專利名稱：人重組Reg4蛋白及其編碼基因以及該蛋白的制備方法
技術領域：
本發明涉及一種人重組Reg4蛋白及其編碼基因以及該蛋白的制備方法，屬 于基因工程技術領域。
背景技術：
Reg4蛋白能促進幾種腫瘤細胞的增殖和生長，在結腸癌、胃癌、胰腺癌和 前列腺癌，以及炎癥性腸病中表達明顯升高。人Reg4基因(麗_032044. 2H285bp， CDS長度477bp。 CDS前面66bp編碼一長度為22個氨基酸的信號肽。信號肽不 包含在分泌出來的Reg4內。但Reg4在生物體內含量很少，且難以純化。目前尚 無有具有生物活性的人重組Reg4蛋白報道或上市。我們實驗室發展出一種在大 腸桿菌中直接表達并純化成熟形式的人重組Reg4的方法，并在體外檢測了重組 Reg4蛋白的生物學活性。采用我們的方法純化出來的人重組Reg4具有純度高、 內毒素含量低、活性強的優點。

發明內容
本發明的目的在于克服現有現有技術的不足，提供一種人重組Reg4蛋白及 其編碼基因以及該蛋白的制備方法。本發明所提供的人重組Reg4蛋白為直接具 有活性的形式，制備方法簡單、成本低廉，蛋白產品純度達到98%以上，內毒素 含量低，活性高。
本發明是通過以下的技術方案實現的，
第一方面，本發明涉及一種人重組Reg4蛋白，該蛋白為如下(a)或(b)的蛋 白質
(a) 氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示的蛋白質；
(b) (a)中的氨基酸序列經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有腫 瘤細胞促增值活性的由(a)衍生的蛋白質。
第二方面，本發明涉及一種編碼上述人重組Reg4蛋白的DNA序列，序列如 SEQ ID NO: 2所示。第三方面，本發明涉及一種制備上述人重組Reg4蛋白的方法，包括如下步
驟
步驟一，構建含有編碼人重組Reg4蛋白DNA的重組表達載體； 步驟二，制備含有步驟一所得重組表達載體的轉化體； 步驟三，培養轉化體，表達蛋白； 步驟四，純化蛋白，得到人重組Reg4蛋白。
步驟一中，所述DNA的序列如SEQ ID NO: 2所示。
步驟一中，所述重組表達載體為原核表達載體或真核表達載體。
步驟一中，所述重組表達載體為原核表達載體。
步驟一中，所述重組表達載體為pET30a質粒。
步驟二中，所述轉化體為大腸桿菌。
在步驟三之后和步驟四之前還包括如下步驟將大腸桿菌破菌并收集包涵 體，包涵體用Pellet Wash Buffer洗滌后，溶解至鹽酸胍變性溶液中，然后再 將鹽酸胍變性溶液加入到復性液中，得到復性后的人重組Reg4蛋白溶液；其中，
所述復性液的組分及含量為1L復性液的組分及含量為Tris 6. 057g， KC1 0. 7455g， NaCl 14g， MgCl2 0. 4g， CaCl2 0. 3g， Guanidine-HCL 47. 76g， Sucrose 136. 92g， Arginine-HCL 105. 35g， GSH 300mg， GSSH 60mg，余量為水。
優選地，所述復性后的人重組Reg4蛋白溶液中人重組Reg4蛋白濃度為 0.lmg/mL。
對得到的復性后的人重組Reg4蛋白溶液進行如下處理4'C靜置過夜，12000 rpm離心30 min，得上清，將上清pH值調至8. 0，再離心12000rpm離心30 min， 收集上清；之后將上清用與上清等體積的pH為7.2的磷酸緩沖液稀釋，之后用 膜包去鹽去水至稀釋后總體積的1/10，再用pH為6. 5的磷酸緩沖液將去水后得 到的溶液稀釋10倍。
所述純化為陽離子交換柱純化，具體為
步驟一，用pH為6.5磷酸鹽緩沖液清洗管路及陽離子交換柱，直至電導與 UV值平衡；
步驟二，上樣，控制流速為lml/min;歩驟三，用PH為6. 5的含有1M NaCl的磷酸鹽緩沖液洗脫蛋白； 步驟四，收集流穿液。 所述陽離子交換柱為S/CM柱。
與現有技術相比，本發明具有如下的有益效果本發明首次公開了人重組 Reg4蛋白的制備方法。本發明所提供的人重組Reg4蛋白為直接具有活性的形式。 本發明所述制備人重組Reg4蛋白的方法，工藝簡單、成本低廉，不需要酶切等 額外的步驟，所生產的重組Reg4蛋白產品純度達到98。/。以上，內毒素含量低， 活性高。這為Reg4蛋白在新藥研發和檢測試劑的應用提供了豐富的、高質量的 原料。


圖1為自人Reg4cDNA中PCR出來的人Reg4基因片段和割膠回收后的Reg4 基因片段的電泳圖2為包裝的pET30a質粒示意圖3為表達的人重組Reg4的電泳圖4為以FPLC方法純化的人重組Reg4檢測結果圖5為純化的人重組Reg4電泳圖6為人重組Reg4純度的SEC-HPLC檢測結果圖7為人重組Reg4蛋白western blotting電泳圖8為純化后人重組Reg4蛋白對結腸癌細胞促增殖作用的對比圖。
本發明涉及的大腸桿菌BL21 (DE3)己在《Guo D, Hu K， Lei Y， Wang Y， Ma T, He D. Identification and characterization of a novel cytoplasm protein ICF45 that is involved in cell cycle regulation. J" Biol Chem. 2004， 279(51) :53498-53505》文獻中公開。大腸桿菌BL21 (DE3)可通過公開市售的 商業渠道取得，如可以從德國Novagen公司購得，編號為Novagen: 69389;
本發明涉及的表達載體PET30a(+)已在《Lin M， Trottier E, Pasick J， Sabara M. Identification of antigenic regions of the Erns protein for pig antibodies elicited during classical swine fever virus infection. J Biochem. 2004， 136(6) :795-804》文獻中公開。表達載體PET30a(+)可通過公開市售的商業渠道取得，如可以從德國Novagen公司購得，編號為Novagem 69909-3。
具體實施例方式
下面結合具體實施例進一步闡述本發明。應理解為這些實施例僅用于說明 本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法， 通常按照常規條件，例如Sambrook等分子克隆實驗室手冊見New York Cold Spring Harbor Laboratory出版社1989年版中所述的條件，或按照制造廠商所 建議的條件。
通過從酵母、如細菌的微生物或人或動物細胞系中分泌，可產生重組分子形 式的本實施例的人重組Reg4蛋白。任選從宿主細胞中分泌多肽。
許多表達系統是已知的和可用的，包括細菌(例如大腸桿菌和枯草芽袍桿 菌)，酵母(例如釀酒酵母、乳克魯維酵母和巴斯德畢赤酵母)，絲狀真菌(例如 曲霉)，植物細胞，動物細胞和昆蟲細胞。
本實施例包括編碼本實施例的人重組Reg4蛋白的DNA以及含有這些DNA的 載體、轉化體。
本實施例中，轉化體(transformant)，即帶有異源DNA分子的受體細胞。 本實施例還包括通過合成和重組技術生產本實施例的人重組Reg4蛋白的方
法。通過本領域已知的方法可以分離和純化多核苷酸(DNA或RNA)、載體、宿主
細胞和生物體。
用于本實施例的載體可以是如噬菌體、質粒、粘粒、微型染色體、病毒或逆 轉錄病毒載體。可用于克隆和/或表達本實施例的多核苷酸的載體是能在需復制 和/或表達多核苷酸的宿主細胞中復制和/或表達多核苷酸的載體。 一般說來， 多核苷酸和/或載體可用于任何真核或原核細胞，包括哺乳動物細胞(如人(如 HeLa)、猴(如Cos)、兔(如兔網織紅細胞)、大鼠、倉鼠(如CH0、 NSO和幼 倉鼠腎細胞)或小鼠細胞(如L細胞))、植物細胞、酵母細胞、昆蟲細胞或細 菌細胞(如大腸桿菌)。有關適用于多種類型宿主細胞的適當載體的例子可參見 例如F. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology . Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience (1992)禾口 Sambrook et al. (1989)。可以使用含有這些多核苷酸的宿主細胞來大量表達可用于例如藥物、
7診斷試劑、疫苗和治療劑的蛋白質。
已開發出多種方法用于經由互補的粘性末端使DNA與載體可操作相連。例 如，可在欲插入載體DNA內的DNA區段添加互補的同聚體序列片段。然后通過 互補同聚體尾之間的氫鍵連接載體和DNA區段以形成重組DNA分子。
含有一或多種限制性位點的合成接頭提供了另一種連接DNA區段與載體的 方法。用噬菌體T4DNA聚合酶或大腸桿菌DNA聚合酶I處理通過內切核酸酶 限制性消化產生的DNA區段，所述的兩種聚合酶用其3'，5'-核酸外切活性除 去突出的Y-單鏈末端，并用其聚合活性補平3'-凹端。因此，這些活性的聯 合產生了平端DNA區段。然后在能催化平端DNA分子連接的酶，如噬菌體T4 DNA連接酶的存在下將平端區段與大摩爾過量的接頭分子一起保溫。因此，反應 產物是末端攜有聚合接頭序列的DNA區段。然后用適當的限制性酶裂解這些 DNA區段，并連接至已用酶裂解的表達載體中，所述酶能產生與所述DNA區段 相容的末端。從多個商家可以買到含有多個限制性內切核酸酶位點的合成接頭。
多核苷酸插入物應該可操作地連接于同表達多核苷酸的宿主細胞相容的適 當啟動子上。啟動子可以是強啟動子和/或誘導型啟動子。列舉的一些啟動子的 例子包括噬菌體久PL啟動子、大腸桿菌lac、 trP 、 phoA、 tac啟動子、SV40 早期和晚期啟動子以及逆轉錄病毒LTR啟動子。其它適當啟動子是本領域技術 人員已知的。表達重組載體進一步含有轉錄起始、終止位點，并在轉錄區含有用 于翻譯的核糖體結合位點。重組載體表達的轉錄物的編碼部分可包括位于起點處 的翻譯起始密碼子和適當地位于被翻譯多肽的末端的終止密碼子(UAA， UGA或 腐)。
如上所述，表達載體可包括至少一個選擇標記。所述標記包括對真核細胞培 養物而言的二氫葉酸還原酶、G41S、谷氨酰胺合酶或新霉素抗性；以及用于大腸 桿菌和其它細菌培養的四環素、卡那霉素或氨卞青霉素抗性基因。適當宿主的代 表性例子包括但不限于細菌細胞，如大腸桿菌、鏈霉菌和鼠傷寒沙門氏菌細胞; 真菌細胞，如酵母細胞(如釀酒酵母或巴斯德畢赤酵母)；昆蟲細胞，如果蠅S2 和夜蛾SF9細胞；動物細胞，如CH0 , COS ， NS0 , 293和Bowes黑素瘤細 胞；和植物細胞。上述宿主細胞的適當培養基和培養條件是本領域己知的。
本實施例還包括含有本實施例的核苷酸序列的宿主細胞，所述核苷酸序列經本領域已知的技術與一或多種異源控制區(如啟動子和/或增強子)可操作相連。 可以選擇能調節插入的基因序列的表達，或能按照所需的特殊方式修飾和加工基 因產物的宿主菌株。在某些誘導物的存在下，某些啟動子啟動的表達會升高；因 此，可以控制經基因改造的多肽的表達。另外，不同宿主細胞具有特征性的和特 殊的翻譯、翻譯后加工和修飾(如磷酸化、裂解)蛋白質的機制。可以選擇適當 的細胞系以確保對表達的外源蛋白質進行合乎需要的修飾和加工。
通過磷酸鈣轉染、DEAE-葡聚糖介導的轉染、陽離子脂質介導的轉染、電穿 孔、轉導、感染或其它方法，即可將本實施例的核酸和核酸重組載體導入宿主細 胞。所述方法描述于多個標準的實驗室手冊中，如Davis etal.， BasicMethods In Molecular Biology (1986)。
編碼本實施例的人重組Reg4蛋白的多核苷酸可以與含有選擇標記的載體連 接以在宿主中增殖。 一般說來，可在沉淀物，如磷酸鈣沉淀物或其與帶電脂質的 復合物中導入質粒載體。如果載體是病毒，可使用適當的包裝細胞系在體外對其 進行包裝，再轉導至宿主細胞。
通過眾所周知的技術可以鑒定出被成功轉化的細胞，即含有本實施例的DNA 重組載體的細胞。例如，可培養導入表達重組載體所得的細胞以產生所需多肽。 收集并裂解細胞，使用如Southern ( 1975 ) J. Mol. Biol. 95， 503或Berent et al (1985) Biotech. 3， 208所述的方法，檢測其DNA內容物中DNA的存在。 或者，使用抗體檢測上清液中蛋白質的存在。
通過眾所周知的方法從重組細胞培養物中回收和純化本實施例的人重組 Reg4蛋白較為有利，所述方法包括硫酸按或乙醇沉淀、酸提取、陰離子或陽離 子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水作用層析、親和層析、羥基磷灰石層析、疏 水電荷作用層析和凝集素層析。在一些實施方案中，可使用高效液相層析(HPLC) 進行純化。
在一些實施方案中，可使用上述的一種或多種層析方法純化本實施例的人重 組Reg4蛋白。在其它實施方案中，可使用下述的一種或多種層析柱純化本實施 例的人重組Reg4蛋白，所述層析柱有Q s印harose FF柱、SP s印harose FF 柱、Q sepharose High Performance柱、Blue sepharose FF柱、 Blue柱、 Phenyl Sepharose FF柱、 DEAE Sepharose FF或Methyl柱。另外，可使用國際公開號W000/44772 (全文列入本文作為參考)中描述的 方法純化本實施例的人重組Reg4蛋白。本領域技術人員可以容易地改動其中所 述的方法以用于純化本實施例的人重組Reg4蛋白。可以從包括例如細菌、酵母、 高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞的原核或真核宿主經重組技術產生的產物中回收 本實施例的人重組Reg4蛋白。
實施例
步驟一，人重組Reg4蛋白表達載體的構建
從人類肝臟cDNA中用引物5' GGAATTCCATATGGATATCATCATGAGACCCAGC 3' (SEQ ID NO: 4)和反向引物5， CGGGATCCCTATGGTCGGTACTTGCACAGG 3' ( SEQ IDN0: 5)(由上海生工合成)PCR出人Reg4基因。引物中加下劃線的部分是M/e I和萬a力WI的酶切位點。PCR條件為94°C 2分鐘94°C 30秒鐘，58°C 30秒 鐘，68°C 30秒鐘，35循環。PCR產物凝膠電泳，回收約500bp的DNA片段(見 圖1)，以Nde I和BamH雙酶切并將酶切下來的片段包裝進入Nde I和BaraH雙 酶切的pET30a質粒并測序(Invitrogene)。以卡拉霉素平板挑選陽性克隆，并 將陽性克隆抽提質粒，以Nde I和BamH雙酶切驗和測序驗證正確包裝的質粒(SEQ ID NO: 2)。圖1為自人Reg4cDNA中PCR出來的人Reg4基因片段和割膠回收后 的Reg4基因片段的電泳圖；圖2為包裝的pET30a質粒示意圖，其中斜體部分為 Nde I和BamH的酶切位點，終止子為"TAG"。將包裝的pET30a載體轉化到BL21 (DE3)大腸桿菌中，并行雙酶切、PCR和測序鑒定，選出構建成功的 Reg4-pET30a-BL21工程菌株。
步驟二，人重組Reg4蛋白的表達
步驟一中制備的工程菌株在LB培養基(1% NaCl; 1% Tryptone; 0. 5% Yeast Extract; PH7. 0)中培養至OD600=0. 6左右時，加入IPTG進行誘導(我們使用 的是lmM濃度，然而，更高或者更低的濃度也是適用的)，誘導在37 42'C下搖 床培養進行4小時。誘導結束后離心收集菌體，并以1XPBS (137mMNaCl; 2. 7mM KC1; 4. 3mM Na2HP04;1.4mMKH2P04; pH7. 4)進行洗滌。圖3為表達的人重組
Reg4的電泳圖；圖3中，第一道分子量標記；第二道未經IPTG誘導的工程
菌株；第三道經IPTG誘導的工程菌株；可見在約16kDa處有誘導出來的人重 組Reg4。步驟三，人重組Reg4蛋白的變性及復性
步驟二中離心收集的菌體以超聲的方式進行破菌并收集包涵體(新芝 JY92-2D， 500W，適量超聲。我們的方法中使用的是3秒超聲3秒休息為一個循 環，共30分鐘。超聲緩沖液1XPBS; 1 mM EDTA; 0.1 mM PMSF; pH7. 4。
Pellet Wash Buffer的組分及含量為:Triton X-100 lml， EDTA 0. 292g， NaCl 0.293g，余量為lxPBS;其中1L lxPBS的組分及含量為:NaCL 8g， KCL 0. 2g， Na2HP04 1.42g, KH2P04 0.27g，余量為水)；
洗滌后以50倍體積的鹽酸胍變性溶液溶解(所述鹽酸胍變性溶液的組分及 含量為100ml鹽酸胍變性溶液的組分及含量為Tris 0. 606g， EDTA 0. 292g, NaCl 0. 293g, Guanidine-HCL 57. 318g，余量為水；pH8. 0);
包涵體充分溶解后再將變性液滴加至復性液中(所述復性液的組分及含量 為1L復性液的組分及含量為:Tris 6.057g， KC1 0.7455g， NaCl 14g， MgCl2 0. 4g， CaCl20. 3g， Guanidine-HCL 47. 76g， Sucrose 136. 92g， Arginine-HCL 105. 35g， GSH 300mg， GSSH 60mg，余量為水)；復性時需嚴謹控制蛋白濃度， 最佳濃度為0. lmg/mL;
將變性一復性后的蛋白溶液小心封好，4'C靜置過夜，12000 rpm離心30 min， 得上清，將上清pH值調至8.0，再離心12000rpm離心30 min，收集上清；之后 將上清用與上清等體積的pH為7. 2的磷酸緩沖液稀釋，之后用膜包去鹽去水至 稀釋后總體積的1/10,再用pH為6. 5的磷酸緩沖液將去水后得到的溶液稀釋10 倍，待過柱純化。發明人發現采用此緩沖液體系可保證復性出來的人重組Reg4 蛋白能被方便的純化出來并且具有相應的生物學活性。
步驟四，人重組Reg4蛋白的純化
步驟三中所制備的人重組Reg4蛋白復性液在15000rpm離心30分鐘后，取 上清以經膜包去鹽去水后，進行離子交換柱純化。在我們的方法中采用了一步離 子交換柱純化的方法。步驟如下
(1) Phase A (磷酸鹽緩沖液，pH 6.5)平衡柱床用pH為6. 5磷酸鹽緩 沖液清洗管路及柱子，直至電導與UV值平衡；
(2) 上樣，控制流速為lml/min;
11(3) 用pH為6. 5的含有1M NaCl的磷酸鹽緩沖液洗脫蛋白；
(4) 收集Flow Through (流穿液)觀察紫外吸收曲線，在上樣時和洗脫 時紫外吸收升高時收集Flow Through;
(5) 純化后的人重組Reg蛋白以以pH7.4的IXPBS透析；
(6) 透析后的蛋白濃度可達lmg/mL以上，純度可達98°/。以上，蛋白可直接 以液氮速凍后置于-8(TC低溫冰箱保存。
圖4為以FPLC方法純化的人重組Reg4檢測結果圖；圖中顯示的是陽離子柱 純化，根據紫外吸收峰和電導曲線，收集洗脫峰。
以下是對制備得到的Reg 4蛋白進行的相關檢測 一，Reg 4蛋白的常規檢測
(1) 按照常規SDS-PAGE電泳操作檢測純度。圖5為純化的人重組Reg4電
泳圖；如圖5所示，第一道分子量標記。第二道未經IPTG誘導后的工程菌 株。第三道經IPTG誘導后的工程菌株。第四道洗滌后包涵體。第五道變 性后上清。第六道陽離子交換柱洗脫下來的純化的人重組Reg4蛋白。蛋白純 度經BandScan軟件分析其純度可達98%以上；
(2) 步驟四制備的人重組Reg4蛋白進行HPLC-SEC檢測，條件為(條件 ACME 9000 (Younglin， Korea), TSK-GEL G2000SWXL (Tosoh， Japan)上樣量為 20ul，蛋白濃度為O. 5ug/ul ，流速為0. 8 mL/rain， UV檢測280nm)。可見在 洗脫液中，只有一個峰存在。如圖6所示，圖6為人重組Reg4純度的SEC-HPLC 檢測結果(3) 按照常規Western blotting檢測表達蛋白的特異性。將菌體蛋白經 SDS-PAGE電泳后，轉膜到PVDF膜上，5%脫脂奶粉4度封閉過夜，商品化的抗Reg4 抗體室溫孵育lh，洗膜3次，二抗室溫孵育45mins， ECL檢測。圖7為人重組 Reg4蛋白western blotting電泳圖；圖7中，第一道IPTG誘導的菌體蛋白； 第二道未經IPTG誘導的菌體蛋白。可見表達的蛋白確為特異性的Reg4蛋白。
二，人重組Reg4蛋白內毒素檢測
采用鱟試劑(廈門鱟試劑實驗廠有限公司)，檢測了步驟四制備的三批人重 組Reg4蛋白的內毒素含量，均〈lE.U/ug。三，人重組Reg4蛋白活性檢測
步驟四制備的人重組Reg4蛋白對于結腸癌細胞顯示了較強的促增殖作用。 HCT116 (a)和HT29 (b)細胞長滿培養皿70-80%時，在無小牛血清1640培養液 中培養過夜;將HCT116和HT29細胞以1 X 107孔的密度分別接種于％孔培養板， 在0. lml 1640培養液(含10%胎牛血清)中于37°C、含5%C02的孵箱中培養過 夜；吸去培養液，加入0. lml新鮮1640培養液(含5%胎牛血清，但含有不同濃 度的重組hReg4純品(OnM，， 10 nM， 100 nM， 200 nM， 500 nM， 1000 nM))繼 續培養68h;終止培養前加入CCK-8溶液10ul/孔，37。C溫育3h，測定0D450nm 和0D490nm值。同時設置空白孔(培養基、CCK-8溶液)，對照孔(細胞、相同 濃度的藥物溶解介質、培養液、CCK-8溶液)，每組設定6復孔，結果取其平均 值。圖8為純化后人重組Reg4蛋白對結腸癌細胞促增殖作用的對比圖純化后 人重組Reg4蛋白對對結腸癌細胞顯示了較強的促增殖作用。
四，人重組Reg4第12位氨基酸由Gly改為Ala
將步驟一中所述的PCR目的基因片段自起始密碼子ATG之后第32位堿基以 定點突變的方法改成G，即(ATGGATATCATCATGAGACCCAGCTGTGCTCCTGGA)改為 (ATGGATATCATCATGAGACCCAGCTGTGCTCCTGCA)，表達并純化后的蛋白質序列第12 位由Gly變為Ala (見SEQ IDN0:3)，即(MDIIMRPSCAPG)成為(，IIMRPSCAPA)。 對這一純化后的蛋白質采用了 "三，人重組Reg4蛋白活性檢測"中所述的方法， 在變異后的人重組Reg4蛋白濃度為OnM， 10nM， 100nM， 200nM， 500nM， 1000 nM 時，其活性與步驟四制備的人重組Reg4蛋白相比無顯著變化。序列表
<110>上海交通大學
<120>人重組Reg4蛋白及其編碼基因以及該蛋白的制備方法
<160> 5
<170> Patentln version 3. 3
<210〉 1
<211> 137
〈212> PRT
<213> Homo s即iens
<220>
<221> MUTAGEN 〈222〉 (l)..(l)
<400> 1
Met Asp lie lie Met Arg Pro Ser Cys Ala Pro Gly Trp Phe Tyr His 15 10 15
Lys Ser Asn Cys Tyr Gly Tyr Phe Arg Lys Leu Arg Asn Trp Ser Asp 20 25 30
Ala Glu Leu Glu Cys Gin Ser Tyr Gly Asn Gly Ala His Leu Ala Ser 35 40 45
lie Leu Ser Leu Lys Glu Ala Ser Thr lie Ala Glu Tyr lie Ser Gly 50 55 60
Tyr Gin Arg Ser Gin Pro lie Trp lie Gly Leu His Asp Pro Gin Lys 65 70 75 80Arg Gin Gin Trp Gin Trp lie Asp Gly Ala Met Tyr Leu Tyr Arg Ser
85 90
95
Trp Ser Gly Lys Ser Met Gly Gly Asn Lys His Cys Ala Glu Met Ser
100 105
110
Ser Asn Asn Asn Phe Leu Thr Trp Ser Ser Asn Glu Cys Asn Lys Arg 115 120 125
Gin His Phe Leu Cys Lys Tyr Arg Pro 130 135
<210> 2
<211> 423
<212〉 醒
<213〉 Artificial
〈220〉
〈223>人工序列 <400> 2
catatggata tcatcatgag acccagctgt gctcctggat ggttttacca caagtccaat 60
tgctatggtt acttcaggaa gctgaggaac tggtctgatg ccgagctcga gtgtcagtct 120
tacggaaacg gagcccacct ggcatctatc ctgagtttaa aggaagccag caccatagca 180
gagtscataa gtggctatca gaga3gcc8g ccgat3tgga ttggcctgca cgscccEic3g 240
aagaggcagc agtggcagtg gattgatggg gccatgtatc tgtacagatc ctggtctggc 300
aagtccatgg gtgggaacaa gcactgtgct gagatgagct ccaataacaa ctttttaact 360
tggagcagca acgaatgcaa caagcgccaa cacttcctgt gcaagtaccg accataggga 420
tcc
423<210> 3
<211> 137
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
Met Asp lie lie Met Arg Pro Ser Cys Ala Pro Ala Trp Phe Tyr His 15 10 15
Lys Ser Asn Cys Tyr Gly Tyr Phe Arg Lys Leu Arg Asn Trp Ser Asp 20 25 30
Ala Glu Leu Glu Cys Gin Ser Tyr Gly Asn Gly Ala His Leu Ala Ser 35 40 45
lie Leu Ser Leu Lys Glu Ala Ser Thr lie Ala Glu Tyr lie Ser Gly 50 55 60
Tyr Gin Arg Ser Gin Pro lie Trp lie Gly Leu His Asp Pro Gin Lys 65 70 75 80
Arg Gin Gin Trp Gin Trp lie Asp Gly Ala Met Tyr Leu Tyr Arg Ser 85 90 95
Trp Ser Gly Lys Ser Met Gly Gly Asn Lys His Cys Ala Glu Met Ser 100 105 110
Ser Asn Asn Asn Phe Leu Thr Trp Ser Ser Asn Glu Cys Asn Lys Arg 115 120 125
Gin His Phe Leu Cys Lys Tyr Arg Pro 130 135
16<210〉 4
<211> 34 <212>腿
<213> Artificial
<220>
<223〉人工序列
<400〉 4
ggaattccat atggatatca tcatgagacc cage 34
<210> 5
<211〉 30
<212〉 DNA
<213> Artificial
〈220>
<223>人工序列
〈400> 5
cgggatccct atggtcggta cttgcacagg 30
權利要求
1、一種人重組Reg4蛋白，其特征在于，該蛋白為如下(a)或(b)的蛋白質(a)氨基酸序列如SEQ ID NO1所示的蛋白質；(b)(a)中的氨基酸序列經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有腫瘤細胞促增值活性的由(a)衍生的蛋白質。
2、 一種根據權利要求1所述的人重組Reg4蛋白的DNA編碼序列，其特征是， 所述序列如SEQ ID NO: 2所示。
3、 一種制備權利要求l所述的人重組Reg4蛋白的方法，其特征在于，包括 如下步驟步驟一，構建含有編碼人重組Reg4蛋白DNA的重組表達載體； 步驟二，制備含有步驟一所得重組表達載體的轉化體； 步驟三，培養轉化體，表達蛋白； 步驟四，純化蛋白，得到人重組Reg4蛋白。
4、 根據權利要求3所述的人重組Reg4蛋白的制備方法，其特征是，步驟一 中，所述DNA的序列如SEQ ID NO: 2所示。
5、 根據權利要求3所述的人重組Reg4蛋白的制備方法，其特征是，步驟一 中，所述重組表達載體為原核表達載體或真核表達載體。
6、 根據權利要求3所述的人重組Reg4蛋白的制備方法，其特征是，步驟一 中，所述重組表達載體為原核表達載體。
7、 根據權利要求3所述的人重組Reg4蛋白的制備方法，其特征是，步驟一 中，所述重組表達載體為pET30a質粒。
8、 根據權利要求3所述的人重組Reg4蛋白的制備方法，其特征是，步驟二 中，所述轉化體為大腸桿菌。
9、 根據權利要求8所述的人重組Reg4蛋白的制備方法，其特征是，在步 驟三之后和步驟四之前包括如下步驟將大腸桿菌破菌并收集包涵體，包涵體用 Pellet Wash Buffer洗滌后，溶解至鹽酸胍變性溶液中，然后再將鹽酸胍變性 溶液加入到復性液中，得到復性后的人重組Reg4蛋白溶液；其中，所述復性液 的組分及含量為1L復性液的組分及含量為Tris 6.057g， KC1 0. 7455g， NaCl14g, MgCl20. 4g， CaCl20. 3g， G腦idine-HCL 47. 76g， Sucrose 136. 92g， Arginine-HCL 105. 35g， GSH 300mg， GSSH 60mg，余量為水。
10、 根據權利要求9所述的人重組Reg4蛋白的制備方法，其特征是，所述 復性后的人重組Reg4蛋白溶液中人重組Reg4蛋白濃度為0. lmg/tnL。
11、 根據權利要求9所述的人重組Reg4蛋白的制備方法，其特征是，對得 到的復性后的人重組Reg4蛋白溶液進行如下處理4'C靜置過夜，12000 rpm離 心30 min，得上清，將上清pH值調至8. 0，再離心12000rpm離心30 min，收 集上清；之后將上清用與上清等體積的pH為7. 2的磷酸緩沖液稀釋，之后用膜 包去鹽去水至稀釋后總體積的1/10，再用pH為6. 5的磷酸緩沖液將去水后得到 的溶液稀釋10倍。
12、 根據權利要求3所述的人重組Reg4蛋白的制備方法，其特征是，步驟 四中，所述純化為陽離子交換柱純化，具體為步驟一，用pH為6.5磷酸鹽緩沖液清洗管路及陽離子交換柱，直至電導與 UV值平衡；步驟二，上樣，控制流速為lml/min;步驟三，用pH為6. 5的含有1M NaCl的磷酸鹽緩沖液洗脫蛋白； 步驟四，收集流穿液。
13、 根據權利要求12所述的人重組Reg4蛋白的制備方法，其特征是，所述 陽離子交換柱為S/CM柱。
全文摘要
一種基因工程技術領域的人重組Reg4蛋白及其編碼基因以及該蛋白的制備方法。本發明涉及一種人重組Reg4蛋白，該蛋白為如下(a)或(b)的蛋白質(a)氨基酸序列如SEQ ID NO1所示的蛋白質；(b)(a)中的氨基酸序列經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有腫瘤細胞促增值活性的由(a)衍生的蛋白質；本發明還涉及編碼所述人重組Reg4蛋白的DNA序列；本發明還提供了制備所述人重組Reg4蛋白的方法構建含有編碼人重組Reg4蛋白DNA的重組表達載體；制備含有步驟一所得重組表達載體的轉化體；培養轉化體，表達蛋白；純化蛋白，得到人重組Reg4蛋白。本發明所提供的人重組Reg4蛋白為直接具有活性的形式，制備方法簡單、成本低廉，蛋白產品純度達到98％以上，內毒素含量低，活性高。
文檔編號C07K14/435GK101648995SQ20091005633
公開日2010年2月17日 申請日期2009年8月13日 優先權日2009年8月13日
發明者胡國勇, 偉 韓 申請人:上海交通大學