本(ben)發明屬于(yu)工業微生物領域，具(ju)體涉及一(yi)種提高集胞藻PCC6803乙醇(chun)耐受(shou)能力的方法及應(ying)用。

背景技術：

為了應對日益嚴重的能源危機，作為生物燃料的乙醇成為替代石油燃料的選擇之一。由于異養發酵轉化產生乙醇需要糧食農作物作為燃料，乙醇需求的增加會加劇糧食短缺問題。而利用可以進行光合作用的藍藻作為生物反應器將CO₂轉化成乙醇，是(shi)解決此問(wen)題(ti)的(de)重要方案之(zhi)一(yi)。集胞藻(zao)(zao)PCC6803易于(yu)進(jin)行轉基(ji)因操作(zuo)，是(shi)進(jin)行該研究良(liang)好的(de)基(ji)因工程菌。例如(ru)將Zymomonas mobilis中的(de)丙(bing)酮酸脫(tuo)羧酶(pdc)基(ji)因和乙醇脫(tuo)氫酶II(adh)基(ji)因導入集胞藻(zao)(zao)PCC6803中，并(bing)以(yi)psbAII啟動子驅(qu)動這兩(liang)個基(ji)因表達(da)，可以(yi)使集胞藻(zao)(zao)PCC6803產生低濃度的(de)乙醇。

但是目(mu)前轉基因(yin)集(ji)(ji)胞(bao)(bao)(bao)藻PCC6803產(chan)生(sheng)的(de)乙(yi)醇含量還不能(neng)滿足乙(yi)醇工業(ye)(ye)化生(sheng)產(chan)的(de)要(yao)求，其中的(de)一個關鍵因(yin)素就是集(ji)(ji)胞(bao)(bao)(bao)藻PCC6803對(dui)乙(yi)醇的(de)耐受能(neng)力差。在含有1.5％(v/v)乙(yi)醇的(de)培養基中，集(ji)(ji)胞(bao)(bao)(bao)藻PCC6803細胞(bao)(bao)(bao)會(hui)發(fa)生(sheng)聚集(ji)(ji)，生(sheng)長速率降低50％以上。因(yin)此，研究提高集(ji)(ji)胞(bao)(bao)(bao)藻PCC6803耐受乙(yi)醇能(neng)力的(de)方(fang)法(fa)對(dui)于利用光合作用工業(ye)(ye)化生(sheng)產(chan)乙(yi)醇具有重要(yao)意義。

技術實現要素：

為了克服現有(you)技術(shu)的(de)(de)缺點與不足，本發明的(de)(de)首要目的(de)(de)在于(yu)提(ti)供一種提(ti)高(gao)集(ji)胞藻(zao)PCC6803乙醇(chun)耐受(shou)(shou)能力的(de)(de)方(fang)法(fa)(fa)。應用該方(fang)法(fa)(fa)得到了對乙醇(chun)耐受(shou)(shou)性顯著提(ti)高(gao)的(de)(de)集(ji)胞藻(zao)PCC6803藻(zao)株(zhu)，該藻(zao)株(zhu)可用于(yu)構(gou)建生產燃(ran)料乙醇(chun)的(de)(de)基因工程菌(jun)。

本發(fa)明的(de)目的(de)通過下述(shu)技(ji)術(shu)方案實(shi)現：

一種提高集胞藻PCC6803乙醇耐受能(neng)力的方法(fa)，包括(kuo)如下步(bu)驟(zou)：

(1)以序列表中SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2為上、下游引物，以野生型集胞藻PCC6803基因組為模板，通過PCR擴增得到sll0687基因上游序列sigI-up，如序列表中SEQ ID NO：7所示；以SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4 為上、下游引物，以野生型集胞藻PCC6803基因組為模板，通過PCR擴增得到sll0687基因下游序列sigI-down，如SEQ ID NO：8所示；以SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6為上、下游引物，以pET-30b質粒為模板，通過PCR擴增得到包含卡那霉素基因及其上下游部分序列Km^r，如(ru)SEQ ID NO：9所示；

(2)以限制性內切酶EcoRI和KpnI處理pUC118載體和步驟(1)得到的sigI-up片段，將sigI-up插入到pUC118上得到pUC118-up質粒；以限制性內切酶BamHI和HindIII處理pUC118-up和步驟(1)得到的sigI-down片段，將sigI-down插入到pUC118-up上得到pUC118-up-down質粒；以限制性內切酶BamHI和KpnI處理pUC118-up-down和步驟(1)得到的Km^r片段，將Km^r插入到pUC118-up-down上得到pUC118-up-down-Km^r同源雙交換質粒；

(3)將pUC118-up-down-Km^r質粒以(yi)(yi)自然轉(zhuan)化的方式轉(zhuan)入集胞(bao)藻(zao)PCC6803中，得到(dao)的轉(zhuan)化子以(yi)(yi)不同濃(nong)度的卡那霉素進(jin)行(xing)篩選，并在(zai)DNA水平(ping)上進(jin)行(xing)鑒定，最終得到(dao)sll0687基因完全敲(qiao)除的單克(ke)隆藻(zao)株，即對(dui)乙(yi)醇耐受性(xing)顯著提高的集胞(bao)藻(zao)PCC6803藻(zao)株，命名為IK2。

一種對乙醇耐受性顯著(zhu)提高的(de)集胞藻PCC6803藻株，通過上述方法得到。

通過上(shang)述方法(fa)構建的集胞藻(zao)(zao)PCC6803藻(zao)(zao)株IK2對乙醇(chun)的耐受能力(li)顯著提高，其在含(han)1.5％(v/v)乙醇(chun)的BG11培養基中(zhong)的生長(chang)狀態明顯優于野生型藻(zao)(zao)株。

所述(shu)的對乙醇(chun)(chun)耐受性顯(xian)著提高的集胞(bao)藻PCC6803藻株可(ke)用于(yu)構建生(sheng)產燃(ran)料乙醇(chun)(chun)的基因工程菌(jun)。

本發明相對于(yu)現有技術，具有如下的優點及效果：

本發明的(de)方(fang)法是(shi)通過同(tong)源重(zhong)組將(jiang)集胞藻(zao)PCC6803中的(de)sll0687基因(yin)進行敲(qiao)除，應(ying)用(yong)此方(fang)法得(de)(de)到的(de)集胞藻(zao)PCC6803藻(zao)株(zhu)IK2對(dui)乙(yi)醇的(de)耐(nai)受(shou)能力(li)顯著提高。在1.5％(v/v)的(de)乙(yi)醇脅迫下，該(gai)藻(zao)株(zhu)的(de)生長(chang)狀態明顯優于野生型藻(zao)株(zhu)。本發明得(de)(de)到的(de)乙(yi)醇耐(nai)受(shou)性藻(zao)株(zhu)對(dui)構建生產燃料乙(yi)醇的(de)基因(yin)工程菌具有重(zhong)要(yao)的(de)理(li)論和實際意義，具有廣泛的(de)應(ying)用(yong)前(qian)景(jing)。

附圖說明

圖1是pUC118-up-down-Km^r質粒的結構示意圖。

圖(tu)(tu)2是以SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3為引物(wu)對IK2藻株進行PCR鑒定的(de)(de)瓊(qiong)脂糖電泳(yong)圖(tu)(tu)；圖(tu)(tu)中泳(yong)道1是以野生型基(ji)(ji)因組(zu)為模板(ban)，泳(yong)道2是以IK2基(ji)(ji)因組(zu)為模板(ban)，M為marker，箭頭指向的(de)(de)位置(zhi)為2042bp。

圖(tu)3是集胞藻PCC6803野生型WT和IK2藻株在1.5％(v/v)乙醇脅迫下 的生長曲線圖(tu)，圖(tu)中E代(dai)表乙醇。

圖(tu)4是集胞藻(zao)PCC6803野(ye)生型WT和IK2藻(zao)株(zhu)在(zai)1.5％(v/v)乙(yi)醇脅迫(po)下(xia)的(de)藻(zao)液的(de)顏色(se)，圖(tu)中藻(zao)為生長曲線(xian)中第4天的(de)狀態。

圖5是(shi)集胞(bao)(bao)藻PCC6803野生型(xing)WT和(he)(he)IK2藻株在(zai)1.5％(v/v)乙醇脅迫下的全(quan)(quan)細胞(bao)(bao)吸(xi)收(shou)圖；A圖為野生型(xing)，B圖為IK2和(he)(he)野生型(xing)WT乙醇脅迫下全(quan)(quan)細胞(bao)(bao)吸(xi)收(shou)圖。

具體實施方式

下面結合實(shi)施(shi)(shi)例及附圖(tu)對本(ben)發(fa)明作進一步詳細的(de)描述，但本(ben)發(fa)明的(de)實(shi)施(shi)(shi)方式不(bu)限于此。

本發明實施例中使用(yong)的集胞藻PCC6803野(ye)生(sheng)型藻株(zhu)從(cong)ATCC27184中分離(li)純化得到，ATCC是美國菌(jun)種保藏中心(xin)的簡(jian)稱，27184是菌(jun)株(zhu)編號。質粒pUC118購(gou)自(zi)(zi)Takara公(gong)(gong)司，pET-30b購(gou)自(zi)(zi)Novagen公(gong)(gong)司。

實施例1

同源重組雙交換質粒pUC118-up-down-Km^r的構建：

(1)插(cha)入片段的擴增：

以序列表中SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2為上、下游引物，以野生型集胞藻PCC6803基因組為模板，通過PCR擴增得到sll0687基因上游序列sigI-up，如序列表中SEQ ID NO：7所示；以SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4為上、下游引物，以野生型集胞藻PCC6803基因組為模板，通過PCR擴增得到sll0687基因下游序列sigI-down，如SEQ ID NO：8所示；以SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6為上、下游引物，以pET-30b質粒為模板，通過PCR擴增得到包含卡那霉素基因及其上下游部分序列Km^r，如SEQ ID NO：9所示。本發明中集胞藻PCC6803的基(ji)因組(zu)提取(qu)(qu)(qu)采用植(zhi)物(wu)基(ji)因組(zu)DNA快速(su)提取(qu)(qu)(qu)試劑盒(廣州(zhou)東(dong)勝生(sheng)物(wu)科(ke)技有限(xian)公(gong)司，貨(huo)號N1191)，質粒提取(qu)(qu)(qu)采用高純度(du)質粒小量提取(qu)(qu)(qu)試劑盒(廣州(zhou)東(dong)勝生(sheng)物(wu)科(ke)技有限(xian)公(gong)司，貨(huo)號N1011)。

PCR反應采用20μL體系：模板1μL，10×PCR Buffer(Mg²⁺plus)2μL，dNTP Mixture(各2.5mM)1.6μL，上游引物1μL(10μM)，下游引物1μL(10μM)，rTaq酶0.2μL，ddH₂O 13.2μL。向PCR管(guan)中加(jia)入各反(fan)(fan)應(ying)組分，短(duan)暫離心后，置于PCR儀(yi)上進行擴(kuo)增反(fan)(fan)應(ying)。擴(kuo)增程序為：預(yu)變(bian)(bian)性(xing)，94℃，3min；變(bian)(bian)性(xing)，98℃，10s；退火，溫(wen)度一般比引(yin)物Tm值低5～10℃，時間(jian)為15s；延(yan)伸(shen)， 72℃，每(mei)擴(kuo)增1kb DNA需1min；循環(huan)，變(bian)(bian)性(xing)-退火-延(yan)伸(shen)的循環(huan)38個；72℃，5min；16℃，10min。

PCR產物(wu)大(da)小經瓊脂糖電泳驗證(zheng)，與(yu)理論長(chang)度一致。在進行后續實(shi)驗前，各PCR產物(wu)還需膠(jiao)回收純(chun)化。

(2)插入片段與(yu)質粒的酶切連接

以限制性內切酶EcoRI和KpnI對步驟(1)得到的sigI-up片段和pUC118載體進行雙酶切。插入片段的雙酶切采用30μL體系：DNA 10μL，10×Buffer 3μL，兩種快速酶切酶各1μL，ddH₂O 15μL。質粒的雙酶切采用20μL體系：DNA10μL，10×Buffer 2μL，兩種快速酶切酶各1μL，ddH₂O 6μL。酶切反應溫度為37℃，時間為1h。反應結束后，80℃溫浴5min，滅活酶。酶切產物經膠回收純化后，以T4DNA連接酶進行連接反應。連接反應采用20μL體系：插入片段DNA 12μL，質粒DNA 5μL，10×Buffer 2μL，酶1μL。連接反應溫度為16℃，反應8h后，將連接產物轉化至大腸桿菌DH5α中。對長出的轉化子進行鑒定是否連接成功，連接成功的質粒經Sanger測序確認，從而得到質粒pUC118-up。以相同的酶切反應和連接反應條件，將sigI-down片段和pUC118-up質粒連接，酶切位點為BamHI和HindIII。對連接成功的質粒進行驗證，從而得到pUC118-up-down質粒。最后，將Km^r片段和pUC118-up-down質粒連接，酶切位點為BamHI和KpnI，最終得到同源重組雙交換質粒pUC118-up-down-Km^r。

得到同源重組雙交換質粒pUC118-up-down-Km^r中sigI-up、sigI-down和Km^r的連接順序如圖(tu)1所示。

實施例2

對(dui)乙醇耐受性(xing)顯著提高的集胞藻(zao)(zao)PCC6803藻(zao)(zao)株(zhu)的獲得：

(1)質粒轉化

將pUC118-up-down-Km^r質粒用(yong)0.22μm的微孔濾(lv)膜(mo)(mo)過濾(lv)除菌(jun)后(hou)(hou)(hou)，裝(zhuang)入(ru)(ru)2mL無菌(jun)離(li)心管中(zhong)。向其中(zhong)加入(ru)(ru)一定(ding)量(liang)BG11培養(yang)基(已加入(ru)(ru)HEPES緩沖液(ye))，使質粒終濃度約為10ng/μL。取30mL處于(yu)對數(shu)期(qi)的野生型PCC6803，6000rpm離(li)心7min，去(qu)上清(qing)。用(yong)20mL新(xin)鮮BG11培養(yang)基重懸(xuan)藻(zao)泥，6000rpm離(li)心7min，去(qu)上清(qing)。用(yong)含(han)質粒的培養(yang)基把藻(zao)泥重懸(xuan)。將(jiang)(jiang)重懸(xuan)的藻(zao)液(ye)在29℃，150rpm，1400Lux連續光照培養(yang)6h。將(jiang)(jiang)藻(zao)液(ye)涂(tu)于(yu)鋪有混(hun)合纖維濾(lv)膜(mo)(mo)的固體(ti)培養(yang)基中(zhong)光照培養(yang)1天(正置培養(yang))后(hou)(hou)(hou)，將(jiang)(jiang)膜(mo)(mo)轉移至含(han)有10μg/mL卡那霉(mei)素的固體(ti)培養(yang)基中(zhong)，光照培養(yang)數(shu)天至膜(mo)(mo)表(biao)面長(chang)出(chu)單藻(zao)落。最后(hou)(hou)(hou)，將(jiang)(jiang)長(chang)出(chu)的藻(zao)落轉移至含(han)有相同濃度卡那 霉(mei)素的20mL BG11小瓶(ping)培養(yang)基中(zhong)培養(yang)，待(dai)長(chang)至對數(shu)期(qi)后(hou)(hou)(hou)轉接。

(2)藻株篩選

將(1)中得到的藻液進行轉接培養，培養條件為29℃，150rpm，1400Lux連續光照。轉接時，將BG11培養基中抗生素濃度提高到20μg/mL。待長至對數期再進行轉接，以后每次轉接培養基中抗生素的濃度提高10μg/mL。當培養基中的抗生素濃度達到50μg/mL時，將藻液平板劃線。待平板上長出單藻落后，挑取單藻落至含有相應抗生素濃度的BG11培養基中培養。當藻長至對數期后，提取該藻的基因組。以此基因組為模板，以SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3為引物進行PCR，同時以野生型基因組作為對照。本發明中PCR反應體系和程序與實施例1中相同。將PCR產物進行瓊脂糖電泳，鑒定該藻基因組中的sll0687基因是否完全被Km^r替換掉。以SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3為引物，在野生型中擴增得到的片段是sll0687基因及其上下游序列，長度為2042bp；在目標藻株中，擴增得到的片段是Km^r基因及sll0687基因的上下游序列，長度為3059bp。若完全替換，藻株篩選完成。否則，繼續提高抗生素濃度進行篩選鑒定。篩選得到的sll0687基因完全被Km^r替換掉(diao)的(de)藻(zao)(zao)株即為(wei)對(dui)乙醇耐受(shou)性顯著提高的(de)集胞藻(zao)(zao)PCC6803藻(zao)(zao)株，命名(ming)為(wei)IK2。

圖2是以SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3為引物對IK2藻株進行PCR鑒定的瓊脂糖電泳圖，圖中泳道1是以野生型基因組為模板，泳道2是以IK2基因組為模板。從圖中可以看出，野生型的片段在2000bp左右，與理論計算的2042bp長度接近；IK2的擴增片段長度比野生型的大，位置與理論計算的3059bp的位置接近，同時在2042bp處沒有條帶。除此之外，野生型和IK2的PCR產物的序列均已Sanger測序驗證，與理論一致。這說明，IK2中的sll0687基因已被Km^r替換掉。

本發明中所用BG11培養基配方：1L培養基中含有NaNO₃ 1.5g，K₂HPO₄0.04g，MgSO₄·7H₂O 0.075g，EDTA 0.001g，CaCl₂·2H₂O 0.036g，檸檬酸0.006g，檸檬酸鐵銨0.006g，Na₂CO₃ 0.02g，H₃BO₃ 0.00286g，MnCl₂·4H₂O 0.00181g，ZnSO₄·7H₂O 0.000222g，Na₂MoO₄·2H₂O 0.00039g，CuSO₄·5H₂O 0.000079g，Co(NO₃)₂·6H₂O 0.0000494g。使用時(shi)(shi)，每50mL培養基中加入1mL 1mol/L的HEPES緩沖液(pH＝7.5)。配制固體培養基時(shi)(shi)，再加入2％的瓊脂。

實施例3

IK2藻株在乙醇脅迫下的生(sheng)長(chang)狀(zhuang)態分析：

測定集胞藻PCC6803野生型和實施例2中得到的IK2藻株在1.5％(v/v)乙醇脅迫下的生長曲線：將生長至對數期的藻作為種子液，接種至含有50mL BG11培養基中，每瓶藻的起始OD₇₃₀＝0.1。連續培養4天，每天取樣測OD₇₃₀值，繪制生長曲(qu)線(xian)。培(pei)(pei)(pei)養條件為29℃，150rpm，1400Lux連續(xu)光照。開始培(pei)(pei)(pei)養時，在野生型和IK2實驗(yan)(yan)組的培(pei)(pei)(pei)養基中加(jia)入(ru)乙醇(chun)至(zhi)終濃度為1.5％(v/v)。實驗(yan)(yan)組和對照組各三個平行。

集胞藻(zao)PCC6803野生型(xing)和IK2藻(zao)株在1.5％(v/v)乙(yi)醇脅迫(po)下的(de)全(quan)細胞吸(xi)收(shou)光譜測(ce)定(ding)：取(qu)2mL生長(chang)曲線測(ce)定(ding)中培養(yang)至第4天的(de)藻(zao)液，用UV-2300紫外分光光度計進行波(bo)長(chang)掃描(miao)，掃描(miao)范圍為(wei)400～800nm，掃描(miao)速(su)度為(wei)400nm/min。測(ce)量(liang)前(qian)，先用BG11培養(yang)基(ji)進行基(ji)線校正。以波(bo)長(chang)為(wei)橫(heng)坐標(biao)，以對應的(de)OD值為(wei)縱坐標(biao)作圖(tu)繪制全(quan)細胞吸(xi)收(shou)光譜圖(tu)。各樣品的(de)全(quan)細胞吸(xi)收(shou)光譜圖(tu)以730nm處(chu)(chu)的(de)OD值進行歸一化處(chu)(chu)理。

圖3為集(ji)胞藻PCC6803野生(sheng)(sheng)(sheng)型和IK2藻株在(zai)1.5％(v/v)乙(yi)醇脅(xie)迫(po)下的(de)生(sheng)(sheng)(sheng)長曲(qu)線圖，圖中WT代表(biao)野生(sheng)(sheng)(sheng)型，E代表(biao)乙(yi)醇。從圖中可以看出(chu)，在(zai)乙(yi)醇脅(xie)迫(po)下IK2的(de)生(sheng)(sheng)(sheng)長曲(qu)線明(ming)顯高(gao)于(yu)野生(sheng)(sheng)(sheng)型。

圖4為集(ji)胞藻(zao)PCC6803野生(sheng)型(xing)(xing)和IK2藻(zao)株在(zai)1.5％(v/v)乙醇(chun)脅迫(po)(po)下的(de)藻(zao)液的(de)顏色(se)，圖中(zhong)藻(zao)為生(sheng)長曲(qu)線中(zhong)第4天的(de)狀態。從圖中(zhong)可(ke)以看出(chu)，乙醇(chun)脅迫(po)(po)的(de)野生(sheng)型(xing)(xing)顏色(se)與正常(chang)培養的(de)野生(sheng)型(xing)(xing)顏色(se)差別較大，乙醇(chun)脅迫(po)(po)的(de)野生(sheng)型(xing)(xing)的(de)藻(zao)的(de)顏色(se)發黃，顏色(se)淡(dan)。而乙醇(chun)脅迫(po)(po)的(de)IK2的(de)藻(zao)顏色(se)與沒(mei)有乙醇(chun)處(chu)理的(de)IK2藻(zao)的(de)顏色(se)接近，無明顯(xian)差別。

圖(tu)5為(wei)(wei)集(ji)胞藻(zao)PCC6803野(ye)生(sheng)型(xing)(xing)和IK2藻(zao)株在(zai)1.5％(v/v)乙(yi)(yi)醇(chun)脅(xie)(xie)迫下的(de)(de)全細(xi)胞吸收圖(tu)，A圖(tu)為(wei)(wei)野(ye)生(sheng)型(xing)(xing)，B圖(tu)為(wei)(wei)IK2，B圖(tu)中的(de)(de)點狀虛線(xian)為(wei)(wei)乙(yi)(yi)醇(chun)脅(xie)(xie)迫下的(de)(de)野(ye)生(sheng)型(xing)(xing)。從A圖(tu)中可以(yi)看出(chu)，在(zai)乙(yi)(yi)醇(chun)脅(xie)(xie)迫下，野(ye)生(sheng)型(xing)(xing)的(de)(de)葉綠(lv)素峰和藻(zao)藍蛋(dan)(dan)白峰顯著降低(di)。在(zai)B圖(tu)中，乙(yi)(yi)醇(chun)脅(xie)(xie)迫的(de)(de)IK2的(de)(de)葉綠(lv)素峰和藻(zao)藍蛋(dan)(dan)白峰與正常(chang)藻(zao)相比(bi)(bi)也有所降低(di)，但比(bi)(bi)乙(yi)(yi)醇(chun)脅(xie)(xie)迫的(de)(de)野(ye)生(sheng)型(xing)(xing)的(de)(de)峰高，說明乙(yi)(yi)醇(chun)對IK2光合(he)作用的(de)(de)影響比(bi)(bi)野(ye)生(sheng)型(xing)(xing)小。

綜合圖3、圖4和(he)圖5的數據可以說明(ming)，IK2對乙(yi)醇脅迫(po)的耐受(shou)性明(ming)顯優于野生型(xing)。

上(shang)述實施(shi)例為本發明(ming)(ming)較(jiao)佳的(de)(de)實施(shi)方(fang)式，但本發明(ming)(ming)的(de)(de)實施(shi)方(fang)式并不受上(shang)述實施(shi)例的(de)(de)限(xian)制，其(qi)他的(de)(de)任(ren)何未背(bei)離本發明(ming)(ming)的(de)(de)精神(shen)實質與原理下所作的(de)(de)改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的(de)(de)置換方(fang)式，都(dou)包含在本發明(ming)(ming)的(de)(de)保(bao)護范圍之內(nei)。