專利名稱：一種純化重組人血白蛋白的方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域；更具體地，本發明涉及一種純化重組人血白蛋白 (rHSA)的方法。
背景技術：
人血清白蛋白是血漿中的主要蛋白成分，由585個氨基酸組成，分子量為66kD。人血清白蛋白在血液中主要作用是維持正常滲透壓，與鈣離子、脂肪酸、氨基酸、膽紅素和各種藥物相結合，并起到轉運載體的作用。臨床上人血清白蛋白常用于外科手術、出血性休克、燙傷、腎病綜合征導致的白蛋白缺乏癥、腫瘤肝腹水等疾病的治療。一直以來，人血清白蛋白是從人血液中純化得到的。由于血源匱乏和病毒(肝炎、AIDS)污染等原因，基因重組人血清白蛋白在近十年中得到了國內外大型制藥公司的重視。近年來，采用基因重組的方法，在酵母菌(USP5, 330，901、JPl 1-509525、JP6-100592)、 大腸桿菌(Lawn, R. Μ. Construction of DNA sequencesand their use for microbial production of proteins, in particular human serumalbumin "European Patent App 1. ”(1983)73，口646)、轉基因牛奶(W09602573A1 SEPARATION OF HUMAN SERUM ALBUMIN) 中表達和純化出人血清白蛋白。然而，人血清白蛋白的臨床治療中的給藥劑量較大，一般情況下為5 IOg/劑量之間，所以與微量給藥的常規重組藥物相比，雜質產生的副作用成為十分嚴重問題。因此， 對于基因重組白蛋白比目前市場上的人血清白蛋白和其他基因重組藥品的制劑的純度要高度多。到目前為止僅有日本三菱制藥株式會社的畢赤酵母發酵的rHSA在2008年上市， 商品名=MEDWAY 。解決rhSA的主要難點，就是建立超高純度(純度高于99% )和良好的經濟性(成本不高于血液純化的白蛋白)rHSA的制備方法。野田宗宏等人在專利CNl 127299A和CNl364643A中描述了酵母發酵后利用加熱發酵液、稀釋、調酸、擴張床陽離子(STREAMLINE SP-GE Healthcare公司專為擴張床設計的商品化樹脂)層析、加熱、疏水層析、螯合吸附、陰離子交換、硼酸鈣沉淀等步驟得到高純度 rHSA的方法。該方法中，第一步加熱的目的是滅活蛋白酶，否則陽離子交換樹脂需要的酸性條件將激活蛋白酶的活性，從而在純化過程中降解rHSA。該方法稀釋的目的是降低離子強度以達到Mreamline SP能夠吸附的效果。但是，該方法的缺點是加熱滅活使得過程延長； 調酸激活蛋白酶活性導致rHSA降解風險；大體積稀釋使得純化的溶液體積增加，從而需要擴大純化設備的規模，純化過程延長。這樣將導致rHSA產品的收率減少，成本增加，產品的品質有可能下降，產品染菌的風險增加等等問題。柴田伸一等人在中國專利CN1934128A中公開了一種在2價陽離子存在下通過加熱處理制備人血清白蛋白的方法，野內俊伸等人在中國專利CN1406M6A中公開了包括加熱處理步驟的人血清白蛋白的制造方法。然而，上述方法均存在處理條件復雜，固液分離效率不高，獲得的產物純度不高等缺點。因此，目前還需要進一步開發更理想的純化重組人血清白蛋白的方法，以滿足生產所需和臨床所需。

發明內容
本發明的目的在于提供一種純化重組人血白蛋白(rHSA)的方法。在本發明的第一方面，提供一種純化重組人血清白蛋白的方法，所述方法包括(a)將含有重組人血清白蛋白的發酵液上樣到含有吸附劑的流化床，使得吸附劑選擇性吸附所述重組人血清白蛋白；其中，所述的吸附劑是陰離子交換樹脂；以及(b)回收被吸附的重組人血清白蛋白。在一個優選例中，在進入含有吸附劑的流化床前，所述的含有重組人血清白蛋白的發酵液不經過加熱處理。在另一優選例中，上樣前，將所述的含有吸附劑的流化床調節pH7. 0-8.0;較佳地，用緩沖液平衡至PH7. 0-8. 0 ；或上樣后，將吸附了所述重組人血清白蛋白的含有吸附劑的流化床調節pH7. 0-8. 0 ； 較佳地，用PH7. 0-8. 0的緩沖液清洗。在另一優選例中，上樣前，所述的含有吸附劑的流化床調節pH7. 0-7.5 ；或上樣后，吸附了所述重組人血清白蛋白的含有吸附劑的流化床調節PH7. 0-7.5。在另一優選例中，所述的陰離子交換樹脂是Mreamline陰離子交換樹脂。在另一優選例中，所述的Mreamline陰離子交換樹脂選自=Streamline Q， Streamline Q XL,或 Streamline DEAE0在另一優選例中，步驟(b)中，還包括依次采用以下方法進一步純化(1)疏水層析；⑵脫色；⑶葡聚糖凝膠過濾；⑷陰離子交換樹脂層析。在另一優選例中，步驟O)中包括(i)采用硼酸或硼酸鹽和二價金屬離子處理經疏水層析的樣液，然后加熱至 60士20°C ；較佳地60士 10°C ；更佳地60士5°C。較佳地，加熱2士 1小時，過濾收獲濾過液；(ii)將濾過液進行大孔樹脂脫色，得到經脫色的樣液。在另一優選例中，在(i)和(ii)之間，還包括步驟對濾過液進行超濾。在另一優選例中，二價金屬離子選自Ca2+或Mg2+ ；或硼酸或硼酸鹽的濃度為1 500mM ；較佳地為10 200mM ；更佳地為50士20mM ；最佳地為50 士 IOmM ；或二價金屬離子的濃度在1 500mM之間；較佳地為10 80mM ；更佳地為 30 士 20mM ；最佳地為 30 士 10mM。在另一優選例中，所述的大孔樹脂是含有氨基和羥基的共聚高分子多孔樹脂。在另一優選例中，疏水層析的配基選自苯基，脂肪族或雜環。在另一優選例中，疏水層析的純化方式為流穿。在另一優選例中，所述的葡聚糖凝膠過濾采用Superdex系列或kphadex G系列。 更佳地，所述的葡聚糖凝膠kphadex G75。在另一優選例中，陰離子交換樹脂層析的樹脂包括DEAE、QAE、Q配基。本發明的其它方面由于本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。


圖1、擴張床Mreamline Q XL處理后rHSA的樣品峰。圖 2、Phenyl Sepharose (H Sub)疏水層析后 rHSA 的樣品峰。圖3、大孔脫色樹脂XSC700處理后rHSA的樣品峰。圖4、DEAE Sepharose FF陰離子層析處理后rHSA的樣品峰。
具體實施例方式本發明人經過廣泛的研究，開發出一種將發酵液不經加熱處理，直接用含有吸附劑(陰離子樹脂)的流化床進行固液分離，再經過多個純化步驟獲得超高純度的重組人血白蛋白的方法。如本文所用，所述的重組人血清白蛋白(rHSA)是指通過重組技術產生的人血清白蛋白。即將編碼人血清白蛋白的DNA導入到合適的宿主細胞中，在適于表達的條件下培養該細胞，從而產生重組人血清白蛋白。所述的宿主細胞選自細菌(如大腸桿菌和枯草桿菌)，酵母(如啤酒酵母、巴斯德畢赤酵母和克魯維氏等)，植物細胞，動物細胞。優選的微生物是巴斯德畢赤酵母。較佳地，所述的重組人血清白蛋白被分泌到胞外。本發明提供一種純化重組人血清白蛋白的方法，所述方法包括(a)將含有重組人血清白蛋白的發酵液上樣到含有吸附劑的流化床，使得吸附劑選擇性吸附所述重組人血清白蛋白；其中，所述的吸附劑是陰離子交換樹脂；以及(b)回收被吸附的重組人血清白蛋白。本發明人發現，在固液分離前進行加熱處理，會導致雜質凝集，不利于后續的分離，且去除凝集物的步驟也很復雜，直接影響到提取率以及純化效果。此外，在固液分離前進行酶抑制劑處理，會導致成本大大提高(酶抑制劑價格高昂)，以及引入外部污染物的結果。而本發明的方法不同于現有技術中常規的純化方法，在進入含有吸附劑的流化床前，所述的含有重組人血清白蛋白的發酵液不經過加熱處理，也不經過酶抑制劑處理。所述的含有吸附劑的流化床中，吸附劑是陰離子交換樹脂，較佳地是Mreamline 陰離子樹脂。其在堿性條件下對rHSA有很好的吸附和分離性能，不需要對弱堿性的發酵液進行調酸，因而不會激活蛋白酶造成對目標蛋白的降解，同時也避免了酸性條件下rHSA 的聚合反應。采用堿性條件還可以節省以后純化過程中的解聚合步驟。因此，上樣前，將所述的含有吸附劑的流化床調節PH7. 0-8. 0 ；較佳地，用緩沖液平衡至pH7. 0-8. 0 ；更佳地調節pH7. 0-7. 5;或上樣后，將吸附了所述重組人血清白蛋白的含有吸附劑的流化床調節 pH7. 0-8. 0 ；較佳地，用pH7. 0-8. 0的緩沖液清洗；更佳地調節pH7. 0-7. 5。所述的Streamline 陰離子交換樹脂選自Streamline Q, Streamline Q XL，或 Streamline DEAE。更佳地，所述的Mreamline陰離子樹脂優選Sreamline XL陰離子樹脂 (GE Healthcare公司)，該樹脂的蛋白載量提高的將近5 10倍，在較寬的pH范圍內和高離子強度下都有很好的吸附性能。固液分離之后，還可以對獲得的重組人血清白蛋白進行進一步的純化，可以采用本領域技術人員熟知的多種蛋白純化方法進行。本發明人對固液分離之后的蛋白純化也進行了深入的研究和優化，找到了較佳的純化方法。因此，作為本發明的優選方式，固液分離后，還包括依次采用以下方法進一步純化(1)疏水層析；(2)脫色；(3)葡聚糖凝膠過濾；(4)陰離子交換樹脂層析。按照上述的純化次序進行重組人血清白蛋白的進一步純化，純化效果非常理想，且得率高。本發明對于疏水層析的方法沒有特別的限制。較佳地，疏水層析的配基選自苯基，脂肪族或雜環。較佳地，疏水層析的純化方式為流穿。例如，可采用Wienylkpharose (H Sub)柱(GE公司)進行。脫色也可采用本領域技術人員熟知的方法，只要該方法能夠有效去除發酵液中的各種色素和含有顏色的物質。然而，本發明人發現，在硼酸或硼酸鹽的存在下，二價的金屬離子在加熱后有更好的去除色素結合白蛋白的能力。因此，作為本發明的優選方式，脫色方法包括(i)采用硼酸或硼酸鹽和二價金屬離子處理經疏水層析的樣液，然后加熱至 60士20°C，較佳地60士 10°C ；更佳地60士5°C ；較佳地加熱2士 1小時，過濾收獲濾過液；(ii) 將濾過液進行大孔樹脂脫色，得到經脫色的樣液。采用所述優選的脫色方法，A350/A280值低，脫色效果更為理想。作為本發明的更為優選的方式，在(i)和(ii)之間，還包括步驟對濾過液進行超
濾ο作為本發明的更為優選的方式，所述的二價金屬離子選自Ca2+或Mg2+。作為本發明的更為優選的方式，硼酸或硼酸鹽的濃度為1 500mM;較佳地為 10 200mM ；更佳地為50士20mM ；最佳地為50士 IOmM ；或二價金屬離子的濃度在1 500mM 之間；較佳地為10 80mM ；更佳地為30士20mM ；最佳地為30士 10mM。本發明中硼酸鹽包括原硼酸、偏硼酸、四硼酸或它們生成的鹽及其水合物，比如四水硼酸鈉和六水硼酸鈉等。作為本發明的更為優選的方式，所述的大孔樹脂是含有氨基和羥基的共聚高分子多孔樹脂。在脫色步驟的加熱過程中，還可加入辛酸鈉作為保護劑；或可加入乙酰半胱氨酸、 半胱氨酸等還原劑，放置rHSA聚合；也允許加入鹽酸胍、氨基鹽酸胍等裂解劑，解聚已經聚合的rHSA。所述的硼酸或硼酸鹽與二價金屬離子加熱處理步驟在rHSA純化流程中允許在不同的階段進行。葡聚糖凝膠過濾也可采用本領域技術人員熟知的技術。作為本發明的優選方式， 所述的葡聚糖凝膠過濾采用Superdex系列或kphadex G系列。更佳地，所述的葡聚糖凝膠 Sephadex G75。陰離子交換樹脂層析也可采用本領域技術人員熟知的技術。作為本發明的優選方式，陰離子交換樹脂層析的樹脂包括DEAE、QAE、Q配基。在收獲rHSA后，可以采用本技術領域熟知的技術進行蛋白純度的分析，所述的方法包括但不限于HPLC，柱子 G3000SWxl(7. 8mm IDx30cm, Tosoh 公司)，UV 280nm。色度的分析可以采用紫外分光光度計。將重組人血白蛋白用超純水稀釋，使其在 ^Onm的吸光度值在0.3 0.7之間。以超純水為空白，測量^Onm吸光度值。將重組人血白蛋白用超純水稀釋，使其在350nm吸光度值在0. 3 0. 7之間。以超純水為空白，在 330-520nm范圍內掃描。選取350nm吸光度值。研究A350/A280值=(350nm的吸光度值X 稀釋倍數)/ (280nm的吸光度值X稀釋倍數)。可以采用本技術領域熟知的技術進行蛋白濃度的分析，例如可采用BCA檢測試劑盒(BCA Protien Assay Kit, Thermo)。本發明的主要優點在于(1)本發明提供了一種在較短時間和較少的工藝流程將rHSA提純到一個超高純度水平的簡單方法。固液分離前，發酵液不需要加熱，在上柱前不稀釋或同步少量稀釋即可快速進SMreamline陰離子樹脂的固液分離、濃縮和初步純化。本發明克服了現有技術中必須加熱滅活蛋白酶才能進行固液分離的技術缺陷。(2)本發明還對固液分離之后的進一步純化步驟也進行了優化，找到了較佳的純化次序。(3)本發明還優化了脫色方法，使得蛋白脫色效果非常理想。下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如 Sambrook 等人，分子克隆實驗室指南(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。實施例1、重組菌的構津和表汰GSl 15畢赤酵母菌株(來自ATCC)，由pPIC9K(購自Invitrogen)多克隆位點插入全長的HSA cDNA片段(參見GenBank登錄號AF190168。將Ml I酶線形化的rHSA表達質粒用電穿孔法轉化GSl 15菌株，涂MD平板，取菌落接種在含200微升YPD培養基的96孔板中，30°C培養2天，取10微升轉接于含190微升YPD的96孔新板中，過夜培養。同上稀釋一次后，取1微升菌液分別點樣于G418濃度為0. 5 8mg/ml的YPD平板。挑抗性克隆于BMGY培養基中30°C振蕩培養至D6tltl為2 6時，離心收菌體并懸于1/5 1/10的BMMY 培養基中繼續培養，每天補甲醇進行誘導表達。將培養上清進行SDS-PAGE篩選出高表達菌株。(參見《軍事醫學科學院院刊》2001年9月第25卷第三期第202 204頁)。將一管篩選出擴增制備后凍存的重組rHSA畢赤酵母菌株在30°C水浴融解后，無菌轉移到含有200mL YPD培養基的三角搖瓶。密封搖瓶并放置到30°C的搖床中，搖動震蕩培養M小時。到時后，將種子培養無菌轉移到含5LYPD培養基的10L發酵罐中。通氣、攪拌開始發酵30°C，M小時。然后將培養液無菌轉移到1. 2m3的發酵罐中，先期加入含甘油的 YPD培養基培養48小時，待甘油消耗完畢后，加入含甲醇的YPM培養基和SM培養基誘導產生rHSA,培養250小時，得到含rHSA 8. 5g/L的培養液。實施例2、固液分離重組的含rHSA基因的巴斯德畢赤酵母菌，通過高密度發酵，得到表達量為 8. 5g (rHSA)/L的培養液。取20L該培養液，用蒸餾水稀釋20% (24L)左右(；稀釋的目的是增加流動性)，直接進樣到Mreamline Q XL柱(Direct95/1. 7柱，95mmX 170cm，凝膠體積 2500mL,GE公司)，400cm/h流速，該柱預先用20mM磷酸鈉緩沖液(pH 7. 4)平衡，在進樣完成后用同樣的20mM磷酸鈉緩沖液(pH 7.0)清洗。然后用20mM磷酸鈉緩沖液+1. OM NaCl 溶液洗脫，流速200cm/h，收集含rHSA的樣品峰(6. 2L)。見圖1。
實施例3、疏水純化將實施例2中得到的初步純化的rHSA直接進樣到Wienylkpharose (H Sub)柱 (500mmX25cm,GE公司)，該柱預先用50mM磷酸_150mM氯化鈉緩沖液(pH 6. 9)平衡，上樣完成后，用相同的平衡換沖液洗滌，當含rHSA流穿液出現后，開始收集樣品(12. 7L)。見圖 2。實施例4、硼酸鈉+氯化鈣加熱沉淀脫色純化將實施例3中得到的含rHSA的溶液，加入終濃度到IOmM辛酸鈉，50mM硼酸鈉，用 20% (w/v)氫氧化鈉調節pH到9. 5，放置4小時。然后加入氯化鈣至終濃度30mM，用20% 氫氧化鈉調節PH到9. 5，60°C加熱2小時。用壓濾得到澄清的溶液(13. 5L)。實施例5、超濾將實施例4中得到含rHSA的溶液，用截流分子量IOkDa的超濾膜超濾，濃縮，然后對蒸餾水除鹽超濾，得到2. IL的溶液。實施例6、脫代用大孔脫色樹脂XSC700(西安電力樹脂廠)柱(300mmX 300mm)脫色，該脫色柱預先用PH 3的醋酸溶液平衡，將實施例5得到的含rHSA的溶液(用50% (ν/ν)醋酸調pH到 4. 5)泵入，并循環16小時。循環完成后，用蒸餾水洗脫吸附的rHSA蛋白，得到3. 9L的脫色 rHSA溶液。見圖3。實施例7、除內毒素、核酸、小分子物質和除鹽將實施例6中得到的含rHSA溶液(用2M的NaOH調pH到6. 9)，泵入kphadex G75 (200mmx300mm, GE公司)柱中，蒸餾水洗脫，得到7. 8L的rHSA溶液。實施例8、陰離子純化將實施例7中得到的含rHSA的溶液，載入到預先用IOOmM磷酸鹽緩沖液pH7. 2 平衡好的DEAE Sepharose FF XK 50/20柱(GE公司)，載入完成后用平衡液洗滌，然后用 IOOmM磷酸鹽+0. 5M NaCl (0 - 100% )梯度洗脫，得到17. 2L的rHSA溶液。見圖4。米用文獻(ffataru Ohtani, ^Toyoo Ohda, Akinori Sumi, Kaoru Kobayashi, andTakao Ohmura. Analysis of Pichia pastoris Components in Recombinant HumanSerum Albumin by Immunological Assays and by HPLC with PulsedAmperometric Detection, Anal. Chem. 1998，70，425-429)方法測得畢赤酵母宿主的含量 < lng/ ml(250mg/ml)。獲得的rHSA的純度達到大于99. 999999%實施例9、固液分離2重組的含rHSA基因的巴斯德畢赤酵母菌(GS115)，通過高密度發酵，得到表達量為9. 2g (rHSA)/L的培養液。取20L該培養液，直接進樣到Mreamline QXL柱 (Direct95/1. 7柱，95_xl70cm，凝膠體積2500mL)，400cm/h流速，該柱預先用20mM磷酸鈉緩沖液(PH 7.4)平衡，在進樣完成后用同樣的20mM磷酸鈉緩沖液(pH 7.0)清洗。然后用 20mM磷酸鈉緩沖液+1. OM NaCl溶液洗脫，流速200cm/h，收集含rHSA的樣品峰(8. 8L)。實施例10、硼酸鹽與氯化鈣的脫餼試驗將實施例9中得到的含rHSA的溶液8. 8L，分成四份。第一份加入終濃度到IOmM辛酸鈉，50mM硼酸鈉，用20% (w/v)氫氧化鈉調節pH到9. 5，放置4小時。然后加入氯化鈣至終濃度30mM，用20%氫氧化鈉調節pH到9. 5，60°C 加熱2小時。過濾得到澄清的溶液。第二份加入終濃度到IOmM辛酸鈉，50mM硼酸鈉，用20%氫氧化鈉調節pH到9. 5， 放置4小時。然后加入氯化鈣至終濃度30mM，用20%氫氧化鈉調節pH到9. 5，常溫放置2 小時。過濾得到澄清的溶液。第三份加入終濃度到IOmM辛酸鈉，50mM硼酸鈉，用20%氫氧化鈉調節pH到9. 5， 放置4小時，然后再60°C加熱2小時。過濾得到澄清的溶液。第四份加入氯化鈣至終濃度30mM，用20%氫氧化鈉調節pH到9. 5，60°C加熱2小時。過濾得到澄清的溶液。計算上述處理后的溶液的A350/A280值，值越低表示脫色效果越好。具體的不同純化結果見表1。表1不同條件下的純化結果
權利要求
1.一種純化重組人血清白蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括(a)將含有重組人血清白蛋白的發酵液上樣到含有吸附劑的流化床，使得吸附劑選擇性吸附所述重組人血清白蛋白；其中，所述的吸附劑是陰離子交換樹脂；以及(b)回收被吸附的重組人血清白蛋白。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，上樣前，將所述的含有吸附劑的流化床調節 ρΗ7· 0-8. 0 ；或上樣后，將吸附了所述重組人血清白蛋白的含有吸附劑的流化床調節ΡΗ7. 0-8.0。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的陰離子交換樹脂是Mreamline陰離子交換樹脂。
4.如權利要求3所述的方法，其特征在于，所述的Mreamline陰離子交換樹脂選自 Streamline Q, Streamline Q XL,或 Streamline DEAE0
5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(b)中，還包括依次采用以下方法進一步純化⑴疏水層析；⑵脫色；⑶葡聚糖凝膠過濾；⑷陰離子交換樹脂層析。
6.如權利要求5所述的方法，其特征在于，步驟O)中包括(i)采用硼酸或硼酸鹽和二價金屬離子處理經疏水層析的樣液，然后加熱至 60士20°C，過濾收獲濾過液；和( )將濾過液進行大孔樹脂脫色，得到經脫色的樣液。
7.如權利要求6所述的方法，其特征在于，在(i)和(ii)之間，還包括步驟對濾過液進行超濾。
8.如權利要求6所述的方法，其特征在于，二價金屬離子選自Ca2+或Mg2+;或硼酸或硼酸鹽的濃度為1 500mM ；或二價金屬離子的濃度在1 500mM之間。
9.如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述的大孔樹脂是含有氨基和羥基的共聚高分子多孔樹脂。
10.如權利要求5所述的方法，其特征在于，疏水層析的配基選自苯基，脂肪族或雜環。
全文摘要
本發明涉及一種純化重組人血白蛋白(rHSA)的方法。該方法包括將發酵液不經處理，直接用擴張床陰離子柱一步層析達到固液分離、濃縮和初步純化的三個層析純化作用。再經過加熱、疏水層析、陽離子交換、超濾、螯合、沉淀等步驟獲得超高純度的重組人血白蛋白。
文檔編號C07K1/18GK102190722SQ20101012493
公開日2011年9月21日 申請日期2010年3月16日 優先權日2010年3月16日
發明者朱威, 陳忠, 項煒 申請人:上海安睿特生物醫藥科技有限公司