一種低刺激性多肽和寡肽的制備和在化妝品領域的應用的制作方法
【專利摘要】本發明提供了一種酶解基因重組膠原蛋白制備寡肽的方法。本方法是利用二步酶解膠原蛋白，即堿性蛋白酶和中性蛋白酶先后連續水解膠原蛋白，反應后5000-8000rpm冷凍離心15-30min，再用截留分子量為5KDa、4KDa、3KDa、2KDa、1KDa逐級進行分離純化，之后再通過截留分子量為500Da的納濾膜，得到分子量更小的寡肽。得到的寡肽經透皮吸收，促使人體真皮層膠原蛋白的合成，因其來源是基因重組人膠原蛋白，主要功能結構與人膠原蛋白非常接近，在撫平皺紋，改善肌膚彈性的同時，可最大程度的降低其對人體的敏感性和刺激性，使其更安全，可廣泛應用于化妝品領域。
【專利說明】一種低刺激性多肽和寡肽的制備和在化妝品領域的應用
【技術領域】[0001]本發明屬于生物酶催化領域。具體為利用酶催化水解基因重組膠原蛋白，發明了一種兩種酶分步連續催化水解基因重組膠原蛋白制備小分子肽的方法。
【背景技術】
[0002]膠原蛋白是存在于動物結締組織中的主要成分，是動物體內含量最多的蛋白質，在動物的皮膚組織、骨骼等部位含量豐富。當今市場上，膠原蛋白的來源主要有魚源膠原蛋白，包括魚皮和魚鱗的；豬皮來源的，微生物來源的，還有基因工程菌來源的。膠原蛋白小分子肽是膠原蛋白水解后的產物，具有較高的消化吸收性，對促進皮膚組織真皮層膠原蛋白的合成作用顯著，對祛除皮膚皺紋，改善皮膚彈性效果明顯。近年來，國內外的諸多研究表明，膠原蛋白小分子肽除了具有很高的營養特性外，依其結構、分子量及氨基酸種類的不同還具有一些特殊的生理功能，如保護胃黏膜和抗潰瘍作用，抗過敏作用，抑制血壓上升作用，促進骨骼形成、促進皮膚膠原新陳代謝等作用。除此之外，膠原蛋白小分子肽還有良好的加工特性和保濕性。故在制藥行業、食品行業、保健品行業、生物醫療器械行業、化妝品行業有著廣闊的應用空間。膠原蛋白多肽和寡肽應用在化妝品中有如下功效:
[0003](I)保濕，膠原蛋白多肽及寡肽鏈中含有大量的親水基團(氨基、羥基、羧基等)，處于分子立體結構的表面，能吸收大量的水分，在皮膚表面形成皮膜，對皮膚具有良好的保濕性，而且其保濕作用不受環境(溫度、濕度等)變化的影響。
[0004](2)營養，皮膚的滲透性強，可透過角質層與皮膚上皮細胞結合，參與和改善皮膚細胞的代謝，使皮膚中的膠原蛋白活性加強，保持角質層水分及纖維結構的完整性，改善皮膚細胞生存環境和促進皮膚組織的新陳代謝，增強血液循環，達到滋潤皮膚的目的。
[0005](3)抗衰除皺，膠原蛋白寡肽可直接滲透到肌膚真皮中補充流失的膠原質，重整肌膚纖維組織結構，促進細胞新陳代謝，延緩細胞衰老。
[0006](4)美白，膠原蛋白多肽可抑制酪氨酸酶的活性，減少黑色素的生成，在美白肌膚、修復嫩膚等方面有很好的效果。
[0007](5)修復，直接滲入肌膚底層，可協助細胞制造膠原蛋白的成膠原細胞，促使皮膚細胞正常成長，還具有消炎和更新肌膚的作用。
[0008](6)抗刺激，基因重組膠原蛋白寡肽與皮膚具有良好的相容性，增強皮膚的抗刺激能力。
[0009]目前，國內膠原蛋白小分子肽來源主要是魚皮、魚鱗、豬皮等，由于魚源、豬皮、微生物來源的膠原蛋白基因結構與人的膠原蛋白基因結構相差較大，故利用以上來源的膠原蛋白制備的小分子肽在氨基酸數量、排列順序及結構上存在差異，在應用于人體的過程中較易引起過敏或不適反應，對人體的刺激性較大。因此，基因重組膠原蛋白作為膠原蛋白小分子肽的蛋白來源在根源上解決了這個問題。
[0010]國內外制備膠原蛋白小分子肽主要采用酶法，酶法反應條件溫和，生產成本較低。酶法應用較多的有單酶水解、復合酶水解等,單酶水解存在水解率低,水解效果不好,分離提取困難等不利因素；復合酶水解存在水解效率較低，反應條件不能兼顧等缺點。在生產工藝上存在如下缺點:(I)酶解前處理工藝繁瑣，如常需要堿液浸泡等；(2)能耗大，環境污染嚴重，產物提純難；(3)采用水/有機溶劑雙相催化體系的工藝中常會有有機溶劑殘留，影響產品質量。因此，研究開發基因重組膠原蛋白小分子肽的制備新工藝，對膠原蛋白小分子肽在醫藥、保健、食品、化妝品等各行業廣泛應用具有十分重要的現實意義。

【發明內容】

[0011]本發明是為了解決上述現有工藝中存在的不足和技術上的缺陷，開發出一種工藝簡單、水解效率高、生產成本低、環保、產物易分離，二步連續酶水解制備膠原蛋白小分子肽的新工藝；同時由于利用基因重組膠原蛋白來水解制備小分子肽，解決了由于魚皮、魚鱗、豬皮等來源的膠原蛋白小分子肽較易引起的人體不適的問題。
[0012]一種二步水解基因重組膠原蛋白制備小分子肽的方法:將基因重組膠原蛋白溶解于生理鹽水中，使其質量分數為2% -10%、最佳5% _8%，采用兩步連續水解的方法。充分攪拌溶解后，置于50-60°C，最佳55 1:的水浴中，攪拌狀態下，用lmol/L的氫氧化鈉調節pH值至9.5-10.5、最佳10.0，按3000-8000U/g、最佳5000 U/g的添加量加入堿性蛋白酶，常壓下恒溫攪拌反應3-6h、最佳4h，攪拌槳采用具有呈45°角固定平面槳葉的斜葉攪拌槳，剪切力較低且可實現底物和酶充分混合，攪拌轉速控制在50-200rpm，第一步反應后pH值維持在6.5-8.0之間。
[0013]將第一步反應液置于85°C -95°C水浴中，攪拌保溫5-10min滅酶。再將其置于45-55°C、最佳50°C的水浴中，攪拌狀態下(攪拌槳和轉速同上)用0.lmol/L氫氧化鈉或
0.lmol/L的鹽酸微調pH值至7.0-8.0、最佳7.5，按2000_5000U/g、最佳3000 U/g的添加量加入中性蛋白酶，常壓下恒溫攪拌反應2-4h、最佳2h。反應完成后置于85°C _95°C水浴中，攪拌保溫5-10min滅酶。
`[0014]反應物經過5000-8000rpm冷凍離心15_30min，去除未反應的基因重組膠原蛋白和酶蛋白，所得的上清液用不同截留分子量的超濾膜和納濾膜進行濃縮、分離，可得到不同分子量的基因重組膠原蛋白小分子肽。
[0015]將上清液通過截留分子量為5KDa的超濾膜，進出口壓差不超過0.3MPa，循環過濾，收集未透過液，真空冷凍干燥得到分子量大于5KDa的多肽；透過液收集后以同樣的壓差通過截留分子量為4KDa的超濾膜，循環過濾，收集未透過液，真空冷凍干燥得到4KDa<分子量< 5KDa的多肽，依次即可得到3KDa <分子量< 4KDa、2KDa <分子量< 3KDa、lKDa<分子量< 2KDa的多肽。超濾后的透過液再進行納濾，截留分子量500Da，即可得到分子量500 Da-1K Da 的寡肽。
[0016]與現有技術相比較，本發明具有以下優點:
[0017](I)采用二步連續水解法，第一步水解之后，立即進行第二步水解，每一步水解都可滿足酶反應的最適條件，使得酶與底物充分反應，水解效果大大提高。
[0018](2)比現有的工藝所用的水解時間大大縮短，節能降耗，降低單位生產成本，使產品更具市場競爭力。
[0019](3)由于膠原蛋白是基因重組膠原蛋白，與人膠原蛋白無限接近，所以水解所得的小分子肽更適合人類使用，最大限度的避免了過敏、刺激和不適癥狀。[0020](4)寡肽的分離和純化是用物理方法-超濾和納濾，分離效果好，效率高，操作簡單，可完全自動化，更重要的是對產品沒有任何的損害，更不會有化學試劑的殘留，不影響產品質量，進一步降低了引起刺激性的可能性。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1是基因重組膠原蛋白二步酶解制備小分子肽工藝流程圖。
【具體實施方式】
下面結合圖1通過實施例進一步作出說明。
[0022]實施例:
[0023]準確稱量8.0Og基因重組膠原蛋白并將其溶解于裝有92g生理鹽水的容器中，置于50-60°C、最佳55°C的水浴中，開啟攪拌至100-250rpm，用滴管滴加lmol/L的氫氧化鈉，通過pH計檢測pH值為9.50-10.50 ;稱取2.5g堿性蛋白酶(標示活力200000U/g)，加生理鹽水至25g配制成10%的酶溶液，然后將25g、10%的酶溶液加入蛋白溶液中，使反應體系中酶濃度達到3000-8000U/g、最佳5000 U/g，恒溫攪拌狀態下反應4h。反應后，立即放入85-950C的水浴中，恒溫保持5-10min，滅酶。
[0024]待溫度降至45-55°C時，將其放入50°C的水浴中，用pH計檢測體系pH值，若pH值超出中性蛋白酶最適范圍，則在攪拌狀態下，用0.lmol/L氫氧化鈉或0.lmol/L的鹽酸微調pH值至7.00-8.00 ;稱取1.5g中性蛋白酶(標示活力200000U/g)，加生理鹽水至15g配制成10%的酶溶液，然后將15g、10%的酶溶液加入反應體系中，使反應體系中酶濃度達到3000U/g,恒溫攪拌 狀態下反應3h。反應后，立即放入85-95°C的水浴中，恒溫保持5_10min，滅酶。
[0025]5000-8000rpm 冷凍離心 15_30min,取上清。
[0026]準備超濾膜和納濾膜，濾膜要用專用膜清洗劑循環清洗至少40_60min，之后消毒。開始過膜，將上清液通過截留分子量為5KDa的超濾膜，排除超濾體系內的空氣，保持進出口壓差在0.10-0.3MPa之間，循環過濾，收集截留液，真空冷凍干燥后即可得到該級多肽，透過液進入下一級超濾；再依序將透過液通過截留分子量為4KDa、3KDa、2KDa、lKDa的超濾膜，每一級循環過濾，分別收集截留液，真空冷凍干燥后得到各級多肽和寡肽；最后將透過液通過截留分子量為500 Da納濾膜，收集截留液即可得到分子量為500Da-1000Da的膠原蛋白寡肽。
【權利要求】
1.一種酶解基因重組膠原蛋白制備低刺激性多肽和寡肽的方法，其特征是:將基因重組膠原蛋白溶解于生理鹽水中，使其質量分數為2% -10% ;采用連續兩步水解的方法，加酶前先用生理鹽水將其配制成10% -20%的酶溶液。先用堿性蛋白酶進行水解,水解后850C -95°C保溫5-10min進行滅酶，再用中性蛋白酶進行水解，水解后再次滅酶，冷卻后，經離心、超濾、納濾得到各級分子量的小分子肽。
2.如權利要求1所述，其特征為作為水解底物的膠原蛋白為基因重組膠原蛋白。
3.如權利要求1所述，其特征為所用的堿性蛋白酶和中性蛋白酶均為微生物來源的生物酶。
4.如權利要求1所述，堿性蛋白酶水解基因重組膠原蛋白的最佳反應條件組合是:底物濃度為2% -10%、最佳5% _8%，酶添加量為3000-8000U/g、最佳5000U/g，pH值為9.5-10.5、最佳10.0，溫度為50-60°C、最佳55°C，反應時間為3_6h，最佳4h。
5.如權利要求1所述，中性蛋白酶水解基因重組膠原蛋白的最佳反應條件組合是:底物濃度為2% -10%、最佳5% _8%，酶添加量為2000-5000U/g、最佳3000U/g，pH值為7-8、最佳7.5，溫度為45-55°C、最佳50°C，反應時間為2_4h、最佳3h。
6.如權利要求1所述，堿性蛋白酶和中性蛋白酶在加入酶底反應體系前要用生理鹽水將其配制為I 0% -20%的酶溶液，以便于和底物較快充分混合，提高反應速率。
7.如權利要求1所述，膠原蛋白水解液經冷凍離心后，首先將上清液通過截留分子量為5KDa的超濾膜，分子量大于5KDa的多肽被截留，收集；再將透過液通過截留分子量為4KDa的超濾膜，4KDa <分子量< 5KDa的多肽被截留，收集；再將透過液通過截留分子量為3KDa的超濾膜，3KDa <分子量< 4KDa的多肽被截留，收集；依次將透過液通過截留分子量為2KDa、lKDa的超濾膜，分別得到2KDa <分子量< 3KDa和IKDa <分子量< 2KDa的寡肽。
8.如權利要求1所述，膠原蛋白肽經超濾后，分子量都小于lKDa，用納濾繼續分離純化。將最后一級超濾透過液通過截留分子量為500Da的納濾膜，分子量在500Da-lKDa的寡肽不能透過，收集；分子量低于500Da的氨基酸、鹽類等其他小分子類物質均透過。
【文檔編號】A61K8/65GK103695514SQ201310562913
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年11月14日 優先權日:2013年11月14日
【發明者】李想, 唐興宇, 張衛紅, 潘美玲 申請人:陜西東大生化科技有限責任公司