專利名稱：蜱的抗凝血蛋白及其基因和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物工程技術領域，尤其涉及一種蜱的抗凝血蛋白I hipilin-2及其基因和應用。
背景技術：
在生物進化過程中，哺乳動物形成了一個復雜的凝血系統來阻止血液的流失，而很多以血液為生的生物體內往往存在很多抗凝血蛋白以對抗宿主的凝血功能。蜱是一類以吸血為生的體外寄生蟲。與其他吸血節肢動物相比，蜱的吸血時間特別長，如硬蜱的吸血時間一般在10-14天(Sonenshine，1993)。蜱的長時間吸血過程，必然引起宿主一系列止血反應，如血管收縮、血小板凝集和血液凝固。為了進行持續的吸血，蜱必須克服宿主的止血反應，自從WaXman(1990)鑒定出第一個蜱的抗凝血分子以來，研究人員發現蜱的唾液腺在吸血過程中分泌產生多種抗凝血分子，如凝血酶抑制蛋白分子、凝血因子fe(FXa)抑制蛋白分子和組織因子通路抑制蛋白分子(TFPI)等，已在美洲花蜱、變異革蜱、間突硬蜱、具尾扇頭蜱、微小牛蜱等多種國外優勢蜱體內被發現(MaritZ-01iVier，2007)。盡管已報道的蜱抗凝血分子多達20多種，但完全鑒定的還很少。從目前的結果分析，蜱抗凝血分子多數屬于Kimitz家族絲氨酸酶特異性抑制分子，特征性含有1個或2個KU結構功能域和高度保守的半胱氨酸殘基，在進化上可能來自同一祖先(Lai，2004)。由于血栓引起的人心、腦血管疾病嚴重威脅著人類健康，目前可用的抗栓制劑有限，因此，抗栓藥物的研究一直是十分關注的領域(Bates and ffeitz,2006)。根據水蛭(螞蝗)抗凝血分子合成的抗凝血多肽Hirudin已被應用于醫學臨床(Turk，2006 ；Bates and ffeitz,2006)o在已經鑒定的蜱抗凝血分子中，有2個分子在動物模型實驗中具有抗血栓治療作用，其中1990年鑒定的TAP分子為凝血因子敘(FXa)抑制劑，重組表達的TAP在多個動物模型上都顯示了良好的抗血栓作用，由于抗原性等原因目前還未能在人體臨床上使用 (Bates andffeitz,2006)，但利用TAP分子的結構和作用機制設計更小的、沒有抗原性的抗栓藥物，或者構建新型重組抗栓藥物分子正在研究并取得進展，例如，應用TAP功能區序列和錨定蛋白Armexin V序列構建一個新的重組抗凝血蛋白分子，其抗血栓活性比單個錨定蛋白Armexin V的活性提高10倍(Chen，2005)。另一個蜱抗凝血分子Ixolaris，是近年從間突硬蜱鑒定的分子，與人的組織通道抑制因子(TFPI)同源，抑制凝血因子VIIa/組織因子復合體，在大鼠模型中，顯示了很強的抗血栓作用(Monteiro，2005 ；Nazareth，2006)。這些研究表明，蜱的抗凝血分子可以開發為新型抗血栓藥物。鐮形扇頭蜱(Rhipic^phalus haemaphysaloides)主要分布于南亞及中國南方，是中國優勢蜱種之一，在牛、羊、狗、兔等多種動物吸血寄生。申請號為200910053692. 5、公開號為CN101^8710A的中國專利申請，公開了一種鐮形扇頭蜱的抗凝血分子Miipilin-I的基因序列和重組表達與應用。但是，目前仍缺乏能開發為新型抗血栓藥物的蜱抗凝血蛋白， 關于鐮形扇頭蜱的其他抗凝血蛋白國內外尚沒有公開報道。

發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種蜱的抗凝血蛋白及其基因，該抗凝血蛋白為鐮形扇頭蜱的抗凝血蛋白Miipilin-2，可用于制備抗凝血藥物或抗凝血生物制劑。此外，還需要提供一種蜱抗凝血蛋白的重組表達方法及其在制備抗凝血藥物或抗凝血生物制劑中的應用。為了解決上述技術問題，本發明通過如下技術方案實現在本發明的一個方面，提供了一種蜱的抗凝血蛋白，所述抗凝血蛋白為鐮形扇頭蜱的抗凝血蛋白Miipilin-2，具有SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列。在本發明的另一方面，提供了一種蜱的抗凝血蛋白基因，所述基因為鐮形扇頭蜱抗凝血蛋白Miipilin-2基因，其包含編碼SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列的核苷酸序列。優選的，所述抗凝血蛋白基因具有SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列。在本發明的另一方面，還提供了一種包含上述鐮形扇頭蜱抗凝血蛋白基因的重組載體。在本發明的另一方面，還提供了一種包含上述重組載體的細胞。在本發明的另一方面，還提供了一種蜱抗凝血蛋白的重組表達方法，包括以下步驟構建含鐮形扇頭蜱抗凝血蛋白I hipilin-2編碼基因序列的真核表達重組載體；將所述重組載體轉化至大腸桿菌細胞，篩選獲得重組桿狀病毒粒；將該重組桿狀病毒粒轉染昆蟲細胞，進行I hipilin-2蛋白表達。在本發明的另一方面，還提供了一種上述蜱抗凝血蛋白在制備抗凝血藥物或抗凝血生物制劑中的應用。在本發明的另一方面，還提供了一種上述蜱抗凝血蛋白基因在制備抗凝血藥物或抗凝血生物制劑中的應用。本發明的鐮形扇頭蜱抗凝血蛋白Miipilin-2，經重組表達后獲得的I hipilin-2 重組蛋白，通過兔血漿部分凝血酶激活時間(Activated Partial Thromboplastin Time, APTT)實驗，證實了該蛋白具有抗凝血活性，非常適于制備抗凝血生物制劑。


下面結合附圖和具體實施方式
對本發明作進一步詳細的說明。圖1是本發明鐮形扇頭蜱抗凝血蛋白I hipilin-2基因的核苷酸序列和對應的氨基酸序列分析圖；圖2是本發明實施例2間接免疫熒光試驗檢測Miipilin-2在昆蟲細胞中的表達結果圖；圖3是本發明實施例2純化后的Rhipilin-2重組蛋白的Wfestern blotting結果圖；圖4是本發明實施例2重組抗凝血蛋白Iihipilin-2對兔血漿部分凝血酶激活時間和凝血酶原時間的影響圖。
具體實施例方式下列實施例中，未注明具體條件的實驗方法，通常按常規條件，如《分子克隆實驗指南》(J.薩姆布魯克，D. W.拉塞爾著，黃培堂，汪嘉璽，朱厚礎，等譯.第3版，北京科學出版社，200 中所述的方法進行。本發明通過構建鐮形扇頭蜱雌蜱吸血前后的唾液腺消減文庫和測序分析，從鐮形扇頭蜱克隆到一個抗凝血分子Miipilin-2的全長編碼基因，該基因全長為69;3bp，有一個完整的開放閱讀框，從第62個堿基到646個堿基，編碼195個氨基酸，預測蛋白分子量為 22kDa。預測的蛋白含有一個典型的Kimitz結構域，并在N端有一個20個氨基酸構成的信號肽序列。將本發明鐮形扇頭蜱抗凝血蛋白Miipilin-2在昆蟲細胞中進行重組表達，并通過兔血漿部分凝血酶激活時間(APTT)實驗證實，該蜱抗凝血蛋白Miipilin-2具有抗凝血生物活性，可用于制備抗凝血生物制劑。實施例1鐮形扇頭蜱抗凝血蛋白I hipilin-2的基因克隆和序列分析1.方法步驟(1)鐮形扇頭蜱唾液腺的制備鐮形扇頭蜱未吸血成蜱按雌雄1 1混合接種兔耳，接種后4-5天，取出半飽血雌蜱，解剖鏡下分離唾液腺，-70°C保存備用；同一蜱群未吸血雌蜱的唾液腺按同樣方法分離。(2)蜱唾液腺總RNA的提取采用hvitrogen公司的Trizol試劑，按實驗說明操作，分別提取鐮形扇頭蜱未吸血雌蜱和半飽血雌蜱總RNA，溶于無RNase的水中，測定總RNA 濃度，然后于_70°C冰箱保存備用。(3)雙鏈cDNA的合成采用Clontech公司的SMART PCR cDNA合成試劑盒，分別以 (2)步驟中的總RNA為模板，用Olig(dT) 18引物在逆轉錄酶作用下合成出第一鏈cDNA(ss cDNA)，并用長距離 PCR(LD-PCR)擴增出 cDNA 第二鏈(ds cDNA)。(4)抑制性消減雜交應用消減雜交試劑盒Clontech PCR Select cDNA Subtraction Kit。以半飽血雌蜱唾液腺為測試(Tester)，以未吸血雌蜱唾液腺為驅動 (Driver)，進行抑制性消減雜交。步驟如下分別將接頭1_測試cDNA(Adaptorl-Tester cDNA)和接頭 2-測試 cDNA (AdaptorfR-iTester cDNA)與驅動 cDNA (Driver cDNA)混合，68°C 溫育他，進行第1輪雜交；將上述兩個反應產物混合，并再次加入足量的驅動cDNA，68°C過夜，進行第2輪雜交；對消減雜交的產物進行兩輪PCR擴增，分別以加接頭未消減的半飽血雌蜱的cDNA做對照PCR。PCR的引物序列對應于接頭1和接頭2的序列(由試劑盒提供)。(5)消減文庫的構建、陽性克隆的篩選、EST序列測定與分析PCR擴增后的消減雜交產物經PCR純化試劑盒純化，與pGEM-T-easy載體連接，轉化到感受態細胞DH5 α篩選藍白斑，挑取全部白色克隆，以巢式PCR引物1和引物2R進行擴增，將陽性克隆送上海基康生物技術公司測序，測序結果在GenBank上進行同源性分析(//WWW. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST)，共獲得247個有效EST序列。(6)抗凝血分子I hipilin-2的全長基因序列測定和分析根據EST序列信息，挑選一個編號為201的EST序列，進行全序列測定和生物信息學分析，結果為完整編碼抗凝血分子同源性基因，命名為Miipilin-2基因。2.結果與分析
鐮形扇頭蜱雌蜱吸血前后唾液腺消減文庫成功構建，對所有克隆進行末端測序分析，共獲得247個有效EST序列。對其中一個抗凝血分子同源性基因的克隆，進行了全序列測定和生物信息學分析，發現為完整編碼基因，命名為Miipilin-2基因。如圖1所示， 該I hipilin-2基因全長為69;3bp(SEQ ID NO. 2)，在3，端有polyA，含有一個完整的開放閱讀框，從第62個堿基到646個堿基，編碼195個氨基酸(SEQ ID NO. 1)，預測蛋白分子量為22kDa，圖1中方框標出的ATG為起始密碼子，TAA為終止密碼子，蛋白質信號肽分析，在 N-端有一個20個氨基酸構成的信號肽序列(圖1中下劃實線序列為信號肽序列，箭頭表示信號肽切割點)；蛋白質功能域分析，在其編碼的氨基酸序列的50-87位存在由一個α 螺旋和兩個反向平行的β折疊構成的單Kimitz結構域。Blast分析發現該抗凝血蛋白 Rhipilin-2與抗凝血分子之一的組織通道抑制因子(TFPI)顯著同源。實施例2鐮形扇頭蜱抗凝血蛋白I hipilin-2基因的重組表達和抗凝血活性驗證1.方法步驟1. 1真核表達重組載體的構建及轉染根據基因的編碼區，設計含有EcoR I和B10 I酶切位點特異引物。forward 5' -GCGAATTCGAGGAAAAGCCCACATGCGAT-3，(SEQ ID NO. 3)；reverse 5' -GGCTCGAGACTTTACTGTTTTTAGGCTTGT-3’ (SEQ ID N0. 4)。經過常規的PCR技術，將目的基因IMpilin-2編碼序列亞克隆到桿狀病毒穿梭載體PFastHTA中，得到Iihipilin-2-pi^istHTA重組穿梭質粒，測序正確后將重組穿梭質粒轉化至大腸桿菌DHlOBac中，篩選重組桿狀病毒。抽提重組桿狀病毒粒Miipilin-2-Bacmid， 轉染至昆蟲細胞sf9中，進行蛋白表達。1. 2真核表達蛋白的間接免疫熒光檢測將I hipilin-2-Bacmid在Cellfectin II試劑的介導下轉染進入sf9細胞中，27°C 恒溫培養箱120h，收集上清作為第一代重組病毒，經三次傳代后得到高效價的種病毒液。分別取感染重組毒和野生型病毒的細胞，PBS洗滌三次，以固定液(甲醇丙酮=1 1)常溫下固定lOmin，進行間接免疫熒光實驗，一抗用鼠源抗His標簽單抗(1 300)室溫孵育 lh, PBS洗滌3次，用FITC標記的羊抗鼠IgG 二抗室溫孵育lh，PBS洗滌3次后，熒光顯微鏡下觀察結果。1. 3重組蛋白純化和Western blotting分析用PBS洗滌感染重組病毒的細胞和感染野毒的細胞，超聲裂解，采用Ni-NTA金屬螯合樹脂進行純化含His標簽的重組蛋白，收集被洗脫的蛋白，進行SDS-PAGE電泳，然后進 Rflfestern blotting分析，一抗用鼠源抗His標簽單抗(1 500)，二抗為Dylight 680羊抗鼠IgG抗體(1/10000)，通過紅外激光雙色成像系統觀察實驗結果。1.4重組蛋白部分凝血酶激活時間(APTT)和凝血酶原時間(PT)的測定按體積比，將9份新西蘭大白兔靜脈血加1份3. 8%的枸櫞酸鈉抗凝劑混勻，IOOOg 離心10分鐘，制備兔血漿。將不同濃度的重組蛋白Rhipilin-2加入至抗凝血漿中，使其終濃度分別為 1. 425uM、0. 713uM、0. 356uM、0. 178uM和 0. 089uM，對照組加入同體積 PBS。將 APTT 的試劑 Dade Actin Reagente Cefaloplastina Attivata、CaCl2 禾口 PT 的試劑 Thromborel S (美國HEMENS公司)分別放到血凝分析儀CA-500(日本SYSMEX公司)中，將制備好的含重組蛋白的抗凝樣本放至樣本架。在屏幕上進入WORK LIST菜單，設好ID號及要檢測的項目，準備
6好后按START鍵開始進行測定。每個樣本的APTT和PT試驗均重復三次。2.結果與分析2. 1真核表達重組載體的構建、轉染和蛋白表達真核表達重組質粒Rhipilin-2-pFastHTA經EcoR I和Β ο I雙酶切鑒定0788bp 和533bp)、測序正確后，轉化至E. coli DHlOBac中，抽提Rhipilin-2-Bacmid重組桿粒。 通用引物和特異性引物進行PCR鑒定結果顯示分別有一條^69bp的條帶和539bp的條帶，證明目的基因重組到桿狀病毒前體中，測序表明序列正確插入。重組桿狀病毒粒 I hipilin-2-BaCmid轉染至昆蟲細胞sf9中，7 后發現細胞病變，收集上清作為重組病毒繼續傳代，應用標簽蛋白抗體的間接免疫熒光試驗顯示，轉染sf9細胞第三代后，在熒光顯微鏡下細胞發出綠色熒光(見圖2B)，而對照組，轉染了野生毒株的sf9細胞則不發光(見圖2A)。證明I hipilin-2融合蛋白在sf9細胞中得到了的表達。2. 2重組蛋白的純化和Wfestern blotting檢測收集感染的細胞，超聲裂解，應用Ni-NTA親和樹脂純化含His標簽的重組蛋白， flfesternblotting分析表明(見圖3)，重組蛋白為^kDa左右，與預期重組蛋白大小一致， 而轉染Bacmid的sf9細胞作為對照，則沒有條帶出現，顯示I hipilin-2蛋白在昆蟲細胞中正確表達，重組蛋白按BCA方法測定濃度。在圖3中，“1”指重組蛋白；“2”指對照。2. 3重組蛋白抗凝血活性測定通過APTT對重組蛋白Ripilin-2的抗凝血活性進行檢測，發現隨著重組蛋白濃度的增大，抗凝作用越明顯，當重組蛋白濃度大于0. 713uM時，能顯著延長兔血漿的凝固時間 (見圖4)。而PT試驗中，隨著重組蛋白濃度的增大，兔血漿的凝固時間沒有顯示差別。對照組均與最低濃度樣本(0.089uM) —致。APTT是以腦磷脂(部分凝血活酶)代替血小板提供凝血的催化表面，在Ca2+的參與下，觀察血漿凝固所需要的時間，它的測定結果通常是判斷內源性凝血途徑是否正常的一個標準。本次試驗中隨著融合蛋白Ripilin-2濃度的增加，血凝時間也顯著增加，這說明該融合蛋白對內源性凝血途徑中的某一凝血因子有抑制作用，而且這種抑制作用隨著融合蛋白濃度的增加呈現線性關系；PT是在受檢血漿中加入過量的組織因子和Ca2+，使凝血酶原轉變為凝血酶，后者使纖維蛋白原轉變為纖維蛋白，它通常是檢測外源性凝血途徑的一個指標。本次試驗中，隨著融合蛋白Ripilin-2濃度的增加，PT值變化不大，由此判斷融合蛋白對參與外源凝血路徑的血凝因子影響不大。綜合APTT和PT試驗的結果，推測Ripilin-2通過對內源性凝血路徑的作用而顯示抗凝血活性。由上述實驗結果可知，本發明鐮形扇頭蜱抗凝血蛋白Ripilin-2可用于制備抗凝血生物制劑或抗凝血藥物。以上所述實施例僅表達了本發明的實施方式，其描述較為具體和詳細，但并不能因此而理解為對本發明專利范圍的限制。應當指出的是，對于本領域的普通技術人員來說， 在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發明的保護范圍。因此，本發明專利的保護范圍應以所附權利要求為準。序列表<110>中國農業科學院上海獸醫研究所廣州立達爾生物科技股份有限公司
<120> 蜱的抗凝血蛋白及其基因和應用
<160>4
<170>PatentIn version 3.3
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<212>PRT
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<223>信號肽
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60
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權利要求
1.一種蜱的抗凝血蛋白，其特征在于，所述抗凝血蛋白為鐮形扇頭蜱的抗凝血蛋白 Rhipilin-2，具有SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列。
2.一種蜱的抗凝血蛋白基因，其特征在于，所述基因為鐮形扇頭蜱抗凝血蛋白 Rhipilin-2基因，其包含編碼SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列的核苷酸序列。
3.根據權利要求2所述蜱的抗凝血蛋白基因，其特征在于，所述基因具有SEQID NO. 2 所示的核苷酸序列。
4.一種重組載體，其特征在于，包含權利要求2所述的蜱抗凝血蛋白基因。
5.一種細胞，其特征在于，包含權利要求4所述的重組載體。
6.一種蜱抗凝血蛋白的重組表達方法，其特征在于，包括以下步驟構建含鐮形扇頭蜱抗凝血蛋白Miipilin-2編碼基因序列的真核表達重組載體； 將所述重組載體轉化至大腸桿菌細胞，篩選獲得重組桿狀病毒粒； 將該重組桿狀病毒粒轉染昆蟲細胞，進行Miipilin-2蛋白表達。
7.權利要求1所述蜱的抗凝血蛋白在制備抗凝血藥物或抗凝血生物制劑中的應用。
8.權利要求2所述蜱的抗凝血蛋白基因在制備抗凝血藥物或抗凝血生物制劑中的應
全文摘要
本發明公開了一種蜱的抗凝血蛋白，所述抗凝血蛋白為鐮形扇頭蜱的抗凝血蛋白Rhipilin-2，具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。本發明還公開了鐮形扇頭蜱抗凝血蛋白Rhipilin-2基因，其包含編碼SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的核苷酸序列。本發明鐮形扇頭蜱抗凝血蛋白Rhipilin-2，具有明顯的抗凝血作用，適用于制備抗凝血藥物或抗凝血生物制劑。
文檔編號C07K14/435GK102153640SQ20111000838
公開日2011年8月17日 申請日期2011年1月15日 優先權日2011年1月15日
發明者周勇志, 周金林, 張厚雙, 曹杰, 陶正國, 高曉 申請人:中國農業科學院上海獸醫研究所, 廣州立達爾生物科技股份有限公司