專利名稱：基因重組制備人肌紅蛋白的方法
技術領域：
本發明涉及基因重組技術，與大量人工制備人肌紅蛋白有關，具體為利用基因重組技術制備人肌紅蛋白的方法。
背景技術：
人肌紅蛋白(myoglobin，Mb)由一條分子量17。8Kda的肽鏈組成，含一個血紅素，作為貯存氧的載體存在于人心肌、骨骼肌中，是心肌和骨骼肌中的主要蛋白之一。人肌紅蛋白基因在相關文獻及基因庫(Genebank)中已有記載，其全長10。4Kb，由3個外顯子和2個內含子組成，并且在5’和3’端分別含有70bp和531bp非翻譯區序列[AkaboshiE.Cloning of the human myoglobin gene.Gene，1985；33241-249；WellerP，Jeffreys AJ，Wilson V&Blanchetot A.Organization of the humanmyoglobin gene.The EMBO.1984；3(2)439-446]。
由于提取組織肌紅蛋白有限及其分子的低分子量給大量獲得肌紅蛋白 帶來很大困難。經檢索，美國醫學索引[Natl.Acad.Sci.USA.1985；825681-5684](記錄號06196066)記載了有關人肌紅蛋白基因重組表達的研究，其利用λ噬菌體、pAS1質粒等作克隆載體，需經過4次重組，以融合蛋白的形式在大腸桿菌中進行表達，但其制備的重組肌紅蛋白翻譯區僅有390bp(基因庫中為462bp)，表達產物不完整，而且氨基酸序列有誤，操作復雜，并且表達效率低。美國專利US5888766也公開了一種通過基因重組技術制備人肌紅蛋白的方法，但其所需的人肌紅蛋白的基因是用DNA合成儀通過化學合成方法得到的，然后再經修飾與載體重組，它用色氨酸啟動子質粒和大腸桿菌JM109作載體進行重組表達，從其DNA序列和所表達蛋白的氨基酸序列分析，有8個氨基酸與文獻及基因庫(Genebank)的記載不符。而國內涉及肌紅蛋白制備的方法大多為直接從組織中用物理化學方法提取純化，采用基因重組表達制備人肌紅蛋白的文獻尚未見報道。

發明內容
本發明為解決現有技術存在的上述缺陷，提供一種新的、表達正確、簡單的利用基因重組技術制備人肌紅蛋白的方法。
本發明是采用如下技術方案實現的基因重組制備人肌紅蛋白的方法，包括從組織抽提總RNA、總RNA反轉錄成cDNA、加入上下游引物進行PCR擴增步驟的RT-PCR技術制備人肌紅蛋白基因(cDNA)的過程、包括將提純的DNA片段、載體質粒雙酶切、酶切產物純化連接步驟的重組表達質粒的構建過程、重組體導入宿主大腸桿菌、外源基因在轉化體表達的過程和表達產物純化鑒定的過程，本發明在人肌紅蛋白基因的制備過程中所采用的RT-PCR技術是現有公知的制備基因的技術，其中涉及的上下游引物，在被制備的基因結構已知的情況下，其DNA序列的設計是公知技術；由于人肌紅蛋白的基因結構是公知的，因此，本發明在RT-PCR技術中加入的上下游引物的DNA序列設計對本領域技術人員來講無需創造性勞動。本發明在RT-PCR技術中需要特定的擴增參數，其基因制備過程中的擴增參數為93-95℃1-3min→60-68℃30-60s→68-72℃30-60s，該過程進行35次循環，在不同的循環過程溫度和時間可在上述的范圍內進行調整。重組體所用的質粒為pET-21a(+)，該載體(質粒)是由Novagen公司生產、銷售的公知產品，所用的宿主大腸桿菌選用BL21DE3菌株。選擇pET載體和BL21DE3菌株進行重組表達，其優點為該質粒含有強啟動子(T7啟動子)，利用IPTG誘導T7聚合酶，顯著提高目的基因表達水平；由于宿主菌不表達0mpt和Lon蛋白酶，因此表達產物比較穩定，不會被宿主菌蛋白水解酶所降解；該質粒在大腸桿菌的高效表達，便于使用多種方法進行鑒定和純化；該質粒具有表達His5-Tag結構，為應用Ni柱親和層析，快速純化表達產物提供了方便、經濟的手段。
重組表達質粒構建過程中，為提高基因與載體質粒的連接機率，純化后的目的基因和載體質粒的酶切產物以3∶1的比例相混合。
本發明所述的方法在插入基因片段兩端設計了雙酶切位點的人工接頭，保證了正確的插入方向，使重組體的構建可一次完成，操作更快速、方便、簡單，相對現有技術大大縮短了制備生產的時間；表達產物正確、特異、穩定、高效，純化的人肌紅蛋白能與抗人肌紅蛋白單抗特異反應，證明純化產物保持了其天然活性，因而，本發明所述的方法建立了人肌紅蛋白基因的大腸桿菌表達株，所表達人肌紅蛋白是正確的，亦為制備人肌紅蛋白及其單抗奠定了基礎。


圖1為人肌紅蛋白基因片段的RT-PCR擴增結果；圖2為人肌紅蛋白RT-PCR產物DNA序列測定結果；圖3為重組質粒酶切分析結果；圖4為重組質粒DNA測序結果；圖5為大腸桿菌BL21DE3中重組質粒表達產物的SDS-PAGE分析；圖6為純化后的人肌紅蛋白SDS-PAGE分析；具體實施方式
實施例11、經RT-PCR擴增肌紅蛋白cDNA從新鮮骨骼肌用Trizol等試劑抽提總RNA，經紫外分光光度儀測定RNA濃度及純度，變性瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA完整性。用提取的總RNA反轉錄成cDNA，以此為模板，加入內對照β-actin、肌紅蛋白上下游引物進行PCR擴增，所加入的Mb上下游引物的序列為P15’AACGCGGATCCATGGGGCTCAGCGACGGGGA 3’(BamH I)P25’ATCGGCTCGAGGGTGGGGGTGGGAGCGGCA 3’(Xho I)擴增反應參數94℃2min→63℃30s→70℃45s，進行35個循環。擴增產物經1.5％瓊脂糖凝膠電泳鑒定(結果見圖1)并送上海生工生物工程公司進行DNA序列測定(結果見圖2)。從圖1中可以看出，在500bp附近有一條清晰條帶，與預期產物511bp相符。從圖2可見，經DNA序列分析與Genebank檢索的肌紅蛋白序列一致，測序結果480bp(除31個上游引物未測出，包括下游引物全部序列)正確。
2、重組表達質粒的構建RT-PCR產物提純的片段、載體質粒均經BamH I/Xho I 37℃雙酶切過夜，酶切產物純化后二者以3∶1濃度加入并加入T4 DNA連接酶14℃孵育過夜。
3、外源基因導入宿主大腸桿菌BL21DE3及重組體的鑒定上述連接產物即表達質粒轉化感受態大腸桿菌BL21DE3，在含氨芐的LB平板上篩選出陽性克隆。取陽性克隆進行擴增，并從細菌中抽提重組質粒，用限制性核酸內切酶BamH I和Xho I進行酶切，瓊脂糖凝膠電泳和測序分析鑒定該重組質粒是否含有插入片段及正確閱讀框架(結果見圖3，4)。從圖3中看出，pET-21a(+)質粒大小為5443bp，通過T4 DNA連接酶連接后的重組表達質粒應為5942 bp。挑取重組陽性克隆，經BamHI/Xho I雙酶切后，在5kb及500bp附近分別有一條帶，與載體pET-21a(+)質粒及肌紅蛋白片段大小相吻合。證明重組質粒含有插入片段。從圖4中看出，重組質粒DNA序列分析結果與設計時預期的完全相同4、外源基因在轉化體中的表達及SDS-PAGE電泳分析挑取正確插入克隆，接種于含100μg/ml氨芐的LB培養基中，37℃振蕩培養16hrs，以1∶200比例接種于新鮮的含氨芐LB培養基中，37℃振蕩培養3hrs至OD600＝0.8-1.0，取部分菌液作為誘導前對照，然后加入終濃度為1mmol/L的IPTG(異丙基硫代β-D-半乳糖苷)，在37℃振蕩培養中誘導工程菌表達，分別于誘導3、6、12hrs取樣，以未轉化的BL21DE3空菌為對照，細菌經離心沉淀收獲，經超聲裂解細菌，然后14000rpm/min離心，分別取上清和沉淀經15％SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍R250染色，結果經Kodak Digital Science 1D凝膠成象系統掃描分析確定其分子量及蛋白表達量(結果見圖5)。圖5可以看出，誘導菌在分子量14.4和20.1KDa間比非誘導菌多一條蛋白條帶，這與肌紅蛋白預計分子量基本相符，誘導蛋白主要存在于上清中，沉淀中也有存在。圖5中，Lane1、2、10為誘導12、6、3h上清，Lane3、4、5為誘導12、6、3h沉淀，Lane7、8、11為誘導前上清和沉淀，Lane9、12為空菌對照上清與沉淀，Lane6為蛋白標準分子量。
陽性克隆菌經含氨芐LB37℃振蕩培養，IPTG誘導，離心沉淀收集細胞，用溶解緩沖液溶解處理細胞，并剪切DNA，經尿素沉淀，透析袋透析，硫酸銨鹽析等方法提取分離Mb，最后用PEG4000濃縮，經SDS-PAGE電泳分析其純度和分子量(結果見圖6)。圖6可見經純化的肌紅蛋白只有一條蛋白帶，無任何雜帶，所表達肌紅蛋白分子量為17.8Kda。用抗人肌紅蛋白進一步鑒定，證明純化的人肌紅蛋白能與抗人肌紅蛋白單抗特異反應，證明所表達的肌紅蛋白正確。
實施例2該實施例除擴增反應參數外，其它與實施例1相同。該實施例的擴增反應參數為94℃1min→60℃45s→68℃30s進行5個循環，94℃1min→65℃45s→68℃30s進行30個循環。本實施例的DNA擴增結果及表達效果與實施例1完全相同實施例3該實施例的擴增反應參數與其它的實施例不同。其擴增反應參數為94℃3min→68℃60s→72℃60s，進行35個循環。本實施例與其它實施例具有同樣的結果和效果。
權利要求
1.一種基因重組制備人肌紅蛋白的方法，包括從組織抽提總RNA、總RNA反轉錄成cDNA、加入上下游引物進行PCR擴增步驟的RT-PCR技術制備人肌紅蛋白基因(cDNA)的過程、包括將提純的DNA片段、載體質粒雙酶切、酶切產物純化連接步驟的重組表達質粒的構建過程、重組體導入宿主大腸桿菌、外源基因在轉化體表達的過程和表達產物純化鑒定的過程，其特征為——其基因制備過程中的擴增參數為93-95℃1-3min→60-68℃30-60s→68-72℃30-60s，該過程進行35次循環——重組體所用的質粒為pET-21a(+)——所用的宿主大腸桿菌選用BL21DE3菌株。
2.如權利要求1所述的基因重組制備人肌紅蛋白的方法，其特征為純化后的目的基因和載體質粒的酶切產物以3∶1的比例相混合。
全文摘要
本發明為基因重組制備人肌紅蛋白的方法,包括RT－PCR技術制備人肌紅蛋白基因(cDNA)的過程、重組表達質粒的構建過程、重組體導入宿主大腸桿菌、外源基因在轉化體表達的過程和表達產物純化鑒定的過程,重組體所用的質粒為pET－21a(+),所用的大腸桿菌選用BL21DE3菌株。該方法在插入基因片段兩端設計了雙酶切位點的人工接頭,保證了正確的插入方向,使重組體的構建可一次完成,操作更快速、方便、簡單,相對現有技術大大縮短了制備生產的時間;表達產物正確、特異、穩定、高效,純化的人肌紅蛋白能與抗人肌紅蛋白單抗特異反應,證明純化產物保持了其天然活性,因而,本發明所述的方法建立了人肌紅蛋白基因的大腸桿菌表達株,為制備人肌紅蛋白及其單抗奠定了基礎。
文檔編號C07K14/795GK1377970SQ02110359
公開日2002年11月6日 申請日期2002年4月27日 優先權日2002年4月27日
發明者王桂琴, 陳明, 史沁衛 申請人:王桂琴, 陳明, 史沁衛