045]3、S-雌馬酚產生工程菌的驗證 (I)酶切法驗證
為驗證擴增出來的兩個基因(E-dgr基因和E-tdhdr)是否成功克隆到質粒上，將該工程菌接種至LB培養基，37°C培養過夜后，8000 rpm離心3 min后收集菌體，提取質粒，提取方法按照試劑盒說明書操作，采用酶切后電泳的方法進行檢測，每個試驗組均以空質粒pETDuet-Ι酶切結果做對照，結果如圖2A所示。
酶切體系:
1)10 X QuickCut Buffer 5 μ?; Bgl 11 和Kpn I 各I μ? ;pETDuet-l-dgr-tdhdr 重組質粒6 μ?;滅菌蒸餾水補足50 μ?ο
[0046]2)10X QuickCut Buffer 5μ1; BamH I和Hind III各I μ?;pETDuet-l-dgr-tdhdr重組質粒6 μ?;滅菌蒸餾水補足50 μ?ο
[0047]3)10 X QuickCut Buffer 5 μ?; Bgl I1、BamH 1、Kpn I和Hind III各I μ?;pETDuet-l-dgr-tdhdr重組質粒6 μ?;滅菌蒸饋水補足50 μ?。
[0048]酶切條件:37°C水浴15 min。
[0049]從圖2A可以看出該工程菌中含有2條與dgr和tdhdr整合基因大小相一致的電泳條帶，說明已經成功的將這2個基因克隆至大腸桿菌表達宿主菌BL21(DE3)中。
[0050](2)SDS_PAGE 電泳驗證
工程菌蛋白提取:取I mL工程菌的菌液，使用細菌細胞蛋白裂解液(生工生物工程(上海)有限公司)提取細菌全蛋白，結果如圖2B所示。
[0051 ] 蛋白質電泳:使用5%的濃縮膠，12%分離膠，150V電泳80 min。
[0052](3)功能驗證
為驗證獲得的S-雌馬酚產生工程菌是否具有轉化黃豆苷原生成S-雌馬酚的能力，將S-雌馬酚產生工程菌從LB固體平板上挑到2 mL含有氨芐青霉素(100 yg/mL)的LB液體培養基中，搖床轉數為120 rpm，37°C培養12 h后，獲得種子液，用于接種。
[0053]將底物黃豆苷原和氨芐青霉素加入到盛有2mL LB培養基的試管中，使得黃豆苷原的終濃度為25.4 mg/L，氨芐青霉素終濃度為100 yg/mL。然后將種子液以體積濃度10%的接種量進行接種，搖床轉數為120 rpm，37 °C培養24 h后，獲得發酵液。
[0054]I)高效液相色譜法(HPLC)檢測產物生成情況
取發酵液100 口1至1.5 mL EP管中，加入500 μ?乙酸乙酯充分震蕩混勻，常溫8000 rpm離心10 min，取400 μ?上清液至另一 1.5 mL EP管中，使用旋轉蒸發儀將上清液蒸干，加入80 yl無水甲醇溶解，并過孔徑為0.45 Mi的有機膜后備用，該溶液用于HPLC檢測，以黃豆苷原、二氫黃豆苷原、外消旋體雌馬酚標準品(購自美國Indofine公司)為對照。結果如圖3Α、圖3Β、圖3C所示。
[0055]高效液相色譜條件:
液相色譜系統:美國Waters公司，1525型雙栗，2487 UV檢測器;色譜柱:KromasiI C18分析柱(5 μηι，250 mmX 4.6 mm);流動相:A液為10%乙腈-0.1%冰乙酸水溶液，B液為90%乙腈-0.1%冰乙酸水溶液，梯度洗脫:0-8 min:A:B=70:30，15 min:A:B=50:50，20 min:A:B=70:30;檢測波長:270 nm;流速:1.0 mL/min;進樣量:20 μ?ο
[0056]如圖3Α、圖3Β、圖3C的HPLC檢測結果可以看出，雌馬酚標準品的高效液相保留時間為15.18 min;本發明構建的工程菌發酵液中在保留時間15.11 min也檢測到一物質峰，該物質峰在280 nm有最大紫外吸收，這恰與雌馬酚的紫外吸收圖譜完全一致。通過高效液相保留時間和圖3D紫外吸收圖譜將工程菌代謝底物黃豆苷原后生成的產物初步鑒定為雌馬酚。
[0057]2)質譜法對發酵液中的產物進行準確結構鑒定
收集工程菌發酵液中保留時間在15.11 min的產物峰，蒸干后用于質譜分析，結果如圖4所示。發現其[M+H]+為243，因而，發酵液中產物的分子量應為242，這恰與雌馬酚(C15HwO3)的分子量一致。
[0058]因此，根據高效液相保留時間、紫外吸收光譜和質譜，將工程菌代謝底物黃豆苷原后產生的產物準確鑒定為雌馬酚。
[0059]3)手性高效液相檢測對發酵液中的產物進行構型鑒定
為確定工程菌所產生的產物雌馬酚的絕對立體構型，將工程菌轉化底物黃豆苷原的發酵液中的雌馬酚峰接出，蒸干后加100%甲醇，以化學合成的外消旋體雌馬酚標準品為對照，用手性高效液相色譜檢測工程菌合成的雌馬酚出峰情況，結果如圖5A和圖5B所示。
[0060]從圖5A和圖5B可以看出，發酵液中的雌馬酚在手性高效液相中的保留時間與S-雌馬酚一致，化學合成的雌馬酚所出現的兩個峰的絕對立體構型判斷是根據本實驗室以前發表的文獻(Wang et al, AEM2005)。
[0061 ]手性鑒定高效液相色譜條件:
手性液相色譜系統:美國Waters公司，1525型雙栗，2487 UV檢測器；色譜柱:SumiChiral 0A-7000手性分析柱(5 ym，250 mm x 4.6 mm);流動相:40%乙腈-60% KH2PO4溶液(20 mM);檢測波長:280 nm;流速:1.0 mL/min;進樣量:20 μ?ο
[0062]實施例3:S_雌馬酚產生工程菌在S-雌馬酚合成中的應用 1、S-雌馬酚產生工程菌的種子液制備；
將S-雌馬酚產生工程菌從LB固體平板上挑到2 mL含有氨芐青霉素(100 yg/mL)的LB液體培養基中，搖床轉數為120 rpm，37°C培養12 h后，獲得種子液，用于接種。
[0063]2、轉化用培養基和轉化條件
(I)轉化用培養基1:取LB固體培養基粉末2.5 g，用100 mL pH值為6.5的PBS緩沖液溶解，分裝成2 mL/管，121°C高溫高壓滅菌15 min待用。
[0064]轉化用培養基2:向10mL蒸餾水中加入研碎的黃豆粉1.5g，80 °C水浴I h，冰箱中靜置過夜，取出上清即為豆粉浸液，加入pH值為7.0的磷酸緩沖鹽，8卩22.21 g/L Na2HPO4和5.93 g/L NaH2PO4，完全溶解后分裝成2 mL/管。115 °C下滅菌15 min后加入過濾除菌的乳糖或山梨醇(終濃度1.0% w/v)，得豆粉浸液培養基，即培養基2。
[0065](2)轉化條件1:將種子液以體積濃度10%的接種量接種到轉化用培養基I中，同時加入終濃度為100 yg/mL的氨芐青霉素，搖床轉數為120 rpm，37°C培養10 h后，向培養液中加入山梨醇(終濃度1.0% w/v)、檸檬酸(終濃度2 g/L)和不同濃度的底物黃豆苷原(25 mg/L，50 mg/L,75 mg/L,100 mg/L,125 mg/L,150 mg/L)，繼續培養2 h，向培養液中加入氯霉素(終濃度85 yg/mL)，37°C繼續培養48 h后，采用上述HPLC條件檢測S-雌馬酚的生成量。
[0066]轉化條件2:將種子液以體積濃度10%的接種量接種到轉化用培養基2中，同時加入終濃度為100 yg/mL的氨芐青霉素，搖床轉數為120 rpm，37°C培養72 h后，采用上述HPLC條件檢測S-雌馬酚的生成量。
[0067]雌馬酚產生工程菌對底物的轉化情況用底物的轉化率表示，轉化率(％)=產物濃度(mg/L)/ [產物濃度(mg/L)+剩余底物濃度(mg/L) ] X 100%。轉化率越高代表底物轉化的越徹底，轉化效率越高。
[0068]如圖6結果表明，本發明所構建的工程菌能夠轉化底物黃豆苷原的最大濃度為100mg/L，S-雌馬酚轉化率為49.48%，產生二氫黃豆苷原的濃度為34.30 mg/L，S-雌馬酚的濃度為34.27 mg/L。如圖7結果顯示，本發明所構建的工程菌能夠轉化豆粉浸液中的黃豆素，生成S-雌馬酚和部分二氫黃豆苷原。
【主權項】
1.一種愛格氏菌(Eggerthella sp.)HAU_JLC44，保藏號為 CGMCC N0.12354。2.如權利要求1所述的愛格氏菌HAU-幾C44在S-雌馬酚合成中的應用，其特征在于:愛格氏菌HAU-JLC44在厭氧條件下將底物黃豆苷原轉化為S-雌馬酚。3.如權利要求1所述的愛格氏菌HAU-幾C44在S-雌馬酚合成中的應用，其特征在于:用愛格氏菌HAU-JLC44基因組DNA作模板，克隆雌馬酚生物合成基因，構建S-雌馬酚產生工程菌，并用S-雌馬酚產生工程菌合成S-雌馬酚。4.一種S-雌馬酚產生工程菌，其特征在于，所述S-雌馬酚產生工程菌為大腸桿菌(Escherichia coli)，是用愛格氏菌HAU-JLC44的基因組DNA作模板，克隆雌馬酚生物合成基因，構建而成，命名為S-雌馬酚產生工程菌HAU-JLC44，保藏號為CGMCC N0.12353。5.如權利要求4所述的S-雌馬酚產生工程菌的構建方法，其特征在于包括如下步驟: (I)從如權利要求1所述的愛格氏菌HAU-JLC44中克隆參與雌馬酚合成的三個轉化酶基因:黃豆苷原還原酶E-dgr、二氫黃豆苷原還原酶E-dhdr和四氫黃豆苷原還原酶E-thdr;所述E-dgr、E-dhdr和E-thdr的核苷酸序列如SEQ.1D.N0:1、SEQ.1D.NO:2和SEQ.1D.NO:3所示；基因E-dhdr和E-thdr之間有145 bp非編碼區核苷酸序列，將基因E-dhdr、基因E-thdr和這兩個基因中間的145 bp非編碼區序列按一個基因克隆下來，將其命名為整合基因E-tdhdr，整合基因E-tdhdr含有兩個開放讀碼框，所述整合基因E-tdhdr的核苷酸序列如SEQ.1D.NO:4所示； (2 )提取愛格氏菌HAU-JLC44的基因組DNA，設計引物將E-dgr和E-tdhdr兩個基因用PCR法擴增下來，在基因E-dgr的N端和C端分別加上Bgl II和Kpn I酶切位點，在整合基因E-tdhdr的N端和C端分別加上BamH I和Hind ΙΠ酶切位點； (3)將帶有BglII和Kpn I酶切位點的基因E_dgr，克隆至用Bgl II和Kpn I酶切過的T7雙啟動子共表達質粒pETDuet-Ι上，得到重組質粒pETDuet-1-dgr; (4)將帶有BamHI和Hind III酶切位點的整合基因E-tdhdr，克隆至用BamH I和HindΠI酶切過的重組質粒pETDuet-l-dgr上，得到重組質粒pETDuet-l-dgr-tdhd;r; (5)將重組質粒pETDuet-1-dgr-tdhdr轉入大腸桿菌Trans109，得克隆菌，送測序公司進行測序； (6)將重組質粒pETDuet-1-dgr-tdhdr從測序正確的克隆菌中提取出來，轉化大腸桿菌BL2UDE3)，獲得S-雌馬酚產生工程菌。6.根據權利要求5所述的S-雌馬酚產生工程菌的構建方法，其特征在于，步驟(2)中擴增E-tdhdr和E-dgr兩個基因設計的引物的序列如下:引物I的上、下游序列如SEQ.1D.NO:5和SEQ.1D.N0:6所示；引物2的上、下游序列如SEQ.1D.N0:7和SEQ.1D.N0:8所示。7.如權利要求4所述S-雌馬酚產生工程菌在S-雌馬酚合成中的應用，其特征在于包括以下步驟: a、S-雌馬酚產生工程菌的種子液制備； b、催化底物黃豆苷原轉化生成S-雌馬酚； C、催化豆粉浸液中的黃豆素轉化生成S-雌馬酚。8.根據權利要求7所述的S-雌馬酚產生工程菌在S-雌馬酚合成中的應用，其特征在于，步驟a包括以下步驟:使用LB液體培養基，加入終濃度為100 yg/mL的氨芐青霉素，搖床轉數為120 rpm，37°C培養12 h后，獲得種子液，用于接種。9.根據權利要求7所述的S-雌馬酚產生工程菌在S-雌馬酚合成中的應用，其特征在于，步驟b包括以下步驟:取LB固體培養基粉末2.5 g，用100 mL pH值為6.5的PBS緩沖液溶解，分裝成2 mL/管，121°C高溫高壓滅菌15 min，得到培養基I，待用;將步驟a中的種子液以體積濃度10%的接種量接種到培養基I中，同時加入終濃度為100 yg/mL的氨芐青霉素，搖床轉數為120 rpm，37°C培養10 h后，加入山梨醇至終濃度為1.0% w/v、加入梓檬酸至終濃度為2g/L和加入100 mg/L的底物黃豆苷原，繼續培養2 h后，加入氯霉素至終濃度為85 yg/mL,37°(:繼續培養48 h后，通過高效液相色譜HPLC檢測S-雌馬酚的生成量。10.根據權利要求7所述的S-雌馬酚產生工程菌在S-雌馬酚合成中的應用，其特征在于，步驟c包括以下步驟:向100 mL蒸餾水中加入黃豆粉1.5 g，80 °C水浴I h，冰箱中靜置過夜，取出上清液即為豆粉浸液，加入pH值為7.0的磷酸緩沖鹽，8卩22.21 g/LNa2HP04和5.93g/L NaH2PO4，完全溶解后分裝成2 mL/管；115°C下滅菌15 min后加入過濾除菌的乳糖或山梨醇至終濃度為1.0% w/v，得培養基2;將步驟a中的種子液以體積濃度10%的接種量接種到培養基2中，同時加入終濃度為100 yg/mL的氨芐青霉素，搖床轉數為120 rpm，37°C培養72h后，通過高效液相色譜HPLC檢測S-雌馬酚的生成量。
【文檔編號】C12N1/20GK105861363SQ201610233536
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年4月15日
【發明人】王秀伶, 高雅寧, 于秀梅, 張紅蕾
【申請人】河北農業大學