專利名稱：一種草魚白細胞介素10基因和蛋白及其重組表達方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種草魚白細胞介素10基因的重組表達和純化技術。
背景技術：
白細胞介素10 (interleukin-10, IL-10)是一種重要的細胞因子。1989年Fiorentino等發現小鼠Th2細胞能分泌一種抑制Thl細胞分泌干擾素等細胞因子的物質，因此將這種物質命名為細胞因子分泌抑制因子(cytokine synthesis inhibitingfactor, CSIF)，后稱為白細胞介素10。隨后的研究發現，該細胞因子對炎癥、惡性腫瘤、自身免疫性疾病起重要作用。它能抑制T細胞、巨噬細胞的增值分化，同時也能促進B細胞的 穩定分化，它的免疫多樣性使其在免疫系統中發揮著重要的作用。目前的研究還表明，白細胞介素10對于炎癥性動物有免疫調節功能和可能的治療作用。草魚(Ctenopharyngodon idellus)屬鯉形目鯉科雅羅魚亞科草魚屬，俗稱有鯇、油鯇、草鯇、白鯇、草魚、草根(東北)、混子、黑青魚等。英文名=Grass carp。因其生長迅速，飼料來源廣，是中國淡水養殖的四大家魚之一，具有重要的經濟價值。但草魚抗病力和成活率較低，易患出血病、爛鰓病、赤皮病和腸炎病等，加之高密度養殖增加了水產動物之間病原體交叉感染的機會，使病害日益加劇。到目前為止，防止草魚及水產動物疾病主要依靠藥物，但經常使用藥物防治疾病，病原體很可能對某些藥物產生抗藥性，致使防治失敗，且藥物在水中積累過多，極易污染水體，造成生態平衡破壞，而采取免疫學方法防治疾病則既可避免這種弊端，又提高產品質量。因此，從草魚本身的免疫防御因子入手研究其抗病機制和制定新的疾病防治措施，成為人們迫切需要解決的問題。由于白細胞介素-10在魚類炎癥反應中具有廣泛生物學活性及其在免疫調控中的重要性，必將使其在草魚病害防治中非常重要的作用。

發明內容
本發明的目的是為提供草魚白細胞介素10蛋白的重組表達方法，為草魚白細胞介素10蛋白的產業化應用提供可能。為了實現上述目的，本發明的技術方案具體如下草魚白細胞介素10基因，其特征在于，該基因的堿基序列是序列表中的SEQ IDNo. I。基因編碼的草魚白細胞介素10蛋白，其特征在于，該蛋白的氨基酸序列是序列表中的 SEQ ID No. 2。草魚白細胞介素10基因的重組表達方法，其特征在于，利用同源克隆技術克隆得到草魚白細胞介素10基因的CDNA全序列，利用草魚白細胞介素10基因的成熟肽序列構建原核表達載體，篩選出一種用于高效表達草魚白細胞介素10基因的重組表達系統，通過誘導表達和純化從而獲得有活性的重組草魚白細胞介素10蛋白；其具體步驟為
步驟I基因克隆利用同源克隆技術從草魚鰓組織中克隆得到草魚白細胞介素10基因的cDNA部分序列，再由RACE技術進一步得到草魚白細胞介素10的cDNA全序列；步驟2重組表達載體的構建與篩選根據草魚白細胞介素10基因的成熟肽序列，利用一對特異性引物rIL-10F 5’-AM MA GTT GAC TGC AAG TCT GA-3’和rIL-10R 5，_TTAGTG CTT TTC TCT CTT TGA TG-3’在成熟肽序列的兩端引入BamHI和XhoI兩個不同的限制性內切酶位點，將該成熟肽序列亞克隆到pET30a(+)表達載體上，完成原核表達載體的構建；將構建得到的重組表達載體轉化到大腸桿菌BL21(DE3)中，進行篩選鑒定后，將獲得的陽性克隆作為工程菌株；步驟3重組蛋白的表達及表達產物的分離純化將篩選所得的工程菌株，以異丙基-P-D-硫代半乳糖苷(IPTG)為誘導劑進行誘導表達；誘導表達完成后，菌液經超聲裂解并離心得到融合表達的裂解液，用鎳離子親和柱進行親和層析，再以凝膠層析純化，獲得有活性的重組草魚白細胞介素10蛋白。本發明的有益效果通過本發明的技術方案可以工業化生產重組草魚白細胞介素 10，重組草魚白細胞介素10可用于魚類免疫機制的理論研究，也可用于制作飼料添加劑、疫苗的免疫增強劑以及病害防治藥物以及其它醫藥產品。


圖I是重組草魚白細胞介素10的SDS-PAGE。圖2草魚IL-10重組蛋白活性鑒定結果。
具體實施例方式下面，結合附圖和具體實施例對本發明做詳細的說明。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。本實施例中，一種草魚白細胞介素10基因的重組表達方法，利用同源克隆技術克隆得到草魚白細胞介素10基因的CDNA全序列，利用草魚白細胞介素10的成熟肽的基因序列構建原核表達載體，篩選出一種用于高效表達草魚白細胞介素10基因的重組表達體系，通過誘導表達和純化從而獲得具有活性的重組草魚白細胞介素10蛋白；其具體步驟為步驟I基因克隆利用同源克隆技術從草魚鰓組織中克隆得到草魚白細胞介素10基因的cDNA部分序列，再由RACE技術進一步得到草魚白細胞介素10基因的cDNA全序列；根據魚類白細胞介素10基因同源比較的結果，從保守序列中設計簡并引物IL-10F 5’ -ACT GAC TGT TGC TCA TTT GTG G-3’ 和 IL-1OR 5’ -TAC TGCTCG ATG TAC (C/T) TA AAG AG-3’。由草魚鰓組織制備cDNA，從中克隆得到草魚白細胞介素10基因的cDNA部分序列。聚合酶鏈式反應簡稱PCR(英文全稱Polymerase Chain Reaction),本步驟的PCR反應體系如下草魚鰓組織cDNA0.3卟(微升)
10XPCR BufferI 叫(微升)
25 mM MgCL20.8 吣(微升)
IOmMdNTP0. 2叫(微升)
10 _ IL-10F0.2 (iL (微升)
10 _ IL-10R0.2 |iL (微升)
5U/nl Taq 酶0.1 叫(微升)加水補到總體積為10 i! L (微升)
本步驟的PCR 反應條件1 個循環94°C 3min ;35 個循環94°C 30sec,57°C 30sec, 72°C 30sec ；1個循環72°C lOmin，用I %瓊脂糖凝膠對目標PCR產物進行電泳分析，溴化乙錠(EB)工作濃度溶液中染色5min，自來水中洗脫lmin，在凝膠成像系統中拍照，對目標片段進行膠回收。然后通過連接酶將回收的目的DNA片段與pGM-T載體連接，轉化入大腸桿菌JM109感受態細胞，通過LB/Amp+平板進行篩選后，用基因特異性引物進行PCR進一步篩選陽性克隆，單克隆篩選的PCR條件如下94°C預變性5min，25個循環94°C變性30sec，57°C退火30sec，72°C延伸30sec，然后最終延伸72°C IOmin0挑取陽性單克隆測序。根據草魚白細胞介素10基因的cDNA部分序列設計巢式PCR引物，通過RACE技術進一步得到草魚白細胞介素10基因的cDNA全序列，RACE(rapid-amplification of cDNAends)技術是通過PCR進行cDNA末端快速克隆的技術，由于其為現有技術，因此不再詳細描述。本步驟成功進行后，得到草魚白細胞介素10基因，該基因的堿基序列是序列表中的 SEQ ID No. I。得到草魚白細胞介素10基因后，并由該基因翻譯得到草魚白細胞介素10蛋白，該蛋白的氨基酸序列是序列表中的SEQ ID No. 2。步驟2重組表達載體的構建與篩選根據草魚白細胞介素10的成熟肽的基因序列，利用一對特異性引物 rIL-10F 5’ -AAA AAA GTT GAC TGC AAG TCTGA-3’ 和 rIL-10R5，-TTA GTG CTT TTC TCT CTT TGA TG-3，。在成熟肽基因序列的兩端引入BamHI和XhoI兩個不同的限制性內切酶位點，將該成熟肽基因序列亞克隆到pET30a(+)表達載體上，完成原核表達載體的構建；將構建得到的重組表達載體轉化到大腸桿菌BL21 (DE3)中，進行篩選鑒定后，將獲得的陽性克隆作為工程菌株；在與其它魚類和哺乳動物白細胞介素-10成熟肽的氨基酸序列相似性比較后，并通過SignalP 3.0軟件，確定草魚白細胞介素10成熟肽氨基酸序列(Lys23-His179)t5根據草魚白細胞介素10成熟肽的cDNA基因序列，利用一對特異性引物rIL-10F(5’ -AAA AAAGTT GAC TGC AAG TCT GA-3，)和 rIL_10R(5，-TTA GTG CTT TTC TCT CTT TGA TG-3，)在成熟肽基因序列兩端引入BamHI和XhoI兩個不同的限制性內切酶位點，使用高保真聚合酶Phu進行PCR擴增獲得具有限制性內切酶位點的草魚白細胞介素10成熟肽基因序列，將PCR產物與表達載體pET30a(+)雙酶切后，將草魚白細胞介素10成熟肽基因序列連接到pET30a(+)上，完成原核系統表達載體的構建，pET30a(+)是購自Novagen公司的商品化原核表達載體，通過公共的商業途徑獲取。本步驟的PCR反應體系如下
草魚頭腎組織CDNA0. 3 ^iL (微升)
5 X PCR Buffer4 (iL (微升)
25 mM MgCL20.6 叫(微升)
10 mM dNTP0.4 叫(微升)
10 _ rIL-10F0.4 吣(微升)
IOioMrIL-IOR0. 4卟(微升)
5U/^1高保真酶0.4叫(微升)加水補到總體積為20 ii L本步驟的PCR反應條件1個循環98 V 30sec ；35個循環98 V IOsec,570C 30sec,72°C 20sec ；1 個循環72°C 10min，4°C保存。本步驟的限制性內切酶消化體系如下
DNA0.5 (ig
10 X EcoRI Buffer2 }iL
100 X BSA0.2 |aL
EcoRI ( NEB )0.5 (iL
XhoI (NEB)0.5 |iL加水補到總體積為25 ii L將上述限制性內切酶消化體系，于37°C孵育3小時。將PCR酶切產物和質粒酶切產物按摩爾比3 : I混合純化后連接，連接產物轉化到大腸桿菌BL21 (DE3)中，分別以載體引物和基因特異性引物進行PCR雙向篩選。篩選出的陽性克隆，并經序列測定鑒定后所作為工程菌株。步驟3 :重組蛋白的表達及表達產物的分離純化將篩選所得的工程菌株，以異丙基-P-D-硫代半乳糖苷(IPTG)為誘導劑進行誘導表達；誘導表達完成后，菌液經超聲裂解并離心得到融合表達的裂解液，用含6XHis鎳離子親和柱進行親和層析，再以凝膠層析純化，獲得有活性的重組草魚白細胞介素10蛋白。
將篩選所得的陽性重組菌BL21 (DE3) /pET30a-gcIL_10單菌落，接種到LB培養基中，37°C振蕩培養16h。然后按5%比例轉接到新鮮LB培養基中，37°C繼續培養至0D_值為0. 6 0. 8時，加入ImM IPTG在30°C誘導6h后，收集菌體，像菌體中加入IOmL緩沖液(20mmol/L Na2HPO4,0. 5moI/L NaCl, 20mmol/L 咪唑，lmg/mL 溶菌酶，pH = 7. 4)。超聲波(200W,超聲5秒，間隔10秒)破菌2分鐘，4°C IOOOOrpm離心30分鐘取上清。可溶性表達的目的蛋白可占菌體總目的蛋白的30 以上。從而完成誘導表達。按照上述的蛋白表達條件，擴大培養體積，誘導表達后收集菌體，破碎后離心收集上清，利用GE公司HisTrap HP柱進行親和層析，用結合緩沖液(20mmol/L Na2HPO4,0. 5mol/L NaCl，20mmol/L咪唑，pH = 7.4)平衡，將裂解液以0. 45 y m濾膜過濾后引流到平衡好的柱中，上樣完畢后用洗脫緩沖液A(20mmol/L Na2HPO4,0. 5mol/L NaCl，50mmol/L咪唑，pH =
7.4)、洗脫緩沖液 B(20mmol/L Na2HPO4,0. 5mol/L NaCl, 500mmol/L 咪唑，pH = 7. 4)依次洗滌，收集洗脫峰組分。為進一步純化并脫鹽，利用GE公司Superdex 75進行純化，以緩沖液(20mmol/L Na2HPO4, pH = 7. 4)洗脫，收集主峰，并經SDS-PAGE鑒定。從而完成蛋白質純 化。如圖I所示，圖為重組草魚白細胞介素10的SDS-PAGE。M為Mark, I為誘導表達后的工程菌總蛋白，2為純化后的蛋白，由圖片可知，經誘導表達后所得的工程菌株大量表達分子量為24KDa(千道爾頓)的重組蛋白，經純化后得到高純度的重組草魚白細胞介素10蛋白(簡稱 rgcIL-10)。經過上述步驟，從而完成草魚白細胞介素10蛋白的重組表達。進一步地，對獲得的重組草魚白細胞介素10蛋白進行活性鑒定。分離得到草魚頭腎淋巴細胞(HKL)，按6X IO5/孔接種到24孔板中(每個孔0. 3mL)，用含10 %小牛血清的RPMI 1640培養液于27°C，5% CO2濃度下培養過夜。然后，每孔再加入0. 3mLRPMI-1640(10%FBS，1%雙抗生素)培養基，此時細胞處理分為四組20iig/mL LPS單獨處理組；20 u g/mL LPS 和 2ng/mL rgcIL-10 聯合處理組；20 u g/mL LPS 和 20ng/mL rgcIL-10聯合處理組；20ii g/mL LPS和200ng/mL rgcIL-10聯合處理組。因此其中LPS的終濃度為IOy g/mL,而rgcIL-10的終濃度分別為Ing/mL、10ng/mL和100ng/mL。同時，我們還將100°C加熱五分鐘后的rgcIL-10 (200ng/mL)作為蛋白活性的負對照，未加任何蛋白處理的組作為空白對照。上述6組細胞繼續培養24小時后提取HKL總RNA，反轉錄后用實時定量熒光PCR檢測促炎因子TNF-a以及抑炎因子TGF_P的mRNA的表達，此時的PCR體系為Real Master Mix(SYBR Green I) :9 y L ;5 倍稀釋的 cDNA 模板10 y L ;上游引物 IOpmol/U L :0. 5iil ;下游引物 10pmol/u L 0. 5u L0 檢測 TNF-a 和 TGF- ^ mRNA-的表達如圖所示，由圖可知LPS能夠顯著上調HKL中TNF-a mRNA的表達，但rgcIL-10能抑制這種反應，特別是加入lOOng/mL rgcIL-10后，LPS的作用被完全抑制。而當加入100°C加熱失活后的rgcIL-10，不能抑制LPS所產生的影響。此外，rgcIL-10能顯著上調TGF-P的mRNA表達。這些結果不僅驗證了我們所獲得的重組草魚IL-10蛋白的活性，而且證明了在草魚中IL-10具有抑制TNF-a但刺激TGF-P表達的重要功能(見附圖2)。通過上述實施例獲得的重組草魚白細胞介素10蛋白具有以下應用前景I.重組草魚白細胞介素10蛋白作為一種重要的抑炎因子，可將其發展為藥物治療草魚出血病、腸炎等疾病引發的炎癥反應。2.重組草魚白細胞介素10蛋白用于魚類免疫機制的研究。直接使用重組草魚白細胞介素10蛋白或該蛋白制備的單克隆抗體或多克隆抗體，進行魚類及其它動物免疫機制的研究。 本領域的普通技術人員將會意識到，這里所述的實施例是為了幫助讀者理解本發明的原理，應被理解為本發明的保護范圍并不局限于這樣的特別陳述和實施例。本領域的普通技術人員可以根據本發明公開的這些技術啟示做出各種不脫離本發明實質的其它各種具體變形和組合，這些變形和組合仍然在本發明 的保護范圍內。
權利要求
1.一種草魚白細胞介素10基因,其特征在于該基因的喊基序列是序列表中的SEQ IDNo. I。
2.按照權利要求I所述序列翻譯得到的草魚白細胞介素10蛋白，其特征在于，該蛋白的氨基酸序列是序列表中的SEQ ID No. 2。
3.一種對權利要求I所述基因的重組表達方法，其特征在于，利用同源克隆技術克隆得到草魚白細胞介素10基因的cDNA全序列，利用草魚白細胞介素10的成熟肽的基因序列構建原核表達載體，篩選出一種用于高效表達草魚白細胞介素10基因的重組表達體系，通過誘導表達和純化從而獲得具有活性的重組草魚白細胞介素10蛋白；其具體步驟為 步驟I基因克隆利用同源克隆技術從草魚鰓組織中克隆得到草魚白細胞介素10基因的cDNA部分序列，再由RACE技術進一步得到草魚白細胞介素10基因的cDNA全序列； 步驟2重組表達載體的構建與篩選根據草魚白細胞介素10的成熟肽的基因序列，利用一對特異性引物 rIL-10F 5，-AAA AAA GTT GAC TGC AAG TCTGA-3，和 rIL-10R 5，-TTAGTG CTT TTC TCT CTT TGA TG-3’在成熟肽基因序列的兩端引入BamHI和XhoI兩個不同的限制性內切酶位點，將該成熟肽基因序列亞克隆到pET30a(+)表達載體上，從而成功獲得重組質粒；將構建得到的重組表達載體轉化到大腸桿菌BL21(DE3)中，進行篩選鑒定后，將獲得的陽性克隆作為工程菌株； 步驟3重組蛋白的表達及表達產物的分離純化將篩選所得的工程菌株，以異丙基-P-D-硫代半乳糖苷(IPTG)為誘導劑進行誘導表達；誘導表達完成后，菌液經超聲裂解并離心得到融合表達的裂解液，用鎳離子親和柱進行親和層析，再以凝膠層析純化，獲得有活性的重組草魚白細胞介素10蛋白。
全文摘要
本發明涉及草魚白細胞介素10基因和蛋白及其重組表達方法。本發明提供了草魚白細胞介素10基因序列和該序列編碼的草魚白細胞介素10蛋白序列，并提出草魚白細胞介素10蛋白的原核重組表達方法，利用同源克隆技術得到草魚白細胞介素10基因的cDNA全序列，利用草魚白細胞介素10基因的成熟肽序列構建原核表達載體，篩選得到一種用于高效表達草魚白細胞介素10基因的原核表達體系；其具體步驟為步驟1基因克隆；步驟2重組表達載體的構建；步驟3重組蛋白的表達及表達產物的分離純化。本發明的有益效果通過本發明的技術方案可以工業化生產重組草魚白細胞介素10，從而將其用于魚類免疫機制的理論研究。
文檔編號C07K14/54GK102747086SQ20111009602
公開日2012年10月24日 申請日期2011年4月18日 優先權日2011年4月18日
發明者周紅, 汪新艷, 陳舜, 韋鶴 申請人:電子科技大學