本發(fa)明涉及一種(zhong)用于生產(chan)2-羥基吩嗪(qin)的基因工程菌(jun)株(zhu)及其制備(bei)方法和用途，屬于基因工程技術領域。

背景技術：

吩(fen)嗪衍生物(wu)(wu)(wu)是一類(lei)含氮雜環(huan)化(hua)合物(wu)(wu)(wu)，一般都(dou)有一定(ding)顏色，具(ju)有特定(ding)的(de)(de)吸收波(bo)譜，這(zhe)是由于雜環(huan)上存(cun)在不同的(de)(de)取代基所(suo)致，這(zhe)決定(ding)了它們不同的(de)(de)理化(hua)性(xing)(xing)質及抑(yi)制(zhi)植物(wu)(wu)(wu)和動物(wu)(wu)(wu)病原(yuan)菌(jun)的(de)(de)生物(wu)(wu)(wu)活性(xing)(xing)。幾乎所(suo)有的(de)(de)吩(fen)嗪化(hua)合物(wu)(wu)(wu)對細(xi)菌(jun)和真菌(jun)都(dou)有生物(wu)(wu)(wu)防治活性(xing)(xing)。吩(fen)嗪化(hua)合物(wu)(wu)(wu)具(ju)有一定(ding)的(de)(de)氧(yang)化(hua)還(huan)原(yuan)活性(xing)(xing)，在細(xi)胞(bao)中可能作(zuo)為電(dian)子(zi)載體(ti)，當(dang)細(xi)胞(bao)進行(xing)氧(yang)化(hua)還(huan)原(yuan)反應時，將電(dian)子(zi)傳遞到靶細(xi)胞(bao)，導(dao)致靶細(xi)胞(bao)中超氧(yang)化(hua)物(wu)(wu)(wu)的(de)(de)氧(yang)自由基增加而(er)使細(xi)胞(bao)死亡。

天(tian)(tian)然吩(fen)(fen)(fen)嗪(qin)(qin)(qin)化合物(wu)(wu)具有廣譜的(de)(de)(de)(de)抗(kang)菌(jun)(jun)(jun)(jun)活性(xing)(xing)(xing)，目前(qian)已經(jing)發(fa)現了近100種具有相(xiang)似(si)結(jie)構的(de)(de)(de)(de)天(tian)(tian)然吩(fen)(fen)(fen)嗪(qin)(qin)(qin)類化合物(wu)(wu)，不僅(jin)對小麥全蝕病(bing)、水(shui)稻(dao)(dao)枯萎病(bing)等病(bing)原菌(jun)(jun)(jun)(jun)有顯著(zhu)的(de)(de)(de)(de)抑(yi)制(zhi)(zhi)作(zuo)(zuo)用(yong)，還可(ke)(ke)用(yong)于(yu)肺結(jie)核、白血病(bing)、結(jie)核桿(gan)(gan)菌(jun)(jun)(jun)(jun)和(he)(he)非典型耐(nai)酸(suan)(suan)桿(gan)(gan)菌(jun)(jun)(jun)(jun)及麻風病(bing)等疾病(bing)的(de)(de)(de)(de)治(zhi)(zhi)療，已經(jing)在(zai)(zai)醫藥、農業領(ling)域越來越引(yin)起(qi)人(ren)們的(de)(de)(de)(de)重(zhong)視。天(tian)(tian)然吩(fen)(fen)(fen)嗪(qin)(qin)(qin)化合物(wu)(wu)主(zhu)(zhu)要(yao)由(you)細(xi)菌(jun)(jun)(jun)(jun)或放線(xian)菌(jun)(jun)(jun)(jun)產生(sheng)(sheng)合成(cheng)(cheng)，主(zhu)(zhu)要(yao)包括吩(fen)(fen)(fen)嗪(qin)(qin)(qin)-1-羧(suo)酸(suan)(suan)(PCA)、1-羥(qian)(qian)基(ji)吩(fen)(fen)(fen)嗪(qin)(qin)(qin)(1-hydroxyphenazine)、2-羥(qian)(qian)基(ji)吩(fen)(fen)(fen)嗪(qin)(qin)(qin)(2-hydroxyphenazine)，綠膿菌(jun)(jun)(jun)(jun)素(pyocyanin)和(he)(he)吩(fen)(fen)(fen)嗪(qin)(qin)(qin)-1-羧(suo)酰胺(an)(phenazine-1-carboxamide)等。Kiprianova等人(ren)曾對PCA、2-羥(qian)(qian)基(ji)吩(fen)(fen)(fen)嗪(qin)(qin)(qin)-1-羧(suo)酸(suan)(suan)和(he)(he)2-羥(qian)(qian)基(ji)吩(fen)(fen)(fen)嗪(qin)(qin)(qin)的(de)(de)(de)(de)抗(kang)菌(jun)(jun)(jun)(jun)性(xing)(xing)(xing)進行過研究(jiu)比較，發(fa)現在(zai)(zai)對細(xi)菌(jun)(jun)(jun)(jun)、真菌(jun)(jun)(jun)(jun)和(he)(he)動植物(wu)(wu)病(bing)菌(jun)(jun)(jun)(jun)的(de)(de)(de)(de)拮抗(kang)作(zuo)(zuo)用(yong)中，2-羥(qian)(qian)基(ji)吩(fen)(fen)(fen)嗪(qin)(qin)(qin)的(de)(de)(de)(de)抗(kang)菌(jun)(jun)(jun)(jun)性(xing)(xing)(xing)是最強(qiang)的(de)(de)(de)(de)[Smirnov V V,Kiprianova E A.Bacteria of Psedunomonas genus.Naukova Dumka,Kiev,Ukraine,1990:100-111.]。Thomashow L.S.等人(ren)也做過相(xiang)關研究(jiu)，發(fa)現同時合成(cheng)(cheng)吩(fen)(fen)(fen)嗪(qin)(qin)(qin)-1-羧(suo)酸(suan)(suan)和(he)(he)2-羥(qian)(qian)基(ji)吩(fen)(fen)(fen)嗪(qin)(qin)(qin)的(de)(de)(de)(de)菌(jun)(jun)(jun)(jun)株比只產吩(fen)(fen)(fen)嗪(qin)(qin)(qin)-1-羧(suo)酸(suan)(suan)菌(jun)(jun)(jun)(jun)株的(de)(de)(de)(de)抗(kang)菌(jun)(jun)(jun)(jun)活性(xing)(xing)(xing)要(yao)強(qiang)很多(duo)[Delaney S M,Mavrodi D V,Bonsall R F,et al.phzO,a gene for biosynthesis of2-hydroxylated phenazine compounds in Psedunomonas aureofaciens 30-84.Journal of Bacteriology,2001,183(1):318-327.]。本課題組(zu)張雪洪的(de)(de)(de)(de)專利CN200610117059.4中，綠針假單胞菌(jun)(jun)(jun)(jun)GP72的(de)(de)(de)(de)主(zhu)(zhu)要(yao)活性(xing)(xing)(xing)物(wu)(wu)質即為吩(fen)(fen)(fen)嗪(qin)(qin)(qin)-1-羧(suo)酸(suan)(suan)、2-羥(qian)(qian)基(ji)吩(fen)(fen)(fen)嗪(qin)(qin)(qin)-1-羧(suo)酸(suan)(suan)和(he)(he)2-羥(qian)(qian)基(ji)吩(fen)(fen)(fen)嗪(qin)(qin)(qin)，其活菌(jun)(jun)(jun)(jun)制(zhi)(zhi)劑可(ke)(ke)用(yong)于(yu)對辣椒、黃瓜(gua)(gua)(gua)、冬瓜(gua)(gua)(gua)、南瓜(gua)(gua)(gua)、番茄、茄子、韭菜(cai)(cai)、大蒜(suan)、菜(cai)(cai)豆、豇豆的(de)(de)(de)(de)疫病(bing)防治(zhi)(zhi)；用(yong)于(yu)對油(you)菜(cai)(cai)菌(jun)(jun)(jun)(jun)核病(bing)、黃瓜(gua)(gua)(gua)枯萎病(bing)、西瓜(gua)(gua)(gua)枯萎病(bing)、西瓜(gua)(gua)(gua)炭疽病(bing)、棉(mian)花立(li)枯病(bing)、水(shui)稻(dao)(dao)紋枯病(bing)的(de)(de)(de)(de)防治(zhi)(zhi)；還可(ke)(ke)以作(zuo)(zuo)為蔬(shu)(shu)菜(cai)(cai)生(sheng)(sheng)長促進劑使用(yong)，提高蔬(shu)(shu)菜(cai)(cai)產量。由(you)此(ci)(ci)可(ke)(ke)見，2-羥(qian)(qian)基(ji)吩(fen)(fen)(fen)嗪(qin)(qin)(qin)存在(zai)(zai)巨大的(de)(de)(de)(de)抗(kang)生(sheng)(sheng)潛力，因此(ci)(ci)大規(gui)模制(zhi)(zhi)備2-羥(qian)(qian)基(ji)吩(fen)(fen)(fen)嗪(qin)(qin)(qin)具有重(zhong)大的(de)(de)(de)(de)意義

在人工(gong)培養條件下，部(bu)分(fen)微生(sheng)物可以大(da)量合成較高濃度的(de)吩(fen)嗪(qin)化合物，比如綠針假(jia)單(dan)(dan)胞(bao)(bao)菌HT66能夠高水平合成吩(fen)嗪(qin)-1-甲酰胺(彭華松等，ZL 2013 1 0566864.5)。然而，研(yan)究發現(xian)目(mu)前(qian)能分(fen)泌2-羥(qian)基吩(fen)嗪(qin)的(de)綠針假(jia)單(dan)(dan)胞(bao)(bao)菌菌株，其合成效率(lv)都不高，無法實現(xian)大(da)規模生(sheng)產，對(dui)研(yan)究2-羥(qian)基吩(fen)嗪(qin)的(de)抑菌作(zuo)用(yong)、代謝調控及(ji)其工(gong)業(ye)化應(ying)用(yong)等都造(zao)成了障礙。

技術實現要素：

針(zhen)對現有技(ji)術中(zhong)的(de)(de)缺(que)陷，本發(fa)明的(de)(de)目的(de)(de)是提(ti)供(gong)一種用于生產2-羥基(ji)(ji)吩嗪(qin)的(de)(de)基(ji)(ji)因(yin)工程菌株(zhu)及其制備方(fang)法和用途。

本發明是通過(guo)以下技術方案實現的：

第一(yi)方面，本發(fa)明提供了(le)一(yi)種用于生產2-羥基(ji)吩嗪的基(ji)因工程菌株(zhu)，其特征在于，可通過如下(xia)方法獲(huo)得(de)：

將綠針假單(dan)胞菌(jun)HT66(Psedunomonas chlororaphis HT66)CCTCCNO:M2013467及其衍生(sheng)物基(ji)(ji)(ji)因組(zu)中的(de)phzH基(ji)(ji)(ji)因(phzH的(de)基(ji)(ji)(ji)因的(de)堿基(ji)(ji)(ji)序列(lie)和(he)對應(ying)蛋白質的(de)氨基(ji)(ji)(ji)酸(suan)序列(lie)分別如(ru)SEQ ID NO.1和(he)SEQ ID NO.2所示)替換為外源的(de)phzO基(ji)(ji)(ji)因，即得。

作為優選(xuan)方(fang)案，所述phzO基因來自綠針假單胞菌株(zhu)GP72(參見(jian)Liu H,He Y,Jiang H,et al.Characterization of a phenazine-producing strain Psedunomonas chlororaphis GP72 with broad-spectrum antifungal activity from green pepper rhizosphere[J].Current microbiology,2007,54(4):302-306.)、菌株(zhu)30-84(參見(jian)Pierson L S,Keppenne V D,Wood D W.Phenazine antibiotic biosynthesis in Psedunomonas aureofaciens 30-84is regulated by PhzR in response to cell density[J].Journal of Bacteriology,1994,176(13):3966-3974.)、菌株(zhu)Pa40(參見(jian)Jiao Z,Wu N,Hale L,et al.Characterisation of Psedunomonas chlororaphis subsp.aurantiaca strain Pa40with the ability to control wheat sharp eyespot disease[J].Annals of applied biology,2013,163(3):444-453.)或菌株(zhu)O6(參見(jian)Cho S M,Kang B R,Han S H,et al.2R,3R-butanediol,a bacterial volatile produced by Psedunomonas chlororaphis O6,is involved in induction of systemic tolerance to drought in Arabidopsis thaliana[J].Molecular plant-microbe interactions,2008,21(8):1067-1075.)。

來(lai)源于綠針假單胞菌株GP72、30-84、Pa40、O6的phzO基(ji)因的堿(jian)基(ji)序列(lie)分別如SEQ ID NO3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示(shi)。

第二方面，本發明提(ti)供了(le)一種(zhong)如前述的(de)(de)用于生(sheng)產(chan)2-羥基(ji)(ji)吩嗪的(de)(de)基(ji)(ji)因(yin)工程(cheng)菌株的(de)(de)制備方法，其(qi)包(bao)括如下步驟：

1)重組質粒(li)的構(gou)建；

2)雙親雜交；

3)基因(yin)替換突變株(zhu)的篩選(xuan)。

作為優(you)選(xuan)方案，所述重組(zu)質粒的構建包括如下操作：

分別設計用于擴增phzH的上(shang)游(you)同源臂引(yin)物F1和(he)(he)R1、下游(you)同源臂引(yin)物F3和(he)(he)R3，以及(ji)phzO及(ji)其(qi)啟動子(zi)區域總片段的正反(fan)向引(yin)物F2和(he)(he)R2，并擴增相關片段；

通過Infusion體系(xi)連接質粒pK18mobsacB，將phzO基因(yin)與(yu)phzH基因(yin)的上游片(pian)(pian)段和下(xia)游片(pian)(pian)段整(zheng)合在一起；

重組質(zhi)粒轉化大腸桿菌(jun)DH5α感受態細胞；

其中，所述(shu)F1、R1、F2、R2、F3和R3的基因序列分別如SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9、SEQ ID NO10、SEQ ID NO11、SEQ ID NO12所示。

作(zuo)為(wei)優選(xuan)方案(an)，所述Infusion體(ti)系的用(yong)量為(wei)10μL，且Infusion體(ti)系中，pK18mobsacB質粒3uL、infusion酶(mei)2μL、水2μL、phzO基因(yin)1μL、phzH上游同(tong)源(yuan)臂1μL和phzH下(xia)游同(tong)源(yuan)臂1μL。

作為優選方(fang)案(an)，所述雙親雜交包(bao)括如下(xia)操作：

將測(ce)序驗(yan)證(zheng)正確的質粒轉化大腸(chang)桿(gan)菌S17感(gan)受態細胞并(bing)測(ce)序驗(yan)證(zheng)；

將(jiang)綠(lv)針假單胞菌株HT66活化(hua)后，接(jie)(jie)種于(yu)液體KB培(pei)養基中，在28℃下培(pei)養12h；將(jiang)攜帶質粒的(de)大腸(chang)桿菌S17接(jie)(jie)種于(yu)含50mg/L的(de)Kan的(de)LB培(pei)養基中，置(zhi)37℃下180rpm的(de)搖床中培(pei)養12h；

分別(bie)(bie)將(jiang)綠針假單(dan)胞菌HT66和大腸(chang)桿菌S17菌液(ye)離(li)心，以(yi)LB培養(yang)基(ji)分別(bie)(bie)重懸菌體，將(jiang)二者以(yi)1:1的(de)比例(li)混合(he)，并置于28℃培養(yang)箱中(zhong)1h，使其發生接合(he)轉(zhuan)移。

作為優(you)選方案，所述(shu)基因替換突變株的(de)篩(shai)(shai)選依次采用單交(jiao)換陽性克(ke)隆的(de)篩(shai)(shai)選和雙交(jiao)換陽性克(ke)隆篩(shai)(shai)選。

作為優(you)選(xuan)方案，所述單交換陽(yang)性克隆篩選(xuan)包(bao)括如下操作：

將菌株(zhu)HT66與S17的(de)混合菌液離心，棄去部分(fen)上清液，將菌體重懸后稀釋(shi)涂布于含濃(nong)度分(fen)別(bie)為100mg/L的(de)Amp和50mg/L的(de)Kan的(de)LB平板上，置于28℃培養箱(xiang)中培養48h，挑取(qu)菌落以PCR擴增融合片段進行驗證。

作為優選方案(an)，所(suo)述雙交換陽(yang)性(xing)克隆篩(shai)選包括(kuo)如下操作：

挑取單(dan)交換克隆以LB培(pei)養基重懸，并稀(xi)釋涂布(bu)于(yu)含(han)有15％(w/v)蔗糖的(de)LB平板上，置于(yu)28℃培(pei)養箱中(zhong)培(pei)養24h；將(jiang)生長的(de)菌落(luo)分別接(jie)種(zhong)于(yu)LB平板和(he)含(han)50mg/L的(de)Kan的(de)LB平板中(zhong)，接(jie)種(zhong)位(wei)置一一對(dui)應(ying)，置于(yu)28℃培(pei)養箱中(zhong)培(pei)養24h；選擇在(zai)Kan平板上不能(neng)長而(er)在(zai)LB平板生長的(de)菌落(luo)，使用外部(bu)引物F1和(he)R3進行PCR驗證(zheng)。

第三方(fang)面，本發明(ming)還提供(gong)了一種如前述的基因工程(cheng)菌株在制備2-羥基吩嗪中的用途。

所述基因工(gong)程菌株在制備2-羥基吩(fen)嗪時(shi)的條件為：好氧培養；溫度：28～32℃；pH：6～8；轉速150～300rpm。

與現有技術相(xiang)比(bi)，本發明具有如下(xia)的有益效果：

本發明(ming)基于(yu)一株高(gao)產吩嗪(qin)(qin)-1-甲酰胺的(de)綠針假單(dan)胞菌HT66，該菌屬于(yu)植物根際細菌，安(an)全(quan)可靠，營(ying)養需(xu)求(qiu)簡單(dan)，副產物，發酵周期短，經改造后其(qi)吩嗪(qin)(qin)化(hua)合物的(de)產量達到(dao)3500mg/L的(de)水平，具有良好(hao)的(de)工業化(hua)應用潛力。本專利將(jiang)其(qi)中(zhong)的(de)phzH基因替換為(wei)外源的(de)phzO基因，高(gao)濃度(du)的(de)吩嗪(qin)(qin)-1-羧酸(suan)不再轉為(wei)吩嗪(qin)(qin)-1-甲酰胺，而是作為(wei)底(di)物在(zai)PhzO蛋白(bai)在(zai)作用下(xia)轉化(hua)為(wei)高(gao)水平的(de)2-羥基吩嗪(qin)(qin)。

附圖說明

通過閱讀參照以下附圖對(dui)非(fei)限制(zhi)性實施(shi)例所作的詳細描(miao)述(shu)，本發(fa)明的其(qi)它(ta)特征、目(mu)的和(he)優點將會變得更明顯：

圖1為phzO基因與phzH上(shang)(shang)下游同(tong)(tong)源臂(bei)(bei)的(de)擴增(zeng)產物(wu)電泳圖：a、phzO基因的(de)擴增(zeng)片(pian)段(L2)和phzH基因的(de)上(shang)(shang)下游同(tong)(tong)源臂(bei)(bei)(分別(bie)為L1和L3)；b、以外部引(yin)物(wu)F1和R3對重組質(zhi)粒(li)進行(xing)PCR驗(yan)證(zheng)；c、以內(nei)部引(yin)物(wu)F2和R2對此(ci)質(zhi)粒(li)進行(xing)PCR驗(yan)證(zheng)；

圖2為突(tu)變株(zhu)中phzO基因的PCR產物電(dian)泳圖；

圖3為不同綠針假單胞菌(jun)株發酵液的HPLC圖譜：A、HT66菌(jun)株；B、GP72菌(jun)株；C、HT66-S菌(jun)株；

圖4為菌株(zhu)HT66-O與HT66生長曲(qu)線對比圖；

圖5為菌株HT66-O中吩嗪-1-羧(suo)酸的發酵曲線；

圖6為菌株HT66-O中2-羥基吩(fen)嗪(qin)的發酵曲線(xian)。

具體實施方式

下(xia)面結合具體(ti)實施(shi)例對本(ben)發(fa)明(ming)(ming)(ming)進行詳細說明(ming)(ming)(ming)。以下(xia)實施(shi)例將(jiang)有助于本(ben)領域的技(ji)術人(ren)員進一步理解本(ben)發(fa)明(ming)(ming)(ming)，但不以任何形式限制本(ben)發(fa)明(ming)(ming)(ming)。應當指出的是，對本(ben)領域的普(pu)通技(ji)術人(ren)員來說，在(zai)不脫離(li)本(ben)發(fa)明(ming)(ming)(ming)構思的前提下(xia)，還可以做出若(ruo)干(gan)變形和改進。這(zhe)些(xie)都屬(shu)于本(ben)發(fa)明(ming)(ming)(ming)的保(bao)護范圍。

本發(fa)明的綠針(zhen)假單(dan)胞(bao)菌(Psedunomonas choloraphis)HT66，該菌株已在中國典型培(pei)養物保(bao)(bao)藏(zang)中心(簡(jian)稱CCTCC)保(bao)(bao)藏(zang)，保(bao)(bao)藏(zang)單(dan)位地址(zhi)為(wei)：中國.武漢.武漢大學，郵編(bian)為(wei)：430072，保(bao)(bao)藏(zang)日期為(wei)：2013年10月12日，保(bao)(bao)藏(zang)編(bian)號為(wei)：CCTCC NO∶M 2013467。

實施例1

本實施例(li)涉及一種用(yong)于生產2-羥(qian)基吩嗪的基因工程菌株的制備方法，包(bao)括如(ru)下步驟：

根據綠針假單胞(bao)菌GP72基因組中phzO序列設計引物F2(5'GGTACCGAGATAAACATGCTTTGAAGTGC 3'，如SEQ ID NO.9)和R2(5'CTATTTGGCGTTGAGCCCCACCATA 3'，如SEQ ID NO.10)，通過PCR擴增phzO基因并純化；

根據綠針(zhen)假(jia)單胞菌HT66基(ji)因組中phzH基(ji)因的(de)上下游序列設計引(yin)(yin)物(wu)。上游引(yin)(yin)物(wu)為F1(5'ACATGATTACGAATTAGCCGCTGTTGGGTAAAGG 3'，如(ru)SEQ ID NO.7)和R1(5'GTTTATCTCGGTACCTCAGGGTTGCAAACGCC3'，如(ru)SEQ ID NO.8)，下游引(yin)(yin)物(wu)為F3(5'CTCAACGCCAAATAGTACGAGCCTGAGGGAGCCACGGCAG 3'，如(ru)SEQ ID NO.11)和R3(5'CGACTCTAGAGGATCATGGCCGAACCACCCTTGC 3'，如(ru)SEQ ID NO.12)，以該(gai)基(ji)因組DNA為模板，擴增基(ji)因組中的(de)相應片段，其電泳驗(yan)證(zheng)結果見圖(tu)1a。

通過Infusion體(ti)系將(jiang)phzO基(ji)因(yin)(yin)(yin)與(yu)phzH基(ji)因(yin)(yin)(yin)的上游(you)片(pian)段(duan)和下(xia)游(you)片(pian)段(duan)整合在(zai)一起并(bing)連(lian)接質(zhi)粒(li)pK18mobsacB(Infusion體(ti)系10uL，其中pK18mobsacB質(zhi)粒(li)3uL，infusion酶2uL，水(shui)2uL，目的基(ji)因(yin)(yin)(yin)及phzH上下(xia)游(you)同源臂(bei)各1uL)，獲得體(ti)外(wai)突(tu)變質(zhi)粒(li)并(bing)轉化大腸桿菌S17。提取質(zhi)粒(li)后分別以外(wai)部引物(wu)F1和R3對重組質(zhi)粒(li)進行(xing)PCR驗證(zheng)(結(jie)果(guo)見1b)，以內部引物(wu)F2和R2對此質(zhi)粒(li)進行(xing)PCR驗證(zheng)(結(jie)果(guo)見圖(tu)1c)，由此可見phzO基(ji)因(yin)(yin)(yin)(長度為1.8kb)成功(gong)替換(huan)phzH基(ji)因(yin)(yin)(yin)。

將攜帶重組質粒的(de)(de)S17菌株充分活化(hua)，接(jie)(jie)(jie)種(zhong)于(yu)(yu)含(han)有(you)卡那霉(mei)素(su)50mg/L的(de)(de)LB培養(yang)(yang)基中(zhong)，37℃，180rpm培養(yang)(yang)12h。將充分活化(hua)的(de)(de)HT66菌株接(jie)(jie)(jie)種(zhong)于(yu)(yu)LB培養(yang)(yang)基中(zhong)，28℃，180rpm 培養(yang)(yang)12h。5000rpm離心后收集并洗滌(di)兩種(zhong)菌體(ti)，以(yi)LB培養(yang)(yang)基重懸(xuan)。將菌株GP72：S17濃度以(yi)1:1的(de)(de)比例混合，置于(yu)(yu)28℃培養(yang)(yang)箱中(zhong)1h，使其發(fa)生接(jie)(jie)(jie)合轉移。

取(qu)(qu)混合(he)菌液點(dian)在LB平(ping)(ping)(ping)板(ban)(ban)中，28℃培養(yang)24h，刮取(qu)(qu)長出來的(de)混合(he)菌落于(yu)LB中重(zhong)懸，稀釋(shi)涂布于(yu)卡那(nei)霉素50mg/L，氨芐(xia)霉素100mg/L的(de)LB平(ping)(ping)(ping)板(ban)(ban)上，28℃培養(yang)2至3天后(hou)挑(tiao)取(qu)(qu)單克隆涂布于(yu)含15％(w/v)蔗糖的(de)LB平(ping)(ping)(ping)板(ban)(ban)中，28℃培養(yang)1至2天；挑(tiao)取(qu)(qu)蔗糖平(ping)(ping)(ping)板(ban)(ban)上的(de)單克隆，PCR驗(yan)證；挑(tiao)取(qu)(qu)在卡那(nei)霉素50mg/L抗(kang)性平(ping)(ping)(ping)板(ban)(ban)上不生長，但在無抗(kang)平(ping)(ping)(ping)板(ban)(ban)上能夠(gou)正常生長的(de)單菌落，即為(wei)同(tong)源重(zhong)組成(cheng)功(gong)的(de)菌落。將(jiang)該(gai)菌株命名為(wei)HT66-O。

以引物F2和(he)R2對篩選的(de)(de)突變株進行PCR驗證(見圖2)，PCR擴(kuo)增(zeng)片段長度為(wei)1.8kb，與phzO基(ji)因大小一(yi)致，表明(ming)該基(ji)因已成功插(cha)入菌(jun)株HT66的(de)(de)基(ji)因組中(zhong)。

實施例2

本實施例涉及不同綠針假單胞菌合成吩嗪化(hua)合物的比較，具體步驟為：

將三種綠針假單(dan)胞菌GP72、HT66和HT66-O的(de)發酵液(ye)各取1.5mL到(dao)5mL離(li)心(xin)(xin)(xin)管，首先用(yong)6N HCl調節pH值至(zhi)2.0，接著(zhu)用(yong)等(deng)體(ti)積的(de)乙酸乙酯振蕩萃取，然后(hou)將該混合(he)物(wu)在10000×g條(tiao)件(jian)下離(li)心(xin)(xin)(xin)10min，取有機相(xiang)(xiang)到(dao)新的(de)離(li)心(xin)(xin)(xin)管，并加入1/10體(ti)積的(de)去離(li)子水(shui)，振蕩后(hou)靜置分(fen)層。最后(hou)，將有機相(xiang)(xiang)減(jian)壓濃縮至(zhi)干，產物(wu)用(yong)甲醇充分(fen)溶解后(hou)以高壓液(ye)相(xiang)(xiang)色(se)譜(HPLC)分(fen)析(xi)。

HPLC檢測條件(jian)：檢測波(bo)長254nm，C18反(fan)相柱(zhu)，流(liu)速(su)1mL/min，柱(zhu)溫30℃。流(liu)動相：水相為(wei)5mM乙酸銨溶液(ye)，有機相為(wei)甲醇，其混合梯(ti)度見表1。

表1流(liu)動相的(de)混合(he)梯(ti)度(du)

HPLC檢測結果如圖3a、3b和(he)3c所示，根據相關(guan)化合(he)物(wu)(wu)標準品的HPLC圖，吩嗪-1-羧酸(suan)(PCA)的出峰(feng)時(shi)間(jian)為2.8min，PCN的出峰(feng)時(shi)間(jian)為11.7min，2-羥基吩嗪的出峰(feng)時(shi)間(jian)為14.4min。將(jiang)phzH基因(yin)替換為phzO基因(yin)后，菌株HT66-O的發酵(jiao)液中化合(he)物(wu)(wu)PCN消失，而2-羥基吩嗪化合(he)物(wu)(wu)出現。

實施例3

本(ben)實施例涉及綠針假單胞菌基因工程(cheng)菌合成(cheng)2-羥基吩(fen)嗪，具體步(bu)驟為(wei)：

將綠針假單胞菌HT66和HT66-O分別在(zai)固體(ti)KB平板(ban)充分活化，然后(hou)挑取(qu)一環(huan)接種(zhong)(zhong)到裝有(you)5mL KB液體(ti)培(pei)(pei)養(yang)(yang)基(ji)(ji)的(de)小(xiao)瓶中，置于28℃、180rpm的(de)搖床轉速下培(pei)(pei)養(yang)(yang)12h；再(zai)按1％比例放大(da)接種(zhong)(zhong)到裝有(you)50mL KB液體(ti)培(pei)(pei)養(yang)(yang)基(ji)(ji)的(de)250mL三角(jiao)瓶中，于28℃、180rpm的(de)條件下發酵培(pei)(pei)養(yang)(yang)。定(ding)時取(qu)樣，用分光光度(du)計測波長(chang)600nm處的(de)光密度(du)值，即OD600，用以(yi)表示細菌生長(chang)情況，并(bing)繪制菌株的(de)生長(chang)曲線(xian)(如圖4)。結(jie)果表明，將基(ji)(ji)因phzH替(ti)換為phzO后(hou)，菌株的(de)生長(chang)并(bing)未發現明顯的(de)變化，有(you)利于繼續(xu)合成吩嗪化合物。

將發(fa)酵(jiao)液樣品(pin)進行(xing)預處(chu)理后(hou)以HPLC分(fen)析，測定其中(zhong)(zhong)吩(fen)嗪(qin)化(hua)合(he)物的(de)產(chan)(chan)量(liang)，吩(fen)嗪(qin)-1-羧酸和2-羥(qian)基(ji)(ji)(ji)(ji)吩(fen)嗪(qin)的(de)產(chan)(chan)量(liang)分(fen)別如圖5和圖6所(suo)示。結(jie)合(he)圖3的(de)分(fen)析結(jie)果可知，當(dang)phzH基(ji)(ji)(ji)(ji)因替(ti)換(huan)為phzO基(ji)(ji)(ji)(ji)因后(hou)，菌(jun)(jun)株(zhu)HT66-O的(de)發(fa)酵(jiao)液中(zhong)(zhong)吩(fen)嗪(qin)化(hua)合(he)物的(de)總(zong)量(liang)及2-羥(qian)基(ji)(ji)(ji)(ji)吩(fen)嗪(qin)的(de)產(chan)(chan)量(liang)均(jun)高于綠(lv)針假單胞(bao)菌(jun)(jun)GP72發(fa)酵(jiao)液中(zhong)(zhong)對應的(de)吩(fen)嗪(qin)產(chan)(chan)量(liang)，表明該基(ji)(ji)(ji)(ji)因工程菌(jun)(jun)有利于進行(xing)2-羥(qian)基(ji)(ji)(ji)(ji)吩(fen)嗪(qin)的(de)制備(bei)。

以(yi)上對本發明(ming)(ming)的具體實施(shi)例進行了描(miao)述(shu)。需(xu)要理解的是，本發明(ming)(ming)并不局限(xian)于(yu)上述(shu)特定實施(shi)方式，本領域技術人員可以(yi)在(zai)權利要求的范圍內做出各種(zhong)變(bian)形或修改，這并不影響(xiang)本發明(ming)(ming)的實質內容(rong)。