一種轉化植物甾醇的工程菌及其構建方法和應用
【專利摘要】本發明涉及工業微生物和發酵工藝學領域，尤其是一種具有催化功能的偶發分枝桿基因工程菌構建方法及其應用。通過失活保藏號CGMCC No.9657的野生型偶發分枝桿菌中1,2位脫氫酶基因，構建獲得的基因工程菌，能夠催化植物甾醇生成9α-羥基雄烯二酮，選擇性在70％～80％，可減少副產物9α-羥基睪酮。CGMCC No. 965720140915
【專利說明】
一種轉化植物留醇的工程菌及其構建方法和應用
技術領域
[0001] 本發明屬于生物技術和生物化工領域，具體為工業微生物和發酵工藝學領域，尤 其是一種具有催化功能的偶發分枝桿菌及其應用。
【背景技術】
[0002] 留體激素類藥物是指分子結構中含有留體結構的激素類藥物，是臨床上一類重要 的藥物，具有很強的抗感染、抗過敏、抗病毒和抗休克等藥理作用，是醫藥行業的重點發展 方向之一。這類藥物主要包括腎上腺皮質激素和性激素兩大類。皮質激素類藥物用于臨 床的有醋酸可的松（cortisone acetate)、氫化可的松（hydrocortisone)、醋酸地塞米松 (oexamethasone acetate)、醋酸氟輕松（fluocinonide)等。
[0003] 留體激素類藥物生產的重要原料為植物留醇。從植物留醇經過分支桿菌轉化生成 9 α -羥基-雄烯二酮（9 α -羥基-雄烯二酮，90H-AD，9 a -OH AD)。9 α -羥基-雄烯二酮 可以作為多種重要留體類藥物的合成原料。
[0004] 化學合成的方法生產工藝復雜產率不高，因此生物工藝發酵方法生產9α -羥 基-雄烯二酮是發展方向。
[0005] 現有的報道中，采用新金色分枝桿菌（M ycobacterium sp.)微生物催化植物甾醇 轉化為雄烯二酮，即雄留-4-烯-3, 17-二酮（AD)或雄留-1，4-烯-3, 17-二酮（ADD)，通過 誘變篩選到的菌株后ADD產量可明顯提高。雄烯二酮需經過進一步反應生成9 α -羥基-雄 烯二酮。
[0006] 保藏號為CGMCC No. 9657的一種偶發分枝桿菌，其中的9位羥基化酶、4, 5位脫氫 酶與留體邊鏈降解酶可以催化植物留醇轉化為9 α -羥基-雄烯二酮，轉化過程中同時產生 了較多量的副產物如9 α -羥基睪酮，生產單耗為2. 2~2. 5,總轉化率達到95%，選擇性 50 %~60%。造成選擇性較低的主要原因是隨著發酵時間的延長，產物9 α -羥基-雄烯二 酮會被1，2位脫氫酶轉化為9 α -羥基-1，4-雄烯二酮，9 α -羥基-1，4-雄烯二酮進一步 生產其他副產物，反應如下式所示。
[0007] 因此，需要對該菌株進行改進，獲得能夠減少產物降解的基因工程菌，減少9-羥 基-1，4-雄烯二酮生成及進一步降解，以降低單耗。

【發明內容】

[0008] 本發明的目的在于提供一種構建新的偶發分枝桿菌工程菌的方法，這種菌株具有 催化植物留醇生產9 α -羥基雄烯二酮的功能，能降低單耗并減少副產物。
[0009] 本發明的另一個目的在于提供一種新的工程菌。
[0010] 本發明還將上述工程菌用于生產9 α -羥基雄烯二酮。
[0011] 技術方案為，通過失活偶發分枝桿菌中至少一個1，2位脫氫酶基因的方法，構建 轉化植物留醇的工程菌。
[0012] 優選的，通過失活保藏號為CGMCC No. 9657的偶發分枝桿菌中至少一個1，2位脫 氫酶基因的方法，構建轉化植物留醇的工程菌。
[0013] 上述偶發分枝桿菌（拉丁名Mycobacterium foruitum)的保藏號為CGMCC No. 9657,保藏日期為2014年9月15日，保藏機構：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微 生物中心，地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號。
[0014] 該菌株的培養條件為牛肉膏0.2%、蛋白胨0.4%、甘油2%、瓊脂粉2% (pH自 然），28°C培養6-7天。保藏條件為真空冷凍干燥（長期保藏）。
[0015] 這種工程菌可用于催化植物留醇轉化為9 α -羥基雄烯二酮，轉化率超過95 %并 減少副產物，選擇性提高到70%~80%，單耗為1. 8~2. 0。
[0016] 使野生型轉化植物留醇的偶發分枝桿菌中的至少一個1，2位脫氫酶基因失活，構 建轉化植物留醇的工程菌。
[0017] 通過失活保藏號為CGMCC No. 9657的偶發分枝桿菌中至少一個1，2位脫氫酶基因 的方法，構建轉化植物留醇的工程菌。
[0018] 所失活的1，2位脫氫酶基因選自以下6個基因中的至少一種：GenBank登錄號 EJZ14836、EJZ16093、EJZ16098、EJZ14570、EJZ14467 和 EJZ13173 所對應的核酸序列同源性 在99%以上的核酸序列；更優選的，所失活的基因為1，2位脫氫酶SEQ ID No. 1~No. 6中 的至少一種。
[0019] 優選的，通過插入失活質粒使1，2位脫氫酶基因中斷失活。具體為：
[0020] (1)擴增1，2位脫氫酶基因的部分同源序列并插入失活質粒；
[0021] (2)將步驟（1)得到的質粒轉化保藏號CGMCC No. 9657的野生型偶發分枝桿菌。
[0022] 所述工程菌構建方法為，向上述6種
[0023] 所述的部分同源序列以保藏號為CGMCC No. 9657的野生型偶發分枝桿菌基因組 DNA為模板，用以下各組上下游引物中的至少一組擴增獲得的片段或者與該片段相同的核 苷酸序列：
[0024] (a)基因 1 上游引物：5' -AAAGAATTCCGGAGATGCTGTCGTTCGTG
[0025] 基因 1 下游引物：5' -AAAAAGCTTCGCCGGATTCCATCCACTT
[0026] (b)基因 2 上游引物：5 ' -AAAGAATTCTCGAAGTTGTCTGCCTTGACTG
[0027] 基因 2 下游引物：5 ' -AAAAAGCTTCCGCTGGCTGAACCTGATG
[0028] (c)基因 3 上游引物：5 ' -AAAGAATTCGACGGTCTTGCCGGGTTC
[0029] 基因 3 下游引物：5 ' -AAAAAGCTTCGGACGGTCAGTGAGTGGATT
[0030] (d)基因 4 上游引物：5 ' -AAAGAATTCTGTGCCCAGATCGGAAATGC
[0031] 基因 4 下游引物：5 ' -AAA AAGCTTTGCCTCGCTTCGGCTCAAC
[0032] (e)基因 5 上游引物：5 ' -AAAGAATTCGACACCGACCTGGTGGAGACA
[0033] 基因 5 下游引物：5' -AAA AAGCTITTCAACGTGGCGGCAATC
[0034] (f)基因 6 上游引物：5 ' -AAAGAATTCAGGGTCGGCTGCTTCTG
[0035] 基因 6 下游引物：5' -AAAAAGCTT TTCTCACTTCGGCGGTTC。
[0036] 通過上述方法可獲得轉化植物留醇的偶發分枝桿菌工程菌，該菌株的培養及保藏 方法與保藏號為CGMCC No. 9657的偶發分枝桿菌相同。
[0037] -種9α-羥基雄烯二酮的制備工藝，以植物留醇為原料，用上述工程菌發酵轉 化，發酵的條件為：25~34°C下（優選為26~32°C )通入空氣并攪拌；通氣比為1 :0· 3~ 0. 85,發酵轉化48~168小時。
[0038] 優選的通氣比為1 :0. 5~0. 75 ;更優選為1 :0. 55~0. 65。優選的攪拌速度為 300~600rpm，更優選450~500rpm。優選的發酵時間為84~168小時，更優選為84~ 120小時或136~168小時。
[0039] 一個優選的發酵轉化培養的條件為：溫度29±1°C，通氣比1:0. 6,攪拌速度 480rpm，發酵轉化時間為84~120小時或136~168小時。
[0040] 發酵轉化培養基含有：(a)甘油0.5%~2%，（b)磷酸鈉或酸式磷酸鈉鹽 0.75%~0.9%，和磷酸鉀或酸式磷酸鉀鹽0.35%~0.5%，（d)銨鹽如NH4C1 0.15%~ 0.3%，（e)MgS040 . 02%~0.06%，（f)黃豆粉 0.05%~0.2%或 0.5%~1 %的蛋白胨或酵 母膏；（g)分散劑（如吐溫80) 0.05%~0.2%; (h)卡那霉素 15~25ppm，均為質量百分比。
[0041] 發酵轉化培養基中還含有植物留醇0. 7%~2%，余量為水。
[0042] 優選的，發酵轉化培養基為：甘油 l%，Na2HP040 . 84%，KH2P040 . 45%，NH4C1 0. 2%， MgS040 . 03%，黃豆粉0· 1 %，植物甾醇1 %，分散劑如吐溫800. 1 %，卡那霉素 20ppm，余者為 水，pH 8. 5〇
[0043] 優選的，先將偶發分枝桿菌接種于種子培養基，25~34°C (優選為26~32°C ) 下通入空氣并攪拌，培養48~120小時后再接種于發酵培養液。通氣比為1 :0. 3~0. 85， 優選為1 :〇. 5~0. 75,攪拌速度為300~600rpm，優選為450~500rpm。取種子培養液以 5%~12%的體積比接種發酵培養液，優選為10%。
[0044] 發酵中使用的種子培養基含有：蛋白胨0.8%~1.4%，牛肉膏0.2%~0.5%， 恥(：10.45%~0.6%(均為質量百分比），卡那霉素40~60??111，？冊.8~7.3。優選的，種 子培養基pH = 6. 9~7. 0,含有蛋白胨1%，牛肉膏0· 3%，NaCl 0· 5%，卡那霉素50ppm，。
[0045] 優選的，種子培養條件為：溫度29土1°C，通氣比1:0. 6,攪拌速度480rpm，培養96 小時。
[0046] 發酵液用有機溶劑，如乙酸乙酯、二氯甲烷或二氯乙烷提取。發酵液與有機溶劑體 積比為1 :2~2 :1，優選為1 :1· 2~1. 2:1。
[0047] 經檢測，用本發明的偶發分枝桿菌發酵轉化植物留醇的主要產物為9 α -羥基雄 烯二酮，轉化率95%以上，選擇性達80%以上，生產9 α -羥基雄烯二酮的單耗在1. 8~2， 與野生型菌株相比，基因工程菌阻斷1，2位脫氫酶使之失活，從而減少9-羥基-1，4-雄烯 二酮生成和進一步降解，使轉化的單耗降低；基因工程菌轉化所產生的9 α -OH AD與副產 物d (9 α -羥基睪酮）的產量比例為8:1~12:1，副產物d (9 α -羥基睪酮）的量比野生型 菌株下降50%以上，且基因工程菌轉化后期產物穩定，不會出現原始野生型菌株轉化后期 產物快速降解的現象。與原始菌株相比，基因工程菌具有更佳的性能，可以提高生產效率。 工藝方法簡單，效率高，具有很好的應用前景。
【附圖說明】
[0048] 圖1為同源重組基因中斷失活的示意圖。
[0049] 圖2為發酵96小時后，提取發酵液檢測的液相色譜（HPLC)圖，圖2中㈧為基因 工程菌，圖2中（Β)為野生型菌株。
[0050] 其中，a-副產物1 ;b-乙酸乙酯；c-9 α -羥基雄烯二酮；d-9 α -羥基睪酮（副 產物2) ;e-副產物3 ;f-副產物4
[0051] 圖3為不同發酵時間時，野生型菌株與基因工程菌轉化生成的產物量. 具體實施方案
[0052] 實施例1
[0053] 野生型的偶發分枝桿菌，2011年8月采集自湖南張家界
[0054] 拉丁名稱：Mycobacterium foruitum
[0055] 保藏號：CGMCC No. 9657
[0056] 保藏日期：2014年9月15日
[0057] 保藏機構中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心
[0058] 地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號
[0059] 上述偶發分枝桿菌的保藏條件為：真空冷凍干燥（長期保藏）
[0060] 培養條件為：可以用通用的偶發分支桿菌培養基，25~30°C (優選28°C)在茄子 瓶內斜面培養6~7天。典型的斜面培養基成分：牛肉膏0. 2%、蛋白胨0. 4%、甘油2%、 瓊脂粉2% (pH自然）。
[0061] 實施例2 1，2位脫氫酶基因相關的同源交換片段的克隆
[0062] 在野生型的偶發分支桿菌中，克隆到六個與1，2位脫氫酶相關的基因。其序列分 別與 GenBank 登錄號 EJZ13173、EJZ14467、EJZ14570、EJZ14836、EJZ16098 和 EJZ16093 所 對應的核酸序列有99 %~100 %的同源性。
[0063] 分別克隆六個基因的內部一部分片段，構建六個基因插入失活質粒。首先根據已 發表的偶發分支桿菌相應序列設計引物（序列分別如SEQ ID No. 1~12所示）：
[0064] 基因 1(EJZ13173)上游引物：5' -AAAGAATTCCGGAGATGCTGTCGTTCGTG
[0065] 基因 1 下游引物：5' -AAAAAGCTTCGCCGGATTCCATCCACTT
[0066] 基因 2(EJZ14467)上游引物：5' -AAAGAATTCTCGAAGTTGTCTGCCTTGACTG
[0067] 基因 2 下游引物：5 ' -AAAAAGCTTCCGCTGGCTGAACCTGATG
[0068] 基因 3(EJZ14570)上游引物：5' -AAAGAATTCGACGGTCTTGCCGGGTTC
[0069] 基因 3 下游引物：5 ' -AAAAAGCTTCGGACGGTCAGTGAGTGGATT
[0070] 基因 4(EJZ14836)上游引物：5' -AAAGAATTCTGTGCCCAGATCGGAAATGC
[0071] 基因 4 下游引物：5' -AAA AAGCTTTGCCTCGCTTCGGCTCAAC
[0072] 基因 5(EJZ16098)上游引物：5' -AAAGAATTCGACACCGACCTGGTGGAGACA
[0073] 基因 5 下游引物：5' -AAA AAGCTITTCAACGTGGCGGCAATC
[0074] 基因 6(EJZ16093)上游引物：5' -AAAGAATTCAGGGTCGGCTGCTTCTG
[0075] 基因 6 下游引物：5' -AAAAAGCTT TTCTCACTTCGGCGGTTC
[0076] 上述引物由上海邁浦生物科技有限公司合成。以保藏號為的野生型偶發分支桿菌 總基因組為模板。使用寶生物公司的Primerstart高保真DNA聚合酶來進行片段的克隆。 PCR條件為：98°C變性10S、65°C退火15S，30個循環，72°C延伸7min。PCR產物上樣電泳后， 回收目的條帶。回收的目的條帶與質粒進行連接，連入PSP72質粒的Hindlll/EcoRI位點， 命名為 pSL-2-1，pSL-2-2, pSL-2-3, pSL-2-4, pSL-2-5 和 pSL-2-6 并測序。各個克隆片段 與 GenBank (登錄號：EJZ13173、EJZ14467、EJZ14570、EJZ14836、EJZ16098 和 EJZ16093 所 對應的核酸序列）中序列相比對，同源性大于99%。
[0077] 將同源交換目的片段用同樣的酶切位點Hindlll/EcoRI從pSL-2-1，pSL-2-2， pSL-2-3, pSL-2-4, pSL-2-5和pSL-2-6中切出，回收目的片段，將其分別連入Hindlll/ EcoRI酶切位點的pET28a質粒，得到新質粒分別命名為pSL-3-l，pSL-3-2，pSL-3-3， pSL-3-4, pSL-3-5 和 pSL-3-6。
[0078] 實施例3基因插入失活質粒的電轉化
[0079] 從保藏號為CGMCC No. 9657的野生型偶發分支桿菌斜面挑取適量菌體與50ml 種子培養基中培養48小時左右，達到對數生長期。將菌液搖瓶取出，倒入50ml離心管， 3800rpm離心15min，離心結束后，用含有10 %甘油洗滌菌體，再3800rpm離心；重復洗 滌、離心1次；將上清液倒掉,分別取菌體約于六個電擊杯（200μ 1/個）內，取2μ 1質粒 (pSL-2-1，pSL-2-2, pSL-2-3, pSL-2-4, pSL-2-5 和 pSL-2-6)分別加入電擊杯內混勻，電轉 儀條件為2. 5kv, 2ms,電擊結束后，加入500 μ 1種子培養基，混勻后吸出分別置于小離心管 內，37°C培養箱培養約2小時。將六份電轉化產物分別涂含有200 μ g/ml卡那霉素的斜面 培養基平板，37°C培養兩周后，挑取陽性轉化子。轉入6種失活質粒的菌株分別命名為菌株 I~VI，上述菌株的培養和保藏方法同CGMCC No. 9657的野生型偶發分枝桿菌。
[0080] 突變株總DNA的抽提以及基因型的驗證方法為：分別挑取六個質粒（PSL-2-1， pSL-2-2, pSL-2-3, pSL-2-4, pSL-2-5和pSL-2-6)的陽性轉化子于種子液體培養基中（Kan 200μg/ml)進行抗性驗證，30°C，220rpm培養3天后，篩選出可以生長的菌株。取上述可以 在卡那霉素抗性培養液中生長的菌液lml，離心倒去上清，用0. 5ml的STE緩沖液洗滌一 次，并用〇. 5ml的STE緩沖液重懸菌體后，加入溶菌酶（終濃度lmg/ml)，37°C溫浴15分鐘， 加入0· 4mL蛋白酶K(5mg/mL，用lysis buffer新鮮配制），0· lmLIO% SDS，混勻后迅速放入 70°C水浴15mim，呈澄清。置冰上冷卻，加入0. lmL 5M KAc，冰上冷卻15min。加入0. 5mL飽 和酚，混勻，加0. 5mL氯仿，混勻，12000rpm，4°C離心20min。用破口的槍頭將水相吸出置于 新的離心管，加2倍的無水乙醇，混勻，有團狀的DNA出現。將其置于新的離心管，加 lmL70% 乙醇洗滌，將液體傾出，用槍吸凈，加50 μ L TE溶解，加 RNase A使終濃度為50 μ g/mL，37°C 溫育0. 5小時。
[0081] 以此六個轉化陽性菌株的總DNA為模板，分別利用T7啟動子通用引物（作為上游 引物）與基因中斷質粒同源交換片段下游引物，進行PCR驗證。PCR程序：95°C，3min ;94°C， lmin ;55°C，lmin ;72°C，lmin (步驟二到步驟四 30 個循環）；最后 72°C，5min。PCR 產物送 由上海邁浦生物科技有限公司進行序列測定，得到包含有部分質粒片段和基因中斷同源交 換片段融合的目的條帶，表明基因中斷質粒已經插入目的基因內部，將其中斷失活。
[0082] 實施例4
[0083] 用實施例3中得到的菌株V (即失活EJZ16098基因的偶發分枝桿菌工程菌）催化 植物留醇生產9 α -羥基雄烯二酮并進行驗證。
[0084] 基因工程菌所有培養液滅菌后加入經過濾除菌的卡那霉素，種子培養基中終濃度 為50ppm，發酵培養基中為20ppm。
[0085] 取菌株V (失活其中EJZ16098基因）接種于種子培養基：將20L種子培養基放置 于35L種子罐中，接入一個茄子瓶斜面的菌（斜面面積約為8cmX 8cm)。種子培養基含有蛋 白胨1%，牛肉膏0.3%，NaCl 0.5% (均為質量百分比），卡那霉素50ppm，并將pH調整為 7· 0。
[0086] 種子培養條件均為：溫度29土 1°C，通氣比1:0. 6,轉速480rpm，培養96小時。
[0087] 取培養好的種子液，按10%體積比接種于發酵培養液，置于50升發酵罐內發酵 (裝料30L)，用來轉化植物甾醇。發酵培養液的pH = 8. 5,并含有：黃豆粉0. 1 %，甘油1 %， Na2HP040 . 84 %，ΚΗ2Ρ040 · 45 %，NH4C1 0· 2 %，MgS040 . 03 %，卡那霉素 20ppm，植物甾醇 1 %， 吐溫800. 1% (均為質量百分比）。
[0088] 發酵轉化培養的條件為：溫度29土 1°C，通氣比1:0. 6,轉速480rpm。
[0089] 轉化時間48、72、96、120、144、168小時分別取發酵液，并用等體積乙酸乙酯提取。 用高效液相色譜檢測乙酸乙酯相中產物的含量，每毫升乙酸乙酯（相當于每毫升發酵液） 中，如圖3所示。不同發酵時間時，野生型菌株與基因工程菌轉化生成的產物量對比顯示， 發酵時間在72~144小時產量最高。野生型菌株發酵時間超過96小時后，發酵液中9 a -羥 基雄烯二酮的含量繼續下降。
[0090] 發酵96小時后取菌株V的發酵液用等體積乙酸乙酯提取，用高效液相色譜檢測 乙酸乙酯相中產物的含量，結果如圖2中（B)，發酵轉化的主要產物為9 a-羥基雄烯二酮 (9a-OH AD)，副產物主要為9a-羥基睪酮（液相色譜圖中的d) ;9a-羥基雄烯二酮與 9a-羥基睪酮產量比例在8:1至12:1。轉化率達95%以上，生產9a-羥基雄烯二酮的單 耗為1. 8~2. 0,并且選擇性在70 %~80%。
[0091] 野生型偶發分枝桿菌（CGMCC No. 9657)發酵96小時后采用同樣的工藝條件進 行發酵并檢測產物，液相色譜圖如圖2中（A)，發酵轉化的主要產物為9 a -羥基雄烯二酮 (9a-OH AD)，副產物主要為9a-羥基睪酮（液相色譜圖中的d) ;9a-羥基雄烯二酮與 9 a -羥基睪酮產量比例在3:1至5:1。轉化率達95 %以上，生產9 a -羥基雄烯二酮的單耗 為2. 2~2. 5,并且選擇性轉化率50 %~60%。
[0092] 轉化率％ =轉化底物量+投入底物量X 100
[0093] 收率％ =實際產物量+理論產物量X 100
[0094] 選擇性％ =收率+轉化率X 100
[0095] 單耗=實際產物量+投入底物量
[0096] 以上底物為植物甾醇，產物為9 a -羥基雄烯二酮；轉化底物量=投入底物量-剩 余底物量；理論產物量=投入底物量+底物分子量X產物分子量，底物平均分子量414， 產物分子量302。
[0097]用實施例3所獲得的其他工程菌代替上述菌株V進行發酵，結果相同。主要產物 為9 a -羥基雄烯二酮，副產物主要為9 a -羥基睪酮；兩者摩爾比在8:1至12:1。轉化率 達95%以上，生產9 a -羥基雄烯二酮的單耗為1. 8~2. 0,并且選擇性在70-80%，效果均 優于野生型偶發分枝桿菌。
[0098] 基因工程菌轉化的單耗比原始菌株轉化的單耗降低，前者轉化中產生的副產物 d(9 a -羥基睪酮）的量比后者下降50%以上，且基因工程菌轉化后期產物穩定，不會出現 原始菌株轉化后期產物快速降解的現象。與原始菌株相比，基因工程菌具有更佳的性能，采 用基因工程菌轉化可以提高生產效率。
【主權項】
1. 轉化植物留醇的工程菌的構建方法，其特征在于，使野生型轉化植物留醇的偶發分 枝桿菌中的至少一個1，2位脫氫酶基因失活。2. 權利要求1所述轉化植物留醇的工程菌的構建方法，其特征在于，所述野生型轉化 植物留醇的偶發分枝桿菌為保藏號CGMCC No. 9657的菌株。3. 權利要求1所述轉化植物留醇的工程菌的構建方法，其特征在于，所述選自以下 6 個基因中的至少一種：GenBank 登錄號為 EJZ13173、EJZ14467、EJZ14570、EJZ14836、 EJZ16098、EJZ16093和所對應的核酸序列或者同源性在99%以上的核酸序列。4. 權利要求3所述轉化植物留醇的工程菌的構建方法，其特征在于，所述1，2位脫氫酶 基因的核苷酸序列如SEQ ID No. 1~6所示。5. 權利要求1或2所述轉化植物留醇的工程菌的構建方法，其特征在于，通過插入失活 質粒使1，2位脫氫酶基因中斷失活。6. 權利要求5所述轉化植物留醇的工程菌的構建方法，其特征在于，通過以下方法使 1，2位脫氫酶基因中斷失活： (1) 擴增1，2位脫氫酶基因的部分同源序列并插入失活質粒； (2) 將步驟（1)得到的質粒轉化保藏號CGMCC No. 9657的野生型偶發分枝桿菌。7. 權利要求5所述轉化植物留醇的工程菌的構建方法，其特征在于，所述的部分同源 序列以保藏號為CGMCC No. 9657的野生型偶發分枝桿菌基因組DNA為模板，用以下各組引 物中的至少一組擴增得到的片段或者與該片段相同的核苷酸序列： (a) 基因 EJZ13173 上游引物：5' -AAAGAATTCCGGAGATGCTGTCGTTCGTG 基因 EJZ13173 下游引物：5' -AAAAAGCTTCGCCGGATTCCATCCACTT (b) 基因 EJZ14467 上游引物：5' -AAAGAATTCTCGAAGTTGTCTGCCTTGACTG 基因 EJZ14467 下游引物：5' -AAAAAGCTTCCGCTGGCTGAACCTGATG (c) 基因 EJZ14570 上游引物：5' -AAAGAATTCGACGGTCTTGCCGGGTTC 基因 EJZ14570 下游引物：5' -AAAAAGCTTCGGACGGTCAGTGAGTGGATT (d) 基因 EJZ14836 上游引物：5' -AAAGAATTCTGTGCCCAGATCGGAAATGC 基因 EJZ14836 下游引物：5' -AAA AAGCTTTGCCTCGCTTCGGCTCAAC (e) 基因 EJZ16098 上游引物：5' -AAAGAATTCGACACCGACCTGGTGGAGACA 基因 EJZ16098 下游引物：5' -AAA AAGCTITTCAACGTGGCGGCAATC (f) 基因 EJZ16093 上游引物：5' -AAAGAATTCAGGGTCGGCTGCTTCTG 基因 EJZ16093 下游引物：5' -AAAAAGCTT TTCTCACTTCGGCGGTTC。8. -種轉化植物留醇的工程菌，其特征在于，為偶發分枝桿菌，通過權利要求1~7所 述的方法構建。9. 權利要求8所述的偶發分枝桿菌用于催化植物留醇轉化為9 α -羥基雄烯二酮。10. -種制備9 α -羥基雄烯二酮的方法，其特征在于，以植物留醇為起始原料，用權利 要求1所述的偶發分枝桿菌發酵催化植物留醇生成9 α -羥基雄烯二酮。11. 權利要求10所述制備9 α -羥基雄烯二酮的方法，其特征在于，發酵條件為：將權 利要求8所述的工程菌接種于含有植物留醇的發酵培養液中，25~34°C下通入空氣并攪 拌；發酵轉化時間為48~168小時。12. 權利要求11所述制備9 α -羥基雄烯二酮的方法，其特征在于，將工程菌接種于種 子培養液或種子培養基，25~34°C下通入空氣并攪拌，培養48~120小時后再接種于發酵 培養液。13.權利要求11所述制備9 a -羥基雄烯二酮的方法，其特征在于，發酵轉化時間為 84~120小時或136~168小時。
【文檔編號】C12N1/21GK105838730SQ201510016289
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2015年1月13日
【發明人】薛建萍, 姚再男, 邵雷, 唐璐敏, 蒲甜, 范錦錦, 朱健, 丁林富, 卜桂琴
【申請人】上海市農藥研究所有限公司, 薛建萍, 姚再男