本發明(ming)屬于基因工(gong)程領域，涉及假單胞菌(jun)基因工(gong)程菌(jun)株(zhu)及其(qi)(qi)構建(jian)方法，尤其(qi)(qi)是一株(zhu)高產吩嗪(qin)-1-甲(jia)酰胺的基因工(gong)程菌(jun)株(zhu)及其(qi)(qi)構建(jian)方法。

背景技術：

我(wo)國(guo)(guo)常見(jian)的(de)農(nong)(nong)(nong)作物(wu)病害(hai)生(sheng)物(wu)達1600種，每年造成的(de)損失約為1000億人民幣，嚴重(zhong)地影響了(le)(le)我(wo)國(guo)(guo)農(nong)(nong)(nong)業(ye)的(de)發展。近些年，化(hua)學農(nong)(nong)(nong)藥(yao)(yao)的(de)大(da)規模使(shi)用導致了(le)(le)病蟲害(hai)的(de)抗(kang)藥(yao)(yao)性(xing)(xing)不(bu)斷增強。此(ci)外，高濃度和(he)(he)毒(du)性(xing)(xing)的(de)化(hua)學農(nong)(nong)(nong)藥(yao)(yao)的(de)應用，對(dui)農(nong)(nong)(nong)田(tian)、水環境也造成了(le)(le)很(hen)大(da)的(de)污染，嚴重(zhong)威脅著我(wo)國(guo)(guo)的(de)糧食安全和(he)(he)生(sheng)命(ming)健康。因此(ci)，低毒(du)性(xing)(xing)、低殘留和(he)(he)不(bu)易產(chan)生(sheng)抗(kang)藥(yao)(yao)性(xing)(xing)的(de)生(sheng)物(wu)農(nong)(nong)(nong)藥(yao)(yao)獲得(de)了(le)(le)各國(guo)(guo)政府(fu)和(he)(he)農(nong)(nong)(nong)藥(yao)(yao)企業(ye)的(de)極(ji)大(da)關注。

與化(hua)學(xue)農藥相比(bi)，生物農藥具有(you)毒(du)性(xing)低、對環境友(you)好和不易產生抗藥性(xing)等(deng)明顯優勢，已經吸(xi)引了越來(lai)越多(duo)學(xue)者的關注(zhu)并(bing)逐漸應用到生物防治實踐當中(zhong)(zhong)。其中(zhong)(zhong)，上海交通大學(xue)彭華松課題組率先利用銅綠假(jia)單胞(bao)菌株(zhu)M18開發(fa)出了具有(you)廣譜、高效、安(an)全和能有(you)效控制真菌性(xing)根(gen)腐(fu)和莖腐(fu)的生物農藥吩嗪(qin)-1-羧酸(phenazine-1-carboxylic acid，簡稱PCA，CAS號為2538-68-3)，定(ding)名為“申嗪(qin)霉(mei)(mei)素”，主要用于防治水稻紋枯病(bing)(bing)、小麥赤霉(mei)(mei)病(bing)(bing)、黃瓜和西(xi)瓜的枯萎(wei)病(bing)(bing)、甜瓜蔓(man)枯病(bing)(bing)、辣椒根(gen)腐(fu)病(bing)(bing)等(deng)，并(bing)獲得(de)了農業部頒發(fa)的新農藥藥證。

但(dan)最近相關研究(jiu)發現(xian)，與PCA相比，另一種吩嗪類抗生素(su)吩嗪-1-甲酰(xian)胺(phenazine-1-carboxamide，PCN)具有更(geng)好的(de)(de)安全性、穩(wen)定性及(ji)對(dui)植物病原菌(jun)(jun)的(de)(de)抑菌(jun)(jun)活性，在防治水稻紋枯病和小麥赤霉病等方面具有重要的(de)(de)應(ying)用(yong)價值。據報道，目前(qian)能(neng)合成PCN的(de)(de)微生物菌(jun)(jun)株(zhu)有綠針假單(dan)胞(bao)菌(jun)(jun)PCL1391，銅(tong)綠假單(dan)胞(bao)菌(jun)(jun)PAO1，PUPa3，PUP6，MML221等，但(dan)由于PCN產率較(jiao)低，尚未能(neng)大(da)規模推廣應(ying)用(yong)。上海交通(tong)大(da)學彭(peng)華松課(ke)題組對(dui)篩選的(de)(de)一株(zhu)綠針假單(dan)胞(bao)菌(jun)(jun)HT66進行(xing)基(ji)因工程(cheng)改(gai)造(zao)后，PCN的(de)(de)產量(liang)已經達到(dao)1800mg/L并申報了(le)中國發明(ming)專利(CN201310566864.5)，但(dan)是(shi)該產量(liang)距離(li)PCN的(de)(de)工業(ye)化應(ying)用(yong)還存在一定的(de)(de)距離(li)。因此，通(tong)過基(ji)因工程(cheng)技(ji)術(shu)進一步改(gai)造(zao)該菌(jun)(jun)株(zhu)將有利于提高(gao)PCN產量(liang)，實現(xian)其(qi)農業(ye)應(ying)用(yong)。

技術實現要素：

針對現有技術中的(de)(de)缺陷(xian)，本發(fa)明的(de)(de)目(mu)的(de)(de)是提供(gong)一(yi)株高產吩(fen)嗪-1-甲酰胺(an)的(de)(de)基因工(gong)(gong)程菌株及其構建方法，克服現有菌株生(sheng)產吩(fen)嗪-1-甲酰胺(an)產量和效率(lv)較低(di)的(de)(de)缺陷(xian)，提供(gong)一(yi)種用于生(sheng)產吩(fen)嗪-1-甲酰胺(an)的(de)(de)基因工(gong)(gong)程菌株及其用途。

本(ben)發明的(de)(de)(de)目的(de)(de)(de)是通過以下技術方案來實現(xian)的(de)(de)(de)：

第一方面，本發明(ming)涉及一株(zhu)高產吩(fen)嗪-1-甲酰胺的(de)基因(yin)(yin)工(gong)程菌(jun)株(zhu)，具體是敲除(chu)綠針假單胞菌(jun)(Pseudomonas chlororaphis)HT66 CCTCC NO:M 2013467基因(yin)(yin)組的(de)lon基因(yin)(yin)、parS基因(yin)(yin)中的(de)一個或(huo)兩(liang)個基因(yin)(yin)而得到基因(yin)(yin)工(gong)程菌(jun)株(zhu)；

或者，敲除綠針假(jia)單(dan)胞菌(Pseudomonas chlororaphis)HT66 CCTCC NO:M 2013467rpeA、psrA單(dan)突變株或者雙突變株基(ji)(ji)因(yin)組的lon基(ji)(ji)因(yin)、parS基(ji)(ji)因(yin)中的一個或兩(liang)個基(ji)(ji)因(yin)而得到基(ji)(ji)因(yin)工程菌株；其中，所述單(dan)突變株為HT66ΔrpeA、HT66ΔpsrA，雙突變株為HT66ΔrpeAΔpsrA。

優選地(di)，所(suo)述lon基因的堿(jian)基序列(lie)如SEQ ID NO.1所(suo)示(shi)；所(suo)述parS基因的堿(jian)基序列(lie)如SEQ ID NO.2所(suo)示(shi)。

優選(xuan)地，所(suo)述(shu)(shu)基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)工(gong)程(cheng)菌(jun)(jun)株(zhu)(zhu)(zhu)(zhu)為(wei)HT66Δlon、HT66ΔparS、HT66ΔlonΔparS、HT66ΔlonΔrpeA、HT66ΔparSΔrpeA、HT66ΔlonΔparSΔrpeA、HT66ΔlonΔpsrA、HT66ΔpsrAΔparS、HT66ΔlonΔparSΔpsrA、HT66ΔlonΔparSΔpsrAΔrpeA、HT66ΔlonΔpsrAΔrpeA、HT66ΔparSΔpsrAΔrpeA。其中，所(suo)述(shu)(shu)基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)工(gong)程(cheng)菌(jun)(jun)株(zhu)(zhu)(zhu)(zhu)HT66Δlon是敲除(chu)綠(lv)針假(jia)單(dan)(dan)胞(bao)菌(jun)(jun)(Pseudomonas chlororaphis)HT66 CCTCC NO:M 2013467基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)組(zu)(zu)的lon基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)而得到(dao)基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)工(gong)程(cheng)菌(jun)(jun)株(zhu)(zhu)(zhu)(zhu)；所(suo)述(shu)(shu)基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)工(gong)程(cheng)菌(jun)(jun)株(zhu)(zhu)(zhu)(zhu)HT66ΔparS是敲除(chu)綠(lv)針假(jia)單(dan)(dan)胞(bao)菌(jun)(jun)(Pseudomonas chlororaphis)HT66 CCTCC NO:M 2013467基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)組(zu)(zu)的parS基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)而得到(dao)基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)工(gong)程(cheng)菌(jun)(jun)株(zhu)(zhu)(zhu)(zhu)；所(suo)述(shu)(shu)基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)工(gong)程(cheng)菌(jun)(jun)株(zhu)(zhu)(zhu)(zhu)HT66ΔlonΔparS是敲除(chu)綠(lv)針假(jia)單(dan)(dan)胞(bao)菌(jun)(jun)(Pseudomonas chlororaphis)HT66 CCTCC NO:M 2013467基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)組(zu)(zu)的lon基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)、parS基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)而得到(dao)基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)工(gong)程(cheng)菌(jun)(jun)株(zhu)(zhu)(zhu)(zhu)。

更(geng)優(you)選地(di)，所述(shu)基因(yin)工程(cheng)菌株為(wei)HT66ΔlonΔparS、HT66ΔlonΔrpeA、HT66ΔparSΔrpeA、HT66ΔlonΔparSΔrpeA、HT66ΔlonΔpsrA、HT66ΔlonΔparSΔpsrA、HT66ΔlonΔparSΔpsrAΔrpeA、HT66ΔlonΔpsrAΔrpeA。

第二方面，本發明還涉(she)及所述高產(chan)吩嗪-1-甲酰胺(an)的基(ji)(ji)(ji)因工程(cheng)菌株(zhu)的構建方法，具(ju)體是：敲除綠針假(jia)單胞菌(Pseudomonas chlororaphis)HT66 CCTCC NO:M 2013467基(ji)(ji)(ji)因組的lon基(ji)(ji)(ji)因、parS基(ji)(ji)(ji)因中的一(yi)個基(ji)(ji)(ji)因或兩個基(ji)(ji)(ji)因，即可；

或者(zhe)(zhe)，敲除綠針假單(dan)(dan)胞菌(jun)(Pseudomonas chlororaphis)HT66 CCTCC NO:M 2013467 rpeA、psrA單(dan)(dan)突變(bian)株(zhu)或者(zhe)(zhe)雙突變(bian)株(zhu)基(ji)(ji)因(yin)組的lon基(ji)(ji)因(yin)、parS基(ji)(ji)因(yin)中的一個或兩個基(ji)(ji)因(yin)而得到(dao)基(ji)(ji)因(yin)工程菌(jun)株(zhu)；其中，所述單(dan)(dan)突變(bian)株(zhu)為HT66ΔrpeA、HT66ΔpsrA，雙突變(bian)株(zhu)為HT66ΔrpeAΔpsrA。

優選地，所述lon基(ji)(ji)(ji)因的堿(jian)基(ji)(ji)(ji)序列如SEQ ID NO.1所示(shi)；所述parS基(ji)(ji)(ji)因的堿(jian)基(ji)(ji)(ji)序列如SEQ ID NO.2所示(shi)。

優選地，所述(shu)構(gou)建方(fang)法中(zhong)，敲除綠針假單(dan)胞(bao)菌(jun)(Pseudomonas chlororaphis)HT66 CCTCC NO:M 2013467基因(yin)(yin)組的lon基因(yin)(yin)、parS基因(yin)(yin)中(zhong)的一個基因(yin)(yin)的步驟具體包括：

i、擴增lon基因(yin)或parS基因(yin)片段的上(shang)下游同(tong)源臂；

ii、采(cai)用融合PCR法連(lian)接上下(xia)游同源臂并插入pK18mobsacB質粒中(zhong)得lon基(ji)因或parS基(ji)因重組質粒；

iii、(a)使lon基因(yin)重組(zu)質(zhi)粒上的lon基因(yin)上下游同源臂片段(duan)與HT66、HT66ΔparS、HT66ΔrpeA、HT66ΔrpeAΔparS、HT66ΔpsrA、HT66ΔpsrAΔparS、HT66ΔrpeAΔpsrA、HT66ΔrpeAΔpsrAΔparS基因(yin)組(zu)中(zhong)的lon基因(yin)發生(sheng)同源重組(zu)；

或(b)使parS基(ji)因重組(zu)質粒上(shang)的(de)parS基(ji)因上(shang)下游同(tong)源臂(bei)片段與HT66、HT66Δlon、HT66ΔrpeA、HT66ΔrpeAΔlon、HT66ΔpsrA、HT66ΔpsrAΔlon、HT66ΔrpeAΔpsrA、HT66ΔrpeAΔpsrAΔlon基(ji)因組(zu)中的(de)parS基(ji)因發生(sheng)同(tong)源重組(zu)；

篩(shai)選陽(yang)性克隆(long)，即得。

上述敲除中，所(suo)述pK18mobsacB質粒為(wei)假單胞菌和大腸桿(gan)菌的穿梭質粒。

第三(san)方面，本發明(ming)提供一(yi)種基(ji)于所述基(ji)因工程菌(jun)株(zhu)的吩嗪-1-甲酰胺合成方法，具體包括(kuo)如下步驟：將所述基(ji)因工程菌(jun)株(zhu)的種子發酵液接種于KB發酵培養基(ji)中(zhong)，培養，即可。

優選地，所述(shu)(shu)種子(zi)發酵液(ye)的(de)制備具體(ti)為：將所述(shu)(shu)基(ji)因工程菌株接種于(yu)KB培養基(ji)中，置于(yu)28℃、180轉/分下培養至OD600為0.5～2.0，即得。

優選地，所述(shu)培養的條(tiao)件具體為(wei)：24～30℃、100～300轉(zhuan)/分(fen)鐘、24～72h。

優(you)選地，所述(shu)種(zhong)子(zi)發酵液與所述(shu)KB發酵培養基的體積比為(1～10):100。

與現有技術相比，本發明的具(ju)備(bei)如下有益效果(guo)：

本發(fa)明具體(ti)是以綠針假單(dan)胞菌(jun)HT66為出發(fa)菌(jun)株(zhu)(zhu)，通過(guo)基因工程(cheng)技術從HT66菌(jun)株(zhu)(zhu)基因組(zu)中分別(bie)或(huo)者同時敲除吩嗪(qin)合(he)成過(guo)程(cheng)中的(de)lon、parS負調控基因，構(gou)建HT66Δlon、HT66ΔparS、HT66ΔlonΔparS基因工程(cheng)菌(jun)株(zhu)(zhu)，使得吩嗪(qin)-1-甲酰胺(phenazine-1-carboxamide,CAS號(hao)為550-89-0，簡稱PCN)的(de)產量大幅(fu)提高，能夠更加有效由于生物防治。其中，基因工程(cheng)菌(jun)株(zhu)(zhu)HT66ΔlonΔparS具有最(zui)佳效果。

附圖說明

通過閱(yue)讀參照以(yi)下附圖對非限制性(xing)實施例所作的詳細描述，本發明(ming)的其它(ta)特征、目的和優(you)點將會變(bian)得更明(ming)顯(xian)：

圖1為(wei)綠針假單胞(bao)菌HT66和lon敲(qiao)除突(tu)變株(zhu)中分別以(yi)內外部引(yin)物PCR擴增lon基因及其上下游(you)片段(duan)的電泳圖；

其中，從左到右依次為(wei)marker，HT66Δlon，HT66，空白對(dui)照(zhao)；

圖2為HT66Δlon、HT66ΔparS、HT66ΔlonΔparS基因工(gong)程菌的生長曲線圖；

圖3為HT66HT66Δlon、HT66ΔparS、HT66ΔlonΔparS基因工程菌(jun)的吩(fen)嗪-1-甲酰胺產量圖；

圖(tu)4為(wei)HT66ΔlonΔrpeA基(ji)因工(gong)程菌的生(sheng)長(chang)曲線圖(tu)；

圖5為HT66ΔlonΔrpeA基因(yin)工(gong)程菌的吩嗪-1-甲酰(xian)胺(an)產量圖；

圖6為HT66ΔparSΔrpeA基(ji)因工程菌的生長曲線圖；

圖7為HT66ΔparSΔrpeA基因工程(cheng)菌的吩嗪-1-甲(jia)酰胺產量圖；

圖8為(wei)HT66ΔlonΔparSΔrpeA基因工(gong)程(cheng)菌(jun)的生長曲線(xian)圖；

圖9為HT66ΔlonΔparSΔrpeA基因(yin)工程(cheng)菌的吩嗪-1-甲酰胺產量(liang)圖；

圖(tu)10為HT66ΔlonΔpsrA基因工程菌的生(sheng)長(chang)曲(qu)線圖(tu)；

圖11為(wei)HT66ΔlonΔpsrA基(ji)因工程菌(jun)的吩嗪-1-甲酰胺產(chan)量(liang)圖；

圖12為HT66ΔpsrAΔparS基因工程(cheng)菌的生長曲線圖；

圖(tu)13為HT66ΔpsrAΔparS基因工程菌的吩嗪-1-甲酰胺產量圖(tu)；

圖(tu)14為HT66ΔlonΔparSΔpsrA基(ji)因(yin)工程菌的生長(chang)曲線圖(tu)；

圖(tu)15為HT66ΔlonΔparSΔpsrA基因工程菌的吩(fen)嗪-1-甲酰(xian)胺產量(liang)圖(tu)；

圖16為HT66ΔlonΔparSΔpsrAΔrpeA基因工程菌的吩(fen)嗪-1-甲酰(xian)胺產(chan)量圖；

圖17為HT66ΔlonΔpsrAΔrpeA基因工(gong)程菌(jun)的吩嗪-1-甲酰胺產(chan)量圖；

圖(tu)18為HT66ΔparSΔpsrAΔrpeA基(ji)因工程(cheng)菌的吩嗪-1-甲酰胺產量圖(tu)。

具體實施方式

下面結合(he)具體實(shi)施例對本(ben)(ben)發明(ming)(ming)進行詳細說明(ming)(ming)。以下實(shi)施例將有(you)助于本(ben)(ben)領(ling)域的(de)技術(shu)人員(yuan)進一步理解(jie)本(ben)(ben)發明(ming)(ming)，但不以任何(he)形式限制(zhi)本(ben)(ben)發明(ming)(ming)。應(ying)當指出的(de)是，對本(ben)(ben)領(ling)域的(de)普通(tong)技術(shu)人員(yuan)來說，在(zai)不脫(tuo)離(li)本(ben)(ben)發明(ming)(ming)構思的(de)前提下，還可以做出若干(gan)變形和改進。這些都屬于本(ben)(ben)發明(ming)(ming)的(de)保護(hu)范圍。

本發明的綠針假單胞菌(jun)(Pseudomonas choloraphis)HT66，該菌(jun)株已在(zai)中國典型培(pei)養(yang)物保(bao)藏中心(簡稱(cheng)CCTCC)保(bao)藏，保(bao)藏單位地址為：中國.武漢.武漢大學，郵編(bian)為：430072，保(bao)藏日期為：2013年(nian)10月12日，保(bao)藏編(bian)號為：CCTCC NO:M 2013467。

實施例1、lon基因體外突變體的構建

根據綠針(zhen)假單胞(bao)菌HT66基(ji)因組中lon基(ji)因及其上下(xia)游序列設計引(yin)物(見表1)：

表1

以該(gai)基因(yin)組DNA為模(mo)板，擴(kuo)增基因(yin)組中的相應(ying)片段。

將(jiang)上下游PCR產(chan)物通過(guo)融合PCR連(lian)接，并(bing)將(jiang)融合PCR產(chan)物與pK18mobsacB載體(ti)分別使用(yong)EcoRI和(he)XbaI酶切，過(guo)柱回收，使用(yong)T4連(lian)接酶連(lian)接，獲得體(ti)外突(tu)變質粒(li)。

用體外突(tu)變質粒(li)轉(zhuan)化大(da)腸桿菌S17。將攜帶重組(zu)質粒(li)的(de)(de)S17菌株(zhu)(zhu)充分(fen)活化，接種于含有卡(ka)(ka)那霉素50mg/L的(de)(de)LB培養(yang)基中，37℃，180轉(zhuan)/分(fen)培養(yang)12h。將充分(fen)活化的(de)(de)HT66菌株(zhu)(zhu)接種于LB培養(yang)基中，28℃，180轉(zhuan)/分(fen)培養(yang)12h。5000轉(zhuan)/分(fen)收集并(bing)洗滌兩種菌體，LB培養(yang)基重懸(xuan)并(bing)以HT66：S17濃度(du)比為3:1的(de)(de)比例(li)混(hun)合(he)與EP管中，靜置1h；取(qu)(qu)混(hun)合(he)菌液點在LB平(ping)(ping)板(ban)中，28℃培養(yang)24h；刮取(qu)(qu)長出來的(de)(de)混(hun)合(he)菌落(luo)于LB中重懸(xuan)，稀釋(shi)涂布于卡(ka)(ka)那霉素50mg/L，氨芐霉素100mg/L的(de)(de)LB平(ping)(ping)板(ban)上，28℃培養(yang)2～3d后挑(tiao)取(qu)(qu)單(dan)(dan)克隆(long)涂布10％蔗糖平(ping)(ping)板(ban)中，28℃培養(yang)1～2d；挑(tiao)取(qu)(qu)蔗糖平(ping)(ping)板(ban)上的(de)(de)單(dan)(dan)克隆(long)，分(fen)別點在卡(ka)(ka)那霉素50mg/L的(de)(de)抗性(xing)LB平(ping)(ping)板(ban)及無抗LB平(ping)(ping)板(ban)上，培養(yang)12～24h；挑(tiao)取(qu)(qu)在卡(ka)(ka)那霉素50mg/L抗性(xing)平(ping)(ping)板(ban)上不生長，但在無抗平(ping)(ping)板(ban)上能夠正常生長的(de)(de)單(dan)(dan)菌落(luo)，即為同(tong)源重組(zu)成功的(de)(de)菌落(luo)。PCR驗(yan)證HT66菌株(zhu)(zhu)的(de)(de)lon基因被敲除(chu)，并(bing)命名為HT66Δlon。

圖1為綠(lv)針假單胞菌HT66和lon敲(qiao)除突變株中分(fen)別以內外(wai)部引(yin)物(wu)PCR擴(kuo)增(zeng)lon基(ji)因及其上下游片段(duan)的電泳圖；其中，M，Marker；Δ，lon基(ji)因敲(qiao)除株HT66Δlon；WT，野生株HT66；N，空白對照組。左側引(yin)物(wu)為內部引(yin)物(wu)lon-F/lon-R，右側引(yin)物(wu)為外(wai)部引(yin)物(wu)lon-F1/lon-R2。內外(wai)部引(yin)物(wu)擴(kuo)增(zeng)結(jie)果表明(ming)，lon基(ji)因已被成功敲(qiao)除。

實施例2、parS基因體外突變體的構建

根據綠(lv)針假單胞菌HT66基因(yin)組(zu)中(zhong)parS及上(shang)下游序列設計引(yin)物(見表2)：

表2

以該基(ji)因組(zu)DNA為模板(ban)，擴(kuo)增(zeng)基(ji)因組(zu)中的相(xiang)應片段(duan)。

將(jiang)上下游PCR產物(wu)通過(guo)融(rong)合(he)PCR連接(jie)，并將(jiang)融(rong)合(he)PCR產物(wu)與pK18mobsacB載體分別使(shi)用BamHI和HindIII酶(mei)切(qie)，過(guo)柱回收，使(shi)用T4連接(jie)酶(mei)連接(jie)，獲得(de)體外突變質粒。

用所得(de)體(ti)外突變質粒(li)轉化(hua)大腸桿菌(jun)S17。將(jiang)攜帶重組質粒(li)的(de)(de)S17菌(jun)株充(chong)分活化(hua)，接種(zhong)(zhong)于(yu)含有(you)卡(ka)那霉(mei)(mei)(mei)素(su)50mg/L的(de)(de)LB培(pei)(pei)養(yang)基(ji)中(zhong)，37℃，180轉/分培(pei)(pei)養(yang)12h。將(jiang)充(chong)分活化(hua)的(de)(de)HT66菌(jun)株接種(zhong)(zhong)于(yu)LB培(pei)(pei)養(yang)基(ji)中(zhong)，28℃，180轉/分培(pei)(pei)養(yang)12h。5000轉/分收(shou)集(ji)并洗滌(di)兩種(zhong)(zhong)菌(jun)體(ti)，LB培(pei)(pei)養(yang)基(ji)重懸并以HT66：S17濃度比為(wei)3:1的(de)(de)比例混(hun)合(he)(he)與EP管中(zhong)，靜置1h；取混(hun)合(he)(he)菌(jun)液點在LB平(ping)板(ban)中(zhong)，28℃培(pei)(pei)養(yang)24h；刮取長(chang)出來的(de)(de)混(hun)合(he)(he)菌(jun)落于(yu)LB中(zhong)重懸，稀釋(shi)涂(tu)布于(yu)卡(ka)那霉(mei)(mei)(mei)素(su)50mg/L，氨芐霉(mei)(mei)(mei)素(su)100mg/L的(de)(de)LB平(ping)板(ban)上，28℃培(pei)(pei)養(yang)2～3d后(hou)挑(tiao)取單(dan)克隆涂(tu)布10％蔗糖平(ping)板(ban)中(zhong)，28℃培(pei)(pei)養(yang)1～2d；挑(tiao)取蔗糖平(ping)板(ban)上的(de)(de)單(dan)克隆，分別點在卡(ka)那霉(mei)(mei)(mei)素(su)50mg/L的(de)(de)抗性LB平(ping)板(ban)及(ji)無抗LB平(ping)板(ban)上，培(pei)(pei)養(yang)12～24h；挑(tiao)取在卡(ka)那霉(mei)(mei)(mei)素(su)50mg/L抗性平(ping)板(ban)上不生長(chang)，但在無抗平(ping)板(ban)上能夠(gou)正常生長(chang)的(de)(de)單(dan)菌(jun)落，即為(wei)同源重組成(cheng)功的(de)(de)菌(jun)落。PCR驗證HT66菌(jun)株的(de)(de)parS基(ji)因被敲除，并命名為(wei)HT66ΔparS。

實施例3、lon和parS雙突變株HT66ΔlonΔparS的構建

將攜帶parS重(zhong)組(zu)質粒的S17菌(jun)株(zhu)充分(fen)活化，接(jie)種于(yu)含有卡(ka)那(nei)霉素50mg/L的LB培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)基(ji)中(zhong)(zhong)(zhong)，37℃，180轉(zhuan)/分(fen)培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)12h。將充分(fen)活化的HT66Δlon菌(jun)株(zhu)接(jie)種于(yu)LB培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)基(ji)中(zhong)(zhong)(zhong)，28℃，180轉(zhuan)/分(fen)培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)12h。5000轉(zhuan)/分(fen)收集并洗滌兩種菌(jun)體(ti)，LB培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)基(ji)重(zhong)懸(xuan)并以HT66Δlon：S17濃度(du)比為3:1的比例混合(he)與EP管(guan)中(zhong)(zhong)(zhong)，靜置(zhi)1h；取混合(he)菌(jun)液(ye)點(dian)在LB平(ping)(ping)(ping)板(ban)(ban)中(zhong)(zhong)(zhong)，28℃培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)24h；刮取長出來(lai)的混合(he)菌(jun)落于(yu)LB中(zhong)(zhong)(zhong)重(zhong)懸(xuan)，稀釋涂(tu)布于(yu)卡(ka)那(nei)霉素50mg/L，氨芐霉素100mg/L的LB平(ping)(ping)(ping)板(ban)(ban)上(shang)，28℃培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)2～3d后挑(tiao)取單克(ke)隆(long)涂(tu)布10％蔗糖(tang)(tang)平(ping)(ping)(ping)板(ban)(ban)中(zhong)(zhong)(zhong)，28℃培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)1～2d；挑(tiao)取蔗糖(tang)(tang)平(ping)(ping)(ping)板(ban)(ban)上(shang)的單克(ke)隆(long)，分(fen)別點(dian)在卡(ka)那(nei)霉素50mg/L的抗(kang)性LB平(ping)(ping)(ping)板(ban)(ban)及無(wu)抗(kang)LB平(ping)(ping)(ping)板(ban)(ban)上(shang)，培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)12～24h；挑(tiao)取在卡(ka)那(nei)霉素50mg/L抗(kang)性平(ping)(ping)(ping)板(ban)(ban)上(shang)不生長，但在無(wu)抗(kang)平(ping)(ping)(ping)板(ban)(ban)上(shang)能夠(gou)正常生長的單菌(jun)落，即為同源重(zhong)組(zu)成功的菌(jun)落。PCR驗證HT66Δlon菌(jun)株(zhu)的parS基(ji)因(yin)被敲除，并命名為HT66ΔlonΔparS。

實施例4、假單胞菌HT66及基因工程菌株HT66ΔlonΔparS的生長曲線測定

將菌株(zhu)充分活化并接種(zhong)于新鮮(xian)的KB培(pei)養(yang)(yang)基中，培(pei)養(yang)(yang)過(guo)夜后以最(zui)初OD600為0.02的濃度(du)接種(zhong)于發酵培(pei)養(yang)(yang)基，28℃，180轉(zhuan)/分培(pei)養(yang)(yang)2～3d，并以一定的時(shi)間(jian)間(jian)隔測定菌液OD600。

圖2為綠針假(jia)單胞菌(jun)HT66及(ji)其(qi)(qi)不同基因(yin)(yin)工程(cheng)菌(jun)株(zhu)(zhu)(zhu)的(de)生(sheng)長曲線。由圖可知，敲(qiao)除parS基因(yin)(yin)對菌(jun)株(zhu)(zhu)(zhu)的(de)生(sheng)長影(ying)響不打；敲(qiao)除lon基因(yin)(yin)會使菌(jun)株(zhu)(zhu)(zhu)穩定期的(de)OD600值略(lve)微(wei)下(xia)降，其(qi)(qi)中以雙敲(qiao)除株(zhu)(zhu)(zhu)HT66ΔlonΔparS的(de)穩定期OD600值最(zui)低，說明兩個基因(yin)(yin)對菌(jun)體的(de)生(sheng)長有著復(fu)雜的(de)影(ying)響。

實施例5、基因工程菌HT66ΔlonΔparS中PCN的生物合成

將(jiang)活(huo)化(hua)后的(de)(de)綠針假單(dan)胞(bao)菌(jun)(jun)HT66及其基(ji)因工(gong)程菌(jun)(jun)株HT66ΔparS、HT66Δlon、HT66ΔlonΔparS分(fen)別接種(zhong)于KB培(pei)養(yang)(yang)基(ji)中(zhong)，置于28℃恒溫搖床(chuang)(180轉(zhuan)/分(fen))培(pei)養(yang)(yang)至OD600為0.5～2.0之(zhi)間時，將(jiang)上述菌(jun)(jun)液以1～10:100的(de)(de)體積比(bi)，加入到新(xin)鮮的(de)(de)KB發酵培(pei)養(yang)(yang)基(ji)中(zhong)，24～30℃振蕩培(pei)養(yang)(yang)，搖床(chuang)轉(zhuan)速100～300轉(zhuan)/分(fen)鐘(zhong)，培(pei)養(yang)(yang)24～72h后收取菌(jun)(jun)液。取發酵液0.5mL加入3mL乙酸乙酯(zhi)充分(fen)萃取后，取0.2mL有機相吹(chui)干后用乙腈溶(rong)解，并通過HPLC檢測(ce)發酵液中(zhong)吩嗪-1-甲酰胺產(chan)量。

HPLC檢測條件：

流動相為(wei)乙(yi)(yi)腈-25mM乙(yi)(yi)酸(suan)(suan)銨(an)，色(se)譜柱為(wei)WondaSilC18-WRreversephasecolumn(5μm；4.6X250mm,Shimadzu,Japan)，檢測波長(chang)為(wei)254nm，檢測條件：0～2min，8％乙(yi)(yi)腈-92％25mM乙(yi)(yi)酸(suan)(suan)銨(an)，2-20min，乙(yi)(yi)腈濃度從(cong)8％升至(zhi)60％，乙(yi)(yi)酸(suan)(suan)銨(an)濃度從(cong)92％下降至(zhi)40％，20～21min，8％乙(yi)(yi)腈-92％25mM乙(yi)(yi)酸(suan)(suan)銨(an)。

圖(tu)3為綠針假單(dan)胞(bao)菌HT66不同基因工(gong)程菌株(zhu)及野生(sheng)株(zhu)中吩(fen)嗪-1-甲酰胺(an)的產量變化(hua)圖(tu)。由(you)圖(tu)可(ke)知，敲(qiao)除(chu)parS基因導致了PCN的產量由(you)野生(sheng)株(zhu)的425mg/L上(shang)升到1102mg/L，敲(qiao)除(chu)lon基因使PCN的產量由(you)野生(sheng)株(zhu)的425mg/L上(shang)升到2053mg/L；兩個基因的雙(shuang)突變株(zhu)中PCN產量達到2425mg/L，為野生(sheng)株(zhu)的5.71倍。

實施例6

本實施例提供(gong)了一株(zhu)高(gao)產(chan)吩嗪(qin)-1-甲酰胺的基(ji)(ji)因(yin)工程菌株(zhu)，具體是(shi)通過敲除綠針假單胞菌(Pseudomonas chlororaphis)HT66 CCTCC NO:M 2013467rpeA、psrA單突變株(zhu)或者雙突變株(zhu)基(ji)(ji)因(yin)組(zu)的lon基(ji)(ji)因(yin)、parS基(ji)(ji)因(yin)中的一個或兩個基(ji)(ji)因(yin)而(er)得到基(ji)(ji)因(yin)工程菌株(zhu)；

其中，綠(lv)針假單胞菌(Pseudomonas chlororaphis)HT66 CCTCC NO:M 2013467 rpeA、psrA單突(tu)變株(zhu)分為(wei)(wei)HT66ΔrpeA、HT66ΔpsrA，雙突(tu)變株(zhu)為(wei)(wei)HT66ΔrpeAΔpsrA；上述(shu)單突(tu)變株(zhu)及雙突(tu)變株(zhu)相關信息公開于在先申請CN 103642714 A中。

參照(zhao)實(shi)施(shi)例1至3提供的(de)方法，將基因工(gong)(gong)程菌(jun)株(zhu)HT66ΔrpeA、HT66ΔpsrA、HT66ΔrpeAΔpsrA的(de)lon基因、parS基因中的(de)一(yi)個(ge)進行敲除(chu)或者兩個(ge)同(tong)時敲除(chu)，即(ji)得；包括基因工(gong)(gong)程菌(jun)株(zhu)HT66ΔlonΔrpeA、HT66ΔparSΔrpeA、HT66ΔlonΔparSΔrpeA、HT66ΔlonΔpsrA、HT66ΔpsrAΔparS、HT66ΔlonΔparSΔpsrA、HT66ΔlonΔparSΔpsrAΔrpeA、HT66ΔlonΔpsrAΔrpeA、HT66ΔparSΔpsrAΔrpeA。上述(shu)基因工(gong)(gong)程菌(jun)株(zhu)生(sheng)長情況(kuang)及PCN產量情況(kuang)如圖4至圖18所示。其中：

圖4為HT66ΔlonΔrpeA基因(yin)工程菌的生(sheng)長曲線(xian)圖；

圖(tu)5為(wei)HT66ΔlonΔrpeA基(ji)因工程(cheng)菌的吩(fen)嗪-1-甲酰胺產量圖(tu)；

圖6為HT66ΔparSΔrpeA基因工(gong)程菌的生長曲線(xian)圖；

圖7為(wei)HT66ΔparSΔrpeA基因工程菌的吩嗪-1-甲(jia)酰胺產量圖；

圖8為HT66ΔlonΔparSΔrpeA基因(yin)工(gong)程(cheng)菌的生長曲線圖；

圖9為HT66ΔlonΔparSΔrpeA基因工(gong)程(cheng)菌的吩嗪-1-甲酰胺(an)產量圖；

圖10為HT66ΔlonΔpsrA基因工(gong)程菌的生長曲線圖；

圖11為HT66ΔlonΔpsrA基(ji)因(yin)工程菌的吩(fen)嗪(qin)-1-甲酰(xian)胺產量圖；

圖(tu)12為(wei)HT66ΔpsrAΔparS基因工程菌的生(sheng)長曲線圖(tu)；

圖13為(wei)HT66ΔpsrAΔparS基因工(gong)程(cheng)菌的吩嗪-1-甲酰胺產量圖；

圖(tu)14為HT66ΔlonΔparSΔpsrA基因工程菌的生長曲線(xian)圖(tu)；

圖(tu)15為HT66ΔlonΔparSΔpsrA基因工程(cheng)菌的吩嗪-1-甲酰胺產量圖(tu)；

圖(tu)16為HT66ΔlonΔparSΔpsrAΔrpeA基因工程菌(jun)的吩嗪(qin)-1-甲(jia)酰胺產量圖(tu)；

圖(tu)17為HT66ΔlonΔpsrAΔrpeA基因工程菌的吩嗪(qin)-1-甲酰(xian)胺(an)產量圖(tu)；

圖18為HT66ΔparSΔpsrAΔrpeA基因工程菌的(de)吩嗪-1-甲酰胺產(chan)量圖。

本發(fa)明(ming)具(ju)體是以綠針假單(dan)胞菌HT66為出發(fa)菌株，通(tong)過(guo)基(ji)(ji)因工(gong)程技(ji)術從HT66菌株及其已知(zhi)突(tu)變株基(ji)(ji)因組中分別或者同時敲除吩嗪合成過(guo)程中的lon、parS負調控基(ji)(ji)因，構建lon、parS基(ji)(ji)因單(dan)基(ji)(ji)因突(tu)變株或雙基(ji)(ji)因工(gong)程菌株，使得吩嗪-1-甲(jia)酰胺(an)(phenazine-1-carboxamide,CAS號為550-89-0，簡稱PCN)的產量大幅提高，能夠更(geng)加有(you)效(xiao)由于生物防治。

以上對本發(fa)明(ming)(ming)的(de)(de)具(ju)體(ti)實施例進(jin)行了描(miao)述(shu)(shu)。需(xu)要理(li)解的(de)(de)是(shi)，本發(fa)明(ming)(ming)并(bing)不局(ju)限于上述(shu)(shu)特定實施方式，本領域技(ji)術人員可以在權利要求的(de)(de)范圍內做出各種(zhong)變(bian)形或修改，這并(bing)不影響本發(fa)明(ming)(ming)的(de)(de)實質內容。