一種重組蛋白a親和配基的定點固定化方法
【專利摘要】本發明提供一種重組蛋白質親和配基的定點固定化方法。該方法是通過基因工程手段將FGE識別基因序列插入到編碼目的蛋白質的基因序列末端，構建該目的蛋白質的表達載體，再將目的蛋白質與FGE在大腸桿菌中共表達，實現目的蛋白質的胞內醛基催化轉化。再通過介質表面的酰肼基團與蛋白質表面醛基的選擇性反應實現定點固定化。本發明的方法能夠將目的重組蛋白從細胞破碎上清中直接固定，條件溫和，步驟簡單，大大減少固定化的時間與成本。
【專利說明】-種重組蛋白A親和配基的定點固定化方法

【技術領域】
[0001] 本發明屬于蛋白質固定化領域，涉及一種蛋白質親和配基的定點固定化方法，尤 其涉及一種重組蛋白A親和配基的定點固定化方法。

【背景技術】
[0002] 近些年來，單克隆抗體類藥物發展迅猛，從1986年美國FDA批準第一個抗體類藥 物上市至2013年，已經有38個抗體類藥物成功上市。目前，在20種銷售額超過20億美 元的生物藥物中，單抗藥物占8種，并呈現逐年上升的趨勢。除了已經上市的單抗藥物外， 還有大量的單抗處于臨床研究中，這些單抗藥物治療疾病類型主要涉及惡性腫瘤、類風濕 關節炎等自身免疫性疾病及器官移植后的排斥反應等，由于單抗藥物針對特異性的疾病靶 點，因此與化療藥物相比，治療效果更為顯著，副作用更低，臨床應用前景十分廣闊。
[0003] 目前抗體類藥物在應用過程中存在的主要問題是售價昂貴，每支抗體類藥物往往 售價在萬元以上，導致使用人群受限。這種情況發生的原因是抗體的生產過程復雜，生產成 本高。其生產成本主要集中在分離純化模塊，該模塊約占總生產成本的60%?70%，其中， 用于抗體分離的基因重組蛋白A親和吸附填料售價昂貴是導致分離成本高的重要原因。目 前美國GE公司蛋白A親和吸附填料的售價每升高于10萬元人民幣，使用30個循環就需要 更換填料，抗體分離純化的費用主要集中于此。由于幾乎所有的單克隆抗體都需要采用蛋 白A親和色譜柱捕獲粗料液中的抗體組分，隨著單抗產業規模日益擴大，其對蛋白A色譜基 質的性能將有更高的要求，提高蛋白A親和色譜柱的性能、降低生產成本對于降低抗體類 藥物的價格至關重要。
[0004] 蛋白A親和色譜填料的制備成本與蛋白A售價及蛋白A與基質偶聯后其活性損失 密切相關。蛋白A(protein A)為金黃色葡萄球菌細胞壁蛋白質，具有5個能夠與抗體Fc 段特異性結合的結構域，作為親和色譜的配基具有特異性識別和捕捉抗體的能力。目前親 和色譜所用蛋白A均采用基因工程方法生產，一般采用重組腸桿菌發酵生產，在經過細胞 破碎、柱層析等一系列分離純化步驟后才能獲得高純度的基因重組蛋白A，生產過程復雜， 成本較高。目前每克基因重組蛋白A的售價為500-700美元，主要生產成本集中在柱層析 精分離段，每升蛋白A色譜填料需要15-20克的基因重組蛋白A，高的生產成本導致基因重 組蛋白A售價昂貴，使得蛋白A親和吸附填料的售價居高不下。此外，蛋白A與基質的化學 偶聯方式往往會導致固定化到固相色譜基質上的蛋白A不同程度的喪失其結合抗體的能 力。傳統的固定化方法主要利用蛋白A表面的氨基與固相基質表面的化學基團（如醛基或 N-羥基琥珀酰亞胺）進行化學交聯，但蛋白A表面含有多個氨基，這就造成蛋白A的隨機多 點固定化，使蛋白A朝向不固定，部分活性位點喪失功能，固定化單位蛋白A能力的降低導 致蛋白A親和色譜填料對抗體吸附容量降低。為了提高固定化蛋白A的抗體結合能力，目 前商品化的蛋白A親和色譜填料主要采用基因重組時在蛋白A的C末端加上1?3個半胱 氨酸，由于蛋白A本身不含有巰基，可以利用巰基與載體表面基團（如琥珀酰亞胺）反應實 現固定化，此方法能夠實現蛋白A末端的定點固定化，提高了單位固定化蛋白A的抗體吸附 量。但由于巰基的存在，需要提供還原反應環境以防止形成二硫鍵造成的蛋白A之間的聚 集，使得反應條件的控制變得非常重要。同時，末端巰基這種固定化方式僅適用于蛋白A這 種蛋白質序列中不含有半胱；氣酸及-硫鍵的特殊蛋白質，對于含有-硫鍵的蛋白質，還原 的固定化條件會導致蛋白質配基自身二硫鍵的破壞，使其還原為巰基而參與反應，不僅會 導致多點連接，也會破壞蛋白質配基的三維構象從而降低其與目標物的結合能力。因此，尋 找新的蛋白質表達方式及定點固定化方法對于降低親和色譜填料的成本并提高其性能至 關重要。而探索蛋白A表達方式及定點固定化方法對于降低抗體類藥物的售價至為關鍵。
[0005] 甲醜甘氨酸生成酶（Formylglycine generating enzyme, FGE)是一種能夠將蛋白 質特定序列上的半胱氨酸催化為甲酰甘氨酸的酶。該酶于2003年在硫酸酯酶的轉錄后活 化機制中被發現（Dierks T，et al. Cell, 2003, 113(4) :435-444)該酶的功能主要體現在： 在生物體內，FGE能夠催化I型硫酸酯酶上13個或6個保守氨基酸序列中的半胱氨酸變成 甲酰甘氨酸，使其在這種非同尋常的翻譯后或翻譯中修飾中衍生出一個醛基，這一特性對 于硫酸酯的進一步代謝至關重要。目前，還沒有FGE應用于蛋白A或其他蛋白質分離或固 定化系統中的報道。


【發明內容】

[0006] 本發明的目的是針對現有以蛋白質為配基的親和色譜填料存在的關鍵原料蛋白 質類配基生產成本高、末端巰基定點固定化所用的還原環境會破壞蛋白質自身的二硫鍵， 同時蛋白質自身的巰基同樣會參與反應從而影響定點固定化效果等共性問題，提供了一種 蛋白質親和配基的定點固定化方法，該方法無需精細純化重組蛋白質，從粗料液中直接定 點固定化蛋白質配基。
[0007] 本發明的目的是通過以下技術方案來實現的：
[0008] -種蛋白質親和配基的定點固定化方法，包括以下步驟：
[0009] (1)蛋白質基因序列末端加入SEQ ID NO. 1所不的基因序列，得到的基因序列連接 入表達載體I中，得目的蛋白表達載體；
[0010] ⑵將步驟⑴得到的目的蛋白表達載體和連接入FGE蛋白基因序列的表達載體 II同時轉化至宿主細胞，誘導蛋白表達；
[0011] (3)收集菌體，破碎菌體后離心，得細胞上清液；
[0012] (4)將步驟（3)得到的細胞上清液和帶有活性酰肼基或氧氨基的固相色譜基質混 合，加入催化劑，在pH 4?7、25?40°C下反應12?14小時，其中所述的催化劑為苯胺或 苯胺衍生物。
[0013] 在上述技術方案中，在步驟（1)中所述的蛋白質基因序列末端為5'末端或3'末 端。
[0014] 在上述所有技術方案中，在步驟（1)中所述的蛋白質基因序列優選為編碼蛋白A 的基因序列。編碼蛋白A的基因序列優選采用在全長基因中去掉編碼信號肽及膜結合域后 的，包括A、B、C、D、E五個抗體Fc段結合域的基因序列，基因全長為888bp，由SEQ ID NO. 2 所示。
[0015] 在上述所有技術方案中，所述的表達載體I和表達載體II的抗生素抗性不同。其 中載體I優選卡那霉素抗性，載體II優選氨節霉素抗性；所述的表達載體I優選pET28a， 表達載體II優選PBAD。表達載體I和表達載體II的抗生素抗性不同，當培養基中含有一定 濃度的兩種抗生素時，有利于防止兩種質粒的丟失，因為丟失了其中一種或兩種質粒的菌 體會被培養基中的抗生素殺死。
[0016] 在上述所有技術方案中，步驟（2)中所述的宿主細胞優選為大腸桿菌菌株，大腸 桿菌菌株優選BL21(DE3)。
[0017] 在上述所有技術方案中，在步驟（4)中所述的細胞上清液和帶有活性酰肼基團的 固相色譜基質的體積比為1:1?1:3 ;所述的催化劑在反應體系中的濃度為50?IOOmM,優 選為100mM。步驟（4)的反應中加入苯胺或苯胺衍生物作為催化劑提高反應速率，其中， pH優選4. 0，反應溫度優選37 °C，催化劑優選苯胺。
[0018] 在上述所有技術方案中，在步驟（4)中所述的固相色譜基質為瓊脂糖凝膠、硅膠 和有機聚合物微球。在本發明中對所述瓊脂糖凝膠、硅膠以及有機聚合物微球的粒徑、濃度 等不予具體限定，可以使用本領域常使用的適用于分離蛋白質以及單克隆抗體的所述固相 色譜基質的粒徑、濃度范圍內適當選擇使用。所述有機聚合物微球優選采用聚苯乙烯微球、 聚乙烯醇微球等。
[0019] 在本發明的技術方案中，在步驟（2)中所述的誘導蛋白表達，可以根據載體的誘 導體系，選用常規方法誘導。表達載體I和表達載體II的蛋白誘導表達體系可以相同，也 可以不同。但本發明優選采用蛋白誘導表達體系不同的表達載體I和表達載體II，且可以 首先誘導表達載體II中的FGE蛋白，繼而誘導表達載體I中的目的蛋白，這樣有利于控制 FGE的表達量以降低對目的蛋白表達的影響，而且先表達FGE能使后續表達的目的蛋白都 得到催化，提高醛基的轉化效率。表達載體I為pET28a，表達載體II為pBAD時，步驟（2)中 所述的誘導蛋白表達的方法為：同時轉化入目的蛋白表達載體和連接入FGE蛋白基因序列 的表達載體II后的宿主細胞，先在30?38°C下加入阿拉伯糖誘導FGE蛋白的表達，優選 37°C，表達時間控制在1?5小時，優選2小時、再將溫度降至18?30°C，優選20°C，加入 IPTG再誘導蛋白A表達12?16小時。
[0020] 本發明中，所述的蛋白質基因序列是指編碼該蛋白質的核昔酸序列。如蛋白A基 因序列是指編碼蛋白A的核苷酸序列。
[0021] 本發明的上述的制備方法制備得到醛基化標簽蛋白定點固定化的親和色譜填料， 該親和色譜填料可以應用于血漿中抗體的分離純化，經一次分離，每毫升獲得純度達到 洲^的抗體]^?]^!!^。
[0022] 本發明相對于現有技術具有如下優點和效果：
[0023] 1.本發明將FGE與帶有其催化反應特定序列的目的蛋白共表達，使目的蛋白在表 達過程中實現定點醛基化修飾，該醛基不能與蛋白質上的氨基發生穩定的希夫堿反應，僅 能和特定的酰肼基或氧氨基形成穩定的化學鍵，利用這一特點實現了細胞破碎上清液中帶 醛基標簽的目的蛋白（如蛋白A)的直接定點固定化，該方法省去了在蛋白A生產中占成本 主導地位的分離純化步驟，顯著降低了蛋白A親和色譜填料的生產成本，對降低抗體類藥 物的售價具有重要意義。
[0024] 2.本發明選擇蛋白質配基上唯一的醛基在溫和的反應條件下實現了定向固定化， 避免了現有末端巰基定向固定化方法所用的還原環境破壞蛋白質自身的二硫鍵，同時蛋白 質自身的巰基同樣會參與反應從而影響定點固定化效果等缺陷，提高了單位固定化蛋白質 配基的吸附效率。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0025] 圖1為蛋白A胞內醛基化修飾程度檢測SDS-PAGE電泳圖。其中，圖IA為SDS-PAGE 電泳凝膠的考馬斯亮藍染色結果；圖IB為SDS-PAGE電泳凝膠的熒光成像結果。圖IA和圖 IB中，泳道M :蛋白質標準分子量，泳道1 :不含FGE識別序列的高純度蛋白A與熒光分子反 應后的上清液；泳道2 :FGE與攜帶FGE識別序列蛋白A共表達的細胞破碎上清；泳道3 :FGE 與攜帶FGE識別序列蛋白A共表達的細胞破碎上清液與熒光分子反應后的上清液；泳道4 : 單表達攜帶FGE識別序列蛋白A的細胞破碎上清；泳道5 :單表達攜帶FGE識別序列蛋白A 的細胞破碎上清與熒光分子反應后的上清液。
[0026] 圖2為固定化蛋白A的純度檢測SDS-PAGE電泳圖。其中，泳道M :蛋白質標準分 子量；泳道1 :細胞破碎上清液，泳道2 :不使用催化劑固定化后的鹽酸羥胺洗脫上清；泳道 3 :使用IOOmM苯胺催化固定化后的鹽酸羥胺洗脫上清；泳道4 :使用IOmM對苯二胺催化固 定化后的鹽酸羥胺洗脫上清；泳道5:使用5mM 3, 5-二氨基苯甲酸催化固定化后的鹽酸羥 胺洗脫上清。
[0027] 圖3為利用醛基化標簽蛋白A定點固定化親和色譜填料分離人血清免疫球蛋白的 結果數據。其中，圖3A為分離色譜圖，其中：1 :流穿液色譜峰；2 :1M NaCl洗脫液色譜峰； 3 :pH 2. 5檸檬酸洗脫液色譜峰。圖3B為各色譜峰收集液的SDS-PAGE電泳圖。其中，泳道 M :蛋白質標準分子量；泳道S :人血清；泳道1 :流穿液；泳道2 :1M NaCl清洗的洗脫液；泳 道3 :pH 2. 5檸檬酸洗脫液。

【具體實施方式】
[0028] 下述非限制性實施例可以使本領域的普通技術人員更全面地理解本發明，但不以 任何方式限制本發明。下述實施例中，如無特殊說明，所使用的實驗方法均為常規方法，所 用材料、試劑等均可從生物或化學公司購買。
[0029] 實施例1.定點醛基化修飾蛋白A的制備
[0030] 1.載體的構建和轉化篩選：
[0031] 蛋白A基因序列：蛋白A的全長基因中去掉信號肽及膜結合域，將A、B、C、D、E五 個抗體Fc段結合域的基因序列作為蛋白A的基因序列，全長為888bp，如SEQ ID NO. 2所 /Jn 〇
[0032] 通過兩輪PCR擴增，將如SEQ ID NO. 1所示的FGE識別的特定序列插入到蛋白A 基因序列的5'末端，具體方法為：
[0033] (1)所用引物名稱以及其序列如表1，劃線部分為酶切位點。
[0034] 表1.弓丨物名稱以及其序列
[0035]

【權利要求】
1. 一種蛋白質親和配基的定點固定化方法，其特征在于，該定點固定化方法包括如下 步驟： (1) 蛋白質基因序列末端加入SEQ ID NO. 1所不的基因序列，得到的基因序列連接入表 達載體I中，得目的蛋白表達載體； (2) 將步驟（1)得到的目的蛋白表達載體和連接入FGE蛋白質基因序列的表達載體II 同時轉化至宿主細胞，誘導蛋白表達； (3) 收集菌體，破碎菌體后離心，得細胞上清液； (4) 將步驟（3)得到的細胞上清液和帶有活性酰肼基或氧氨基的固相色譜基質混合， 加入催化劑，在pH 4?7、25?40°C下反應12?14小時，其中所述的催化劑為苯胺或苯胺 衍生物。
2. 根據權利要求1所述的定點固定化方法，其特征在于，在步驟（1)中所述的蛋白質基 因序列末端為5'末端或3'末端。
3. 根據權利要求1所述的定點固定化方法，其特征在于，在步驟（1)中所述的蛋白質基 因序列為編碼蛋白A的基因序列。
4. 根據權利要求1所述的定點固定化方法，其特征在于，所述的表達載體I和表達載體 II的抗生素抗性不同。
5. 根據權利要求1所述的定點固定化方法，其特征在于，所述的表達載體I和表達載體 II的蛋白誘導表達系統不同。
6. 根據權利要求1所述的定點固定化方法，其特征在于，所述的表達載體I為pET28a， 表達載體II為pBAD。
7. 根據權利要求1所述的定點固定化方法，其特征在于，在步驟（4)中所述的細胞上清 液和帶有活性酰肼基或氧氨基的固相色譜基質的體積比為1:1?1:3 ;所述的催化劑在反 應體系中的濃度為50?lOOmM。
8. 根據權利要求1所述的定點固定化方法，其特征在于，在步驟（4)中所述的固相色譜 基質為瓊脂糖凝膠、硅膠和有機聚合物微球。
【文檔編號】B01D15/20GK104356238SQ201410546621
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年10月15日 優先權日:2014年10月15日
【發明者】賈凌云, 臧柏林, 任軍, 徐麗 申請人:大連理工大學