一種補充人體必需氨基酸的口服重組營養多肽的制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及必需氨基酸構成多肽及其重組芽孢表面展示的制備方法及產品，具體 涉及一種補充人體必需氨基酸的口服重組營養多肽的制備方法，屬于重組融合蛋白藥物技 術領域。
【背景技術】
[0002] 氨基酸（Aminoacid)是構成蛋白質的基本單位，賦予蛋白質特定的分子結構 形態，參與蛋白質的催化、運輸、運動、防御與保護信息的傳遞等生理生化過程。自然界中 組成蛋白質的氨基酸主要是20種，其中人體不能合成或合成速度較慢滿足不了人體新 陳代謝需要的氨基酸稱為必需氨基酸。必需氨基酸通常有8種，即異亮氨酸、亮氨酸、賴 氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、色氨酸，一般由食物蛋白質供給。如果人體缺 乏任何一種必需氨基酸，就可導致生理功能異常，影響抗體代謝的正常進行，從而使機體 的免疫功能下降而導致疾病。必需氨基酸攝入不足也會引起胰島素合成的減少，這樣就 容易引起血糖的升高導致糖尿病的發生發展（MiyakeT,AbeM,FurukawaS,etal. Long-termbranched-chainaminoacidsupplementationimprovesglucosetolerance inpatientswithnonalcoholicsteatohepatitis-relatedcirrhosis.InternMed, 2012，51(16): 2151-2155.)。人體隨著年齡的變化其蛋白質的合成和降解也在發生變化， 一般認為老年人體內的蛋白質分解較多而合成較慢，所以老年人對于青壯年來說需要合成 蛋白質的原料更多，特別是對甲硫氨酸和賴氨酸的需求（TatpatiLL,IrvingBA,TomA, etal.Theeffectofbranchedchainaminoacidsonskeletalmusclemitochondrial functioninyoungandelderlyadults.JClinEndorcrinolMetab, 2010， 95(2): 894-902)。近年研究報告，老年人與中青年人給予相同營養條件，但老年人其血漿氨基酸 (纈、亮、酪、賴、蛋、絲、丙氨酸）含量減低，特別支鏈氨基酸BCAA(纈、亮、異亮氨酸）顯示不 足。1998年美國"發現"號航天飛機在太空的人體試驗證明了必需氨基酸的攝入能夠提高 機體的抵抗力和延緩衰老，后續的臨床試驗也說明了必需氨基酸的補充對于老年人來說相 當必要。運動營養學研究也表明BCAA的補充能夠減慢能源物質的消耗，延緩疲勞的發生， 促進疲勞的恢復（KimDH,KimSH,JeongWS,etal·EffectofBCAAintakeduring enduranceexercisesonfatiguesubstances,muscledamagesubstance,andenergy metabolismsubstances.JExercNutritionBiochem, 2013, 17(4): 169-180·)。目前 市場上有許多相關的復合氨基酸口服液，但是這類產品價格昂貴，且支鏈氨基酸BCAA所含 比例不高，容易受到胃腸道極端環境對氨基酸結構的影響和破壞，降低吸收效率。目前已有 通過基因工程的方法用大腸桿菌發酵生產重組各種營養多肽，但要實現口服來消化多肽來 補充必需氨基酸，提高人體運動效率和減少疲勞仍有許多的缺點和不足，因為大腸桿菌含 有許多內毒素，這樣對產品純度的要求極高，任何微量的雜蛋白都可能造成嚴重的免疫反 應。這使得發酵法生產重組營養多肽的分離純化方法和步驟復雜，生產成本較高。
[0003] 枯草芽孢桿菌為環境友好型細菌，對弧菌、大腸桿菌和桿狀病毒等有害細菌有很 強的抑制作用，營養缺乏時能形成處于代謝休眠狀態的芽孢，在適宜條件下芽孢又能萌發 成具有繁殖能力的營養細胞，產生大量多種維生素、有機酸、氨基酸、蛋白酶、糖化酶等促進 消化吸收的物質。芽孢容易培養，比重大易分離、不需要復雜的分離純化操作。芽孢是生物 界中抗逆性最強的生命體，其穩定性好，能耐氧化，耐高溫，能長期耐60°C高溫，在120Γ~ 140°C還能生存幾小時，并且在抗化學藥物和抗輻射等方面也十分突出，可在惡劣環境中存 活幾年至幾十年。芽孢在酸性胃環境中能保持活性，可以耐唾液和膽汁的攻擊，順利通過 動物消化道直達大小腸，可作為極端環境(如胃腸道）下異源蛋白或生物活性分子的載體 (OggioniMR,CiabattiniA,CupponeAM,andPozziG. 2003.Bacillussporesfor vaccinedelivery.Vaccine. 31: 96-101)。枯草芽孢桿菌以孢子狀態進入消化道后，迅 速由休眠狀態復活，在短期內繁殖成高含菌量的優勢種群，消耗掉腸道內大量氧氣，并能產 生過氧化氫、細菌素，建立微生態平衡，促進有益厭氧微生物的繁殖，抑制有害細菌(大腸桿 菌、沙門氏桿菌）的生長，因而能預防腹瀉、下痢等腸胃道疾病，增強機體的免疫力和體質水 平。目前市場上已經有口服枯草芽孢桿菌活菌膠囊產品，北京紫竹藥業有限公司，國藥準字 S20030018 (//www. 777aaa.com/html/yao/200791823 4027.htm)，表明 枯草芽孢桿菌芽孢可以通過人口服使用而產生藥效性。
[0004] 本發明的目的在于根據人體胃腸道的消化特征，以益生菌枯草芽孢桿菌芽孢衣殼 蛋白為載體，通過芽孢展示技術將帶有腸激酶標簽Asp-Asp-Asp-Asp-Lys的營養多肽展示 在芽孢表面，使多肽獲得快速大量表達具有良好抗逆性的同時能夠在人體腸道進行增殖和 自由消化吸收，適用于快速大量制備具有補充必需氨基酸功效的重組營養多肽的口服保健 品。該產品結合了枯草芽孢桿菌的抗逆性特征和人體胃腸道的消化特點，增加了腸激酶位 點，開發出能夠在人體口服進行自由消化吸收的營養多肽保健品，同時，能進行大規模的工 業生產，迄今尚未見類似的報道和發明專利。

【發明內容】

[0005] 為了有效獲得補充人體必需氨基酸來提高人體營養和運動效率，本發明提供了一 種表面展示富含BCAA營養多肽重組芽孢的制備方法和產品。本發明以枯草芽孢桿菌芽孢 衣殼蛋白CotC為載體，通過芽孢表面展示技術將帶有腸激酶標簽Asp-Asp-Asp-Asp-Lys的 營養多肽展示在枯草芽孢桿菌的芽孢表面，可用于動物直接口服，成為一種新型提高運動 效率富含BCAA的營養多肽，其在安全性、耐受性、藥效學以及藥代動力學等方面與復合氨 基酸具有類似的功效。相對于其它氨基酸口服液產品，本發明表面展示營養多肽的制備方 法主要用于機體為提高運動效率服用，同時具有工業化生產特點，具有更廣泛的應用價值。 這種產品的發明克服了當前BCAA來源于化學合成的限制，同時也克服了大腸桿菌發酵生 產的營養多肽分離純化過程復雜的缺點，在保健品領域具有良好的應用前景。
[0006] 本發明所采用的技術方案為：一種口服重組營養多肽的制備方法，利用枯草芽孢 桿菌芽孢衣殼蛋白基因CotC為分子載體，與帶有腸激酶標簽的營養多肽基因np重組，構建 融合表達的整合型重組質粒PJS700-NP，并轉化枯草芽孢桿菌獲得枯草芽孢桿菌重組菌株 SaciWys 168 /pJS700-NP，誘導重組菌株產生重組芽孢，在重組芽孢表面展示 有重組營養多肽，所述重組芽孢可通過口服補充人體必需氨基酸。
[0007] 一種重組芽孢，是由枯草芽孢桿菌重組菌株168 /pJS700-NP 誘導形成的重組芽孢，其表面展示有帶有腸激酶標簽的融合蛋白CotC-NP。本發明的具體操 作是： (1) 設計一段DNA片段（SEQIDNO. 1)，包含營養多肽基因片段，命名為np，所述營養多 肽基因片段包括人體必需八種氨基酸的(賴氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、蘇氨酸、異 亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸）基因片段，進一步的，所述營養多肽基因np包括BCAA(支鏈氨基 酸）基因片段； (2) 通過PCR的方法從公司合成DNA片段(上海生工）中擴增獲得營養多肽基因np， 將獲得的基因插入到載體PMD18-T中并轉化大腸桿菌DH5a保存；克隆的重組質粒命名為 PMD18-T-NP，重組子菌株命名為DH5a/pMD18-T-NP; (3