一種對乙醇耐受性顯著提高的集胞藻pcc6803藻株及其構建方法
【專利摘要】本發明公開一種對乙醇耐受性顯著提高的集胞藻PCC6803藻株及其構建方法，屬于工業微生物領域。本發明通過同源重組的方法對集胞藻PCC6803中的sll0687基因進行敲除，得到一種對乙醇耐受性顯著提高的集胞藻PCC6803藻株ISm5。在1.5％(v/v)的乙醇脅迫下，該藻株的生長狀態明顯優于野生型藻株。本發明得到的乙醇耐受性藻株對構建生產燃料乙醇的基因工程菌具有重要的理論和實際意義，具有廣泛的應用前景。
【專利說明】
一種對乙醇耐受性顯著提高的集胞藻PCC6803藻株及其構建 方法
技術領域
[0001] 本發明屬于工業微生物領域，具體涉及一種對乙醇耐受性顯著提高的集胞藻 PCC6803藻株及其構建方法。
【背景技術】
[0002] 為了應對日益嚴重的能源危機，作為生物燃料的乙醇成為替代石油燃料的選擇之 一。由于異養發酵產生乙醇需要糧食農作物作為燃料，乙醇需求的增加會加劇糧食短缺問 題。利用可以進行光合作用的藍藻作為生物反應器將C0 2轉化成乙醇，是解決此問題的重要 方案。集胞藻PCC6803易于進行轉基因操作，是進行該研究良好的基因工程菌。例如將 Zymomonas mobilis中的丙酮酸脫羧酶(pdc)基因和乙醇脫氫酶Il(adh)基因導入集胞藻 PCC6803中，并以psbAII啟動子驅動這兩個基因表達，可以使集胞藻PCC6803產生低濃度的 乙醇。
[0003] 但是目前轉基因集胞藻PCC6803產生的乙醇含量還不能滿足乙醇工業化生產的要 求，其中的一個關鍵因素就是集胞藻PCC6803對乙醇的耐受能力差。在含有1.5% (v/v)乙醇 的培養基中，集胞藻PCC6803細胞會發生聚集，生長速率降低50%以上。因此，開發對乙醇耐 受性更好的集胞藻PCC6803基因工程菌是利用光合作用工業化生產乙醇的關鍵。

【發明內容】

[0004] 為了克服現有技術的缺點與不足，本發明的首要目的在于提供一種對乙醇耐受性 顯著提高的集胞藻PCC6803藻株。該藻株可用于構建生產燃料乙醇的基因工程菌。
[0005] 本發明的另一目的是提供一種對乙醇耐受性顯著提高的集胞藻PCC6803藻株的構 建方法。
[0006] 本發明的目的通過下述技術方案實現：
[0007] -種對乙醇耐受性顯著提高的集胞藻PCC6803藻株的構建方法，包括如下步驟：
[0008] (1)以序列表中SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2為上、下游引物，以野生型集胞藻 PCC6803基因組為模板，通過PCR擴增得到S110687基因上游序列sigl-up，如序列表中SEQ ID N0:7所示；以SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4為上、下游引物，以野生型集胞藻PCC6803基因 組為模板，通過PCR擴增得到S110687基因下游序列sigl-down，如SEQ ID N0:8所示；以SEQ ID N0:5和SEQ ID N0:6為上、下游引物，以p⑶rouet-1質粒為模板，通過PCR擴增得到包含 鏈霉素基因及其上下游部分序列Snf，如SEQ ID NO:9所示；
[0009] (2)以限制性內切酶EcoRI和ΚρηΙ處理PUC118載體和步驟（1)得到的sigl-up片段， 將sigl-up插入到pUC118上得到pUC118-up質粒；以限制性內切酶BamHI和Hindlll處理 pUC118_up 和步驟（1)得到的sigl-down 片段，將sigl-down 插入到 pUCl 18_up 上得到 pUC118_ up-down質粒；以限制性內切酶BamHI和ΚρηΙ處理pUCl 18-up-down和步驟（1)得到的Sm11片 段，將Snf插入到pUCl 18-up-down上得到pUCl 18-up-down-Snf同源雙交換質粒；
[0010] (3)將pUC118-up-down-Snf質粒以自然轉化的方式轉入集胞藻PCC6803中，得到的 轉化子以不同濃度的鏈霉素進行篩選，并在DNA水平上進行鑒定，最終得到S110687基因完 全敲除的單克隆藻株，即對乙醇耐受性顯著提高的集胞藻PCC6803藻株，命名為ISm5。
[0011] 一種對乙醇耐受性顯著提高的集胞藻PCC6803藻株，通過上述構建方法構建得到。 [0012]所述的對乙醇耐受性顯著提高的集胞藻PCC6803藻株ISm5,在含1.5%(v/v)乙醇 的BG11培養基中的生長狀態明顯優于野生型藻株。
[0013] 所述的對乙醇耐受性顯著提高的集胞藻PCC6803藻株可用于構建生產燃料乙醇的 基因工程菌。
[0014] 本發明相對于現有技術，具有如下的優點及效果：
[0015] 本發明通過同源重組的方法對集胞藻PCC6803中的S110687基因進行敲除，得到一 種對乙醇耐受性顯著提高的集胞藻PCC6803藻株ISm5。在1.5%(v/v)的乙醇脅迫下，該藻株 的生長狀態明顯優于野生型藻株。本發明得到的乙醇耐受性藻株對構建生產燃料乙醇的基 因工程菌具有重要的理論和實際意義，具有廣泛的應用前景。
【附圖說明】
[0016] 圖1是pUC118-up-down-Snf質粒的結構示意圖。
[0017] 圖2是以SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:3為引物對ISm5藻株進行PCR鑒定的瓊脂糖電 泳圖；圖中泳道1是以野生型基因組為模板，泳道2是以ISm5基因組為模板，Μ為marker，箭頭 指向的位置為2042bp。
[0018] 圖3是集胞藻PCC6803野生型WT和ISm5藻株在1.5%(v/v)乙醇脅迫下的生長曲線 圖，圖中E代表乙醇。
[0019] 圖4是集胞藻PCC6803野生型WT和ISm5藻株在1.5% (v/v)乙醇脅迫下的藻液的顏 色，圖中藻為生長曲線中第4天的狀態。
[0020] 圖5是集胞藻PCC6803野生型WT和ISm5藻株在1.5% (v/v)乙醇脅迫下的全細胞吸 收圖;A圖為野生型WT，B圖為ISm5和野生型WT乙醇脅迫下的全細胞吸收圖。
【具體實施方式】
[0021] 下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限 于此。
[0022] 本發明實施例中使用的集胞藻PCC6803野生型藻株從ATCC27184中分離純化得到， ATCC是美國菌種保藏中心的簡稱，27184是菌株編號。質粒pUC118購自Takara公司， pCDFDuet-1 購自 Novagen 公司。
[0023] 實施例1
[0024] 同源重組雙交換質粒pUC118-up-down-Snf的構建：
[0025] (1)插入片段的擴增：
[0026] 以序列表中SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2為上、下游引物，以野生型集胞藻PCC6803 基因組為模板，通過PCR擴增得到S110687基因上游序列sigl-up，如序列表中SEQ ID N0:7 所示；以SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4為上、下游引物，以野生型集胞藻PCC6803基因組為模 板，通過PCR擴增得到S110687基因下游序列sigl-down，如SEQ ID N0:8所示；以SEQ ID N0: 5和SEQ ID NO: 6為上、下游引物，以pCDFDuet-1質粒為模板，通過PCR擴增得到包含鏈霉素 基因及其上下游部分序列Snf，如SEQ ID N0:9所示。本發明中集胞藻PCC6803的基因組提取 采用植物基因組DNA快速提取試劑盒(廣州東勝生物科技有限公司，貨號N1191 )，質粒提取 采用高純度質粒小量提取試劑盒(廣州東勝生物科技有限公司，貨號N1011)。
[0027] PCR反應采用20yL體系：模板lyL，10 XPCR Buffer(Mg2+plus)2yL，dNTP Mixture (各2 · 5mM) 1 · 6yL，上游引物lyL(1 ΟμΜ)，下游引物lyL(1 ΟμΜ)，rTaq酶0 · 2yL，ddH20 13 · 2yL。 向PCR管中加入各反應組分，短暫離心后，置于PCR儀上進行擴增反應。擴增程序為:預變性， 94°C，3min;變性，98°C，10s;退火，溫度一般比引物Tm值低5~10°C，時間為15s;延伸，72°C， 每擴增lkb DNA需lmin;循環，變性-退火-延伸的循環38個;72°C，5min;16°C，10min。
[0028] PCR產物大小經瓊脂糖電泳驗證，與理論長度一致。在進行后續實驗前，各PCR產物 還需膠回收純化。
[0029] (2)插入片段與質粒的酶切連接
[0030] 以限制性內切酶EcoRI和ΚρηΙ對步驟（1)得到的sigl-up片段和pUC118載體進行雙 酶切。插入片段的雙酶切采用30yL體系：DNA 10yL，10XBuffer 3yL，兩種快速酶切酶各1μ L，ddH20 15yL。質粒的雙酶切采用20yL體系：DNAlOyL，10 X Buffer 2yL，兩種快速酶切酶各 lyL，ddH20 6yL。酶切反應溫度為37°C，時間為lh。反應結束后，80°C溫浴5min，滅活酶。酶切 產物經膠回收純化后，以T4DNA連接酶進行連接反應。連接反應采用20yL體系:插入片段DNA 12yL，質粒DNA 5yL，10 X Buf f er 2yL，酶lyL。連接反應溫度為16 °C，反應8h后，將連接產物 轉化至大腸桿菌DH5a中。對長出的轉化子進行鑒定是否連接成功，連接成功的質粒經 Sanger測序確認，從而得到質粒pUCl 18-up。以相同的酶切反應和連接反應條件，將sigl-down片段和pUCl 18-up質粒連接，酶切位點為BamHI和HindllI。對連接成功的質粒進行驗 證，從而得到pUCl 18-up-down質粒。最后，將Snf片段和pUCl 18-up-down質粒連接，酶切位點 為BamHI和ΚρηΙ，最終得到同源重組雙交換質粒pUC118-up-down-Snf。
[0031 ] 得到同源重組雙交換質粒pUC118-up-down-Snf中sigI-up、sigI_down和Snf的連接 順序如圖1所示。
[0032] 實施例2
[0033]對乙醇耐受性顯著提高的集胞藻PCC6803藻株的獲得：
[0034] (1)質粒轉化
[0035] 將pUC118-up-down-Snf質粒用0 · 22μηι的微孔濾膜過濾除菌后，裝入2mL無菌離心 管中。向其中加入一定量BG11培養基（已加入HEPES緩沖液），使質粒終濃度約為lOng/yL。取 30mL處于對數期的野生型PCC6803，6000rpm離心7min，去上清。用20mL新鮮BG11培養基重懸 藻泥，6000rpm離心7min，去上清。用含質粒的培養基把藻泥重懸。將重懸的藻液在29°C， 150rpm，1400Lux連續光照培養6h。將藻液涂于鋪有混合纖維濾膜的固體培養基中光照培養 1天(正置培養)后，將膜轉移至含有l〇yg/mL鏈霉素的固體培養基中，光照培養數天至膜表 面長出單藻落。最后，將長出的藻落轉移至含有相同濃度鏈霉素的20mL BG11小瓶培養基中 培養，待長至對數期后轉接。
[0036] (2)藻株篩選
[0037]將（1)中得到的藻液進行轉接培養，培養條件為29°C，150rpm，1400Lux連續光照。 轉接時，將BG11培養基中抗生素濃度提高到20yg/mL。待長至對數期再進行轉接，以后每次 轉接培養基中抗生素的濃度提高l〇yg/mL。當培養基中的抗生素濃度達到50yg/mL時，將藻 液平板劃線。待平板上長出單藻落后，挑取單藻落至含有相應抗生素濃度的BG11培養基中 培養。當藻長至對數期后，提取該藻的基因組。以此基因組為模板，以SEQ ID NO: 1和SEQ ID N0:3為引物進行PCR，同時以野生型基因組作為對照。本發明中PCR反應體系和程序與實施 例1中相同。將PCR產物進行瓊脂糖電泳，鑒定該藻基因組中的S110687基因是否完全被Snf 替換掉。以SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:3為引物，在野生型中擴增得到的片段是S110687基因 及其上下游序列，長度為2042bp;在目標藻株中，擴增得到的片段是Snf基因及S110687基因 的上下游序列，長度為2787bp。若完全替換，藻株篩選完成。否則，繼續提高抗生素濃度進行 篩選鑒定。篩選得到的S110687基因完全被Snf替換掉的藻株即為對乙醇耐受性顯著提高的 集胞藻PCC6803藻株，命名為ISm5。
[0038] 圖2是以SEQ ID NO: 1和SEQ ID N0:3為引物對ISm5藻株進行PCR鑒定的瓊脂糖電 泳圖，圖中泳道1是以野生型基因組為模板，泳道2是以ISm5基因組為模板。從圖中可以看 出，野生型的片段在2000bp左右，與理論計算的2042bp長度接近；ISm5的擴增片段長度比野 生型的大，位置與理論計算的2787bp的位置接近，同時在2042bp處沒有條帶。除此之外，野 生型和I Sm5的PCR產物的序列均已Sanger測序驗證，與理論一致。這說明，I Sm5中的s 110687 基因已被Snf替換掉。
[0039] 本發明中所用BG11培養基配方：1L培養基中含有NaN03 1.5g，K2HP〇4 0.04g， MgS〇4.7H20 0.075g，EDTA 0.001g，CaCl2.2H20 0.036g，檸檬酸0.006g，檸檬酸鐵銨 0.006g，Na2C〇3 0.02g，H3B03 0.00286g，MnCl2.4H20 0.00181g，ZnS〇4*7H20 0.000222g， Na2Mo〇4 · 2H20 0.00039g，CuS〇4 · 5H20 0.000079g，Co(N03)2 · 6H2O 0.0000494g。使用時，每 50mL培養基中加入lmL lmo 1/L的HEPES緩沖液(pH=7.5)。配制固體培養基時，再加入2 %的 瓊脂。
[0040] 實施例3
[00411 ISm5藻株在乙醇脅迫下的生長狀態分析：
[0042] 測定集胞藻PCC6803野生型和實施例2中得到的ISm5藻株在1.5%(v/v)乙醇脅迫 下的生長曲線:將生長至對數期的藻作為種子液，接種至含有50mL BG11培養基中，每瓶藻 的起始0D73Q = 0.1。連續培養4天，每天取樣測0D73Q值，繪制生長曲線。培養條件為29°C， 150rpm，1400Lux連續光照。開始培養時，在野生型和ISm5實驗組的培養基中加入乙醇至終 濃度為1.5% (v/v)。實驗組和對照組各三個平行。
[0043] 集胞藻PCC6803野生型和ISm5藻株在1.5%(v/v)乙醇脅迫下的全細胞吸收光譜測 定:取2mL生長曲線測定中培養至第4天的藻液，用UV-2300紫外分光光度計進行波長掃描， 掃描范圍為400~800nm，掃描速度為400nm/min。測量前，先用BG11培養基進行基線校正。以 波長為橫坐標，以對應的0D值為縱坐標作圖繪制全細胞吸收光譜圖。各樣品的全細胞吸收 光譜圖以730nm處的0D值進行歸一化處理。
[0044]圖3為集胞藻PCC6803野生型和ISm5藻株在1.5% (v/v)乙醇脅迫下的生長曲線圖， 圖中WT代表野生型，E代表乙醇。從圖中可以看出，在乙醇脅迫下ISm5的生長曲線明顯高于 野生型。
[0045]圖4為集胞藻PCC6803野生型和ISm5藻株在1.5%(v/v)乙醇脅迫下的藻液的顏色， 圖中藻為生長曲線中第4天的狀態。從圖中可以看出，乙醇脅迫的野生型顏色與正常培養的 野生型顏色差別較大，乙醇脅迫的野生型的藻的顏色發黃，顏色淡。而乙醇脅迫的ISm5的藻 顏色與沒有乙醇處理的ISm5藻的顏色接近，無明顯差別。
[0046] 圖5為集胞藻PCC6803野生型和ISm5藻株在1.5%(v/v)乙醇脅迫下的全細胞吸收 圖，A圖為野生型，B圖為ISm5，B圖中的點狀虛線為乙醇脅迫下的野生型。從A圖中可以看出， 在乙醇脅迫下，野生型的葉綠素峰和藻藍蛋白峰顯著降低。在B圖中，乙醇脅迫的ISm5的葉 綠素峰和藻藍蛋白峰與正常條件下的藻相比僅有細微的降低，而比乙醇脅迫下的野生型的 峰顯著高，說明乙醇對ISm5光合作用的影響比野生型小。
[0047] 綜合圖3、圖4和圖5的數據可以說明，ISm5對乙醇脅迫的耐受性明顯優于野生型。
[0048]上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受上述實施例的 限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化， 均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護范圍之內。
【主權項】
1. 一種對乙醇耐受性顯著提高的集胞藻PCC6803藻株的構建方法，其特征在于包括如 下步驟： (1) 以序列表中SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2為上、下游引物，以野生型集胞藻PCC6803 基因組為模板，通過PCR擴增得到S110687基因上游序列sigl-up，如序列表中SEQ ID N0:7 所示；以SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4為上、下游引物，以野生型集胞藻PCC6803基因組為模 板，通過PCR擴增得到S110687基因下游序列sigl-down，如SEQ ID N0:8所示；以SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 6為上、下游引物，以pCDFDuet-1質粒為模板，通過PCR擴增得到包含鏈霉素 基因及其上下游部分序列Snf，如SEQ ID NO:9所示； (2) 以限制性內切酶EcoRI和Κρη I處理pUC 118載體和步驟（1)得到的s i g I -up片段，將 sigl-up插入到pUC118上得到pUC118-up質粒；以限制性內切酶BamHI和Hindlll處理 pUC118_up 和步驟（1)得到的sigl-down 片段，將sigl-down 插入到 pUCl 18_up 上得到 pUC118_ up-down質粒；以限制性內切酶BamHI和ΚρηΙ處理pUCl 18-up-down和步驟（1)得到的Sm11片 段，將Snf插入到pUCl 18-up-down上得到pUCl 18-up-down-Snf同源雙交換質粒； (3) 將pUCl 18-up-down-Snf質粒以自然轉化的方式轉入集胞藻PCC6803中，得到的轉化 子以不同濃度的鏈霉素進行篩選，并在DNA水平上進行鑒定，最終得到S110687基因完全敲 除的單克隆藻株，即對乙醇耐受性顯著提高的集胞藻PCC6803藻株，命名為ISm5。2. -種對乙醇耐受性顯著提高的集胞藻PCC6803藻株，其特征在于通過權利要求1所述 的構建方法構建得到。3. 根據權利要求2所述的對乙醇耐受性顯著提高的集胞藻PCC6803藻株，其特征在于： 所述的對乙醇耐受性顯著提高的集胞藻PCC6803藻株，在含1.5%v/v乙醇的BG11培養基中 的生長狀態明顯優于野生型藻株。4. 權利要求2或3所述的對乙醇耐受性顯著提高的集胞藻PCC6803藻株的應用，其特征 在于:所述的對乙醇耐受性顯著提高的集胞藻PCC6803藻株用于構建生產燃料乙醇的基因 工程菌。
【文檔編號】C12N15/65GK106086055SQ201610478393
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月23日
【發明人】陳谷, 丁清龍
【申請人】華南理工大學