一種工程菌及其構建方法與在制備藏紅花酸中的應用
【專利摘要】本發明涉及基因工程領域，尤其涉及一種工程菌及其構建方法與在制備藏紅花酸中的應用。本發明提供的工程菌中過表達CrtZ基因和CCD基因。相對于現有技術中的通過組織培養等方法進行藏紅花酸的生物合成具有更為環保、成本低廉的優勢，為藏紅花酸的生產提供了一種可行的方法。且本發明提供的工程菌產藏紅花酸的效率較高，發酵108h，藏紅花酸的濃度可達1.17mg/L。
【專利說明】
一種工程菌及其構建方法與在制備藏紅花酸中的應用
[00011 本申請要求于2016年05月25日提交中國專利局、申請號為201610355116.6、發明 名稱為"一種工程菌及其構建方法與在制備藏紅花酸中的應用"的中國專利申請的優先權， 其全部內容通過引用結合在本申請中。
技術領域
[0002] 本發明涉及基因工程領域，尤其涉及一種工程菌及其構建方法與在制備藏紅花酸 中的應用。
【背景技術】
[0003] 類胡蘿卜素是一類廣泛存在于生物體內具有重要生物活性及生理功能的異戊二烯 類化合物，其特征碳骨架結構經過特定的裂解雙加氧酶的催化可形成脫落酸、芳香類化合 物、維生素 A及脫輔基類胡蘿卜素色素。在高等植物中，這些代謝過程普遍發生在開花期和果 實成熟期。藏紅花粉(Saffron)，主要來自于藏紅花(Crocus sativus L.)的干燥柱頭及梔 子(Gardenia jasminoides)的果實中，其主要有效活性成分藏紅花酸(Crocetin)、藏紅花 素(Crocin)和苦藏紅花素(Picrocrocin)即是玉米黃質經裂解雙加氧酶催化后的裂解產 物。
[0004] 藏紅花酸(Crocetin)，又名藏花酸、西紅花酸或番紅花酸，是具有多不飽和共輒烯 酸結構的類胡蘿卜素物質，是西紅花提取物的有效成分之一，其純品為磚紅色粉末，分子式 為C2QH24〇4,相對分子質量為328.40。藏紅花酸作為天然的活性化合物，藏紅花酸是一個非常 有前景的并且幾乎沒有副作用的有效藥物。在我國的古典醫書中記載，藏紅花可以活血化 瘀、安神解郁、涼血解毒，用于精神憂郁、心悸、閉經、濕毒發斑、產后瘀阻等疾病的治療。自 然界中可以合成天然藏紅花酸的植物極少，目前發現的有藏紅花、梔子及醉魚草屬植物花。 藏紅花酸的主要來源是藏紅花的柱頭，但是藏紅花在自然界中的資源非常有限，而其柱頭 產量更是極低，平均25萬朵藏紅花，耗費40個小時的人工提取才能獲得足夠的柱頭生產lkg 的藏紅花粉（saffron )，含量97 %的藏紅花酸市場售價高達13.6萬元/g，因此藏紅花享有 "植物黃金"的美譽。
[0005]藏紅花酸由于其出色的藥理藥效及獨特的芳香味道越來越被人們所熟知，被廣泛 用于醫藥、化工、食品加工及化妝品行業，但是藏紅花酸的產量極低，導致了供不應求，造成 了市場短缺的現象。目前，藏紅花酸的主要生產方法有天然提取、化學合成以及生物合成。 在自然界中，藏紅花酸的主要來源為藏紅花的柱頭，但是室內栽培的藏紅花在開花期間會 突然發生萎花，繼而腐爛，造成藏紅花的繁殖速度慢，產量極低，同時高昂的分離提純方法 造成天然提取較低的收益率。
[0006]藏紅花酸的化學合成主要通過水解藏紅花酸二甲酯得到，周忠等以2-溴丙酸甲酯 和3,7_二甲基辛三烯二醛等為原料，經三步反應先合成藏紅花酸二甲酯粗品，再經水解、脫 色和重結晶處理，并通過有效的分離純化，得到精制的藏紅花酸。張俊國等以藏紅花酸二甲 酯為反應底物，使用Κ0Η( 50 % )為堿，THF/CH30H(3:2)為溶劑進行水解反應，從而得到藏紅 花酸。但是，化學合成的藏紅花酸由于其較低的品質只能作為顏料而不能用作食品添加劑 或藥物。因此，微生物合成則以低成本、高產量和產品安全性被認為是最有前途的生產方 法。
[0007] 目前，藏紅花酸的生物合成多集中在藏紅花組織培養或懸浮細胞培養，清華大學 郭志剛等通過先在固體培養基中獲得藏紅花的愈傷組織，隨后轉移至液體培養基中生物合 成，采用固液兩步培養的方法促進了藏紅花的生長。Mir等通過調節培養基成分實現藏紅花 的體外繁殖。但是這些手段并不能顯著的提高藏紅花的產量。
[0008] 隨著對藏紅花酸的生物合成途徑及關鍵酶的發現，使得藏紅花酸在工程菌株的異 源表達成為可能，但是關于異源合成藏紅花酸的報道很少。

【發明內容】

[0009] 有鑒于此，本發明要解決的技術問題在于提供一種工程菌及其構建方法與在制備 藏紅花酸中的應用。本發明提供的菌株能夠發酵產生藏紅花酸，產生藏紅花酸的最高濃度 可達 1.17mg/L。
[0010] 本發明提供的工程菌過表達CrtZ基因和(XD基因。
[0011]根據藏紅花酸的生物合成途徑(附圖1)，β_胡蘿卜素在依次經過CrtZ基因、(XD基因 和ALD基因的作用后，生成藏紅花酸。本發明通過過表達CrtZ基因和C⑶基因，從而實現了在 工程菌中高表達藏紅花酸，使以微生物為生物反應器的藏紅花酸制備得以實現。本發明所 述的工程菌選自酵母菌、霉菌或細菌。優選是能夠產生β-胡蘿卜素的酵母菌、霉菌或細菌。其 中，酵母菌優選釀酒酵母、解脂屬酵母或克魯維屬酵母;霉菌優選鏈霉菌;細菌優選大腸桿 菌或枯草芽孢桿菌，
[0012] 本發明中，采用的CrtZ基因來自不同的物種，而CCD基因則皆來自藏紅花，研究表 明，僅有導入CCD2基因的工程菌中大量產生了藏紅花酸。因此，本發明提供的工程菌中，所 述CrtZ基因為Aa crtZ、As crtZ、Eu crtZ、Pa crtZ、Ps crtZ、Ss crtZ、B.SD212 crtZ、 B. DC263crtZ或Hp crtZ;所述CCD基因為CCD2。其中，表達量較高的菌種中，導入的CrtZ基因 為Eu crtZ、Pa crtZ、Ps crtZ、Ss crtZ、B.SD212 crtZ或B.DC263 crtZ。表達量最高的菌種 中，導入的Crt Z基因為Ps crtZ。
[0013] 本發明中，Crt Z基因序列和CCD基因序列皆經密碼子優化并適當規避常用限制性 酶切位點，作為優選，CrtZ基因序列和CCD基因的核苷酸序列為：
[0014] Aa crtZ基因的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示；
[0015] As crtZ基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
[0016] Eu crtZ基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
[0017] Pa crtZ基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；
[0018] Ps crtZ基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；
[0019] Ss crtZ基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；
[0020] B.SD212crtZ基因的核苷酸序列如SEQIDN0:7所示；
[0021] B.DC263crtZ基因的核苷酸序列如SEQIDN0:8所示；
[0022] Hp crtZ基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示；
[0023] CCD2基因的核苷酸序列如SEQ ID N013所示。
[0024]本發明提供的工程菌在制備藏紅花酸中的應用。
[0025]為了方便質粒的構建，在CrtZ基因和CCD基因的5'端添加 SEQ ID N0:14所示的核 苷酸序列;在CrtZ基因和(XD基因的3'端添加 SEQ ID N0:15所示的核苷酸序列。
[0026] 為了能夠獲得更高產量的藏紅花酸，優選采用高產β-胡蘿卜素的菌種，在本發明 中，采用的起始菌株為酵母菌SyBE_Sc0014CY06。酵母菌SyBE_Sc0014CY06能夠高產β-胡蘿卜 素，來自天津大學，其構建方法參照申請號為201510435606.2的專利。
[0027] 本發明構建的產藏紅花的工程菌中，Crt Ζ基因的啟動子為GAL啟動子，終止子為 HIS5t終止子;優選采用GAL1為啟動子。
[0028] 本發明構建的產藏紅花的工程菌中，CCD基因的啟動子為GAL啟動子，終止子為 TEF2t終止子;優選采用GAL10為啟動子。
[0029] 本發明中，CrtZ基因采用整合質粒導入，(XD基因采用著絲粒質粒導入。
[0030] 本發明構建的產藏紅花的工程菌的基因型為：
[0031] SyBE_Sc0014CY06，Aho: :PGALi_Aa CrtZ-THis5t，pRS416-PGALi〇-CCD2;
[0032] SyBE_Sc0014CY06，Aho: :Pgali_As CrtZ-THis5t，pRS416-PGALi〇-CCD2;
[0033] SyBE_Sc0014CY06，Aho: :Pgali_Eu CrtZ-THis5t，pRS416-PGALi〇-CCD2;
[0034] SyBE_Sc0014CY06，Aho: :PGALi_Pa CrtZ-THis5t，pRS416-PGALi〇-CCD2;
[0035] SyBE_Sc0014CY06，Aho: :Pgali_Ps CrtZ-THis5t，pRS416-PGALi〇-CCD2;
[0036] SyBE_Sc0014CY06，Aho: :Pgali_Ss CrtZ-THis5t，pRS416-PGALi〇-CCD2;
[0037] SyBE_Sc0014CY06，Aho: :Pgali_B.SD212 CrtZ-THis5t，pRS416-PGALi〇-CCD2;
[0038] SyBE_Sc0014CY06，Aho: :Pgali_B.DC263 CrtZ-THis5t，pRS416-PGALi〇-CCD2;
[0039] S，SyBE_Sc0014CY06，Aho::PGALi-HpCrtZ-THis5t，pRS416-PGALi〇-CCD2〇
[0040] 其中，產藏紅花量較高的工程菌的基因型為：
[0041] SyBE_Sc0014CY06，Aho: :Pgali_Eu CrtZ-THis5t，pRS416-PGALi〇-CCD2;
[0042] SyBE_Sc0014CY06，Aho: :PGALi_Pa CrtZ-THis5t，pRS416-PGALi〇-CCD2;
[0043] SyBE_Sc0014CY06，Aho: :Pgali_Ps CrtZ-THis5t，pRS416-PGALi〇-CCD2;
[0044] SyBE_Sc0014CY06，Aho: :Pgali_Ss CrtZ-THis5t，pRS416-PGALi〇-CCD2;
[0045] SyBE_Sc0014CY06，Aho: : Pgali-B · SD212CrtZ-THis5t，pRS416-Pgaliq-CCD2 ;
[0046] SyBE_Sc0014CY06，Aho: : Pgali-B ·DC263CrtZ-THis5t，pRS416-Pgaliq-CCD2 ;
[0047] 其中，產藏紅花量最高的工程菌的基因型為：SyBE_Sc0014CY06，Λho ::PGALl-Ps CrtZ-THIS5t，pRS416-PGAL10-CCD2;
[0048] 本發明提供的工程菌中，通過ho左、右同源序列與酵母基因組上ho位點發生重組 而將CrtZ基因整合到基因組上，(XD基因則以著絲粒質粒的形式穩定存在于釀酒酵母細胞 中，
[0049] 本發明的工程菌相對于現有技術中的通過組織培養等方法進行藏紅花酸的生物 合成具有更為環保、成本低廉的優勢，為藏紅花酸的生產提供了一種可行的方法。且本發明 提供的工程菌產藏紅花酸的效率較高，發酵96h，藏紅花酸的濃度可達1.17mg/L。
[0050] 本發明對CrtZ基因和CCD基因進行了密碼子優化并適當規避常用限制性酶切位 點，故而，本發明還提供了一種CrtZ基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1~9中任一項所示。 以及，本發明還提供了一種C⑶基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0:13所示。
[0051 ]作為優選，本發明提供的Crtz基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3~8任一項所示。 [0052]優選的，本發明提供的CrtZ基因的核苷酸序列如SEQ ID N0:5所示。
[0053]為了構建本發明提供的產藏紅花酸的工程菌，本發明還提供了一種整合質粒，包 括順序連接的:ho左同源臂、GAL啟動子、His5t終止子、DRURADR和ho右同源臂。
[0054]作為優選，其骨架為pJETl.2質粒。
[0055]本發明提供的整合質粒的構建過程及質粒圖譜如圖2。
[0056]其中，ho左同源臂的與GAL啟動子之間的酶切位點為Xba I;
[0057] GAL啟動子與His5t終止子之間的酶切位點為BsmBI ;BsmB頂每切位點的個數為2 個；
[0058] His5t終止子與DRURADR之間的酶切位點為Sma I。
[0059] 在順序連接的ho左同源臂、GAL啟動子、His5t終止子、DRURADR和ho右同源臂兩端， 分別連接酶切位點Pme I。
[0060] 本發明中，ho左右同源臂序列來自酵母基因組，所述酵母為SyBE_Sc0014CY06;其 中，ho左同源臂的核苷酸序列如SEQ ID N0 16;ho右同源臂的核苷酸序列如SEQ ID N0:17 所示。
[0061 ] DRURADR序列來自質粒LDL06(來自天津大學），其核苷酸序列如SEQ ID N018所示。
[0062]本發明整合質粒采用的GAL啟動子為GAL1啟動子，該序列來自酵母基因組;所述酵 母為SyBE_Sc0014CY06其核苷酸序列如SEQ ID N019所示。
[0063] His5t終止子的序列來自酵母基因組;所述酵母為SyBE_Sc0014CY06;其核苷酸序 列如SEQ ID N0:20所示。
[0064]本發明提供的整合質粒的構建方法包括：
[0065] 步驟：1:將ho左同源臂、DRURADR、ho右同源通過0E-PCR的方法順次拼接，得到兩端 包含Pme I酶切位點、且在ho左同源臂與DRURADR、ho右同源臂之間包含Xba I和Sma I酶切位點 的片段；
[0066] 步驟 2:平末端載體 pJETl .2 連接得到 pJETl .2-ho leftarm-DRURADR-ho rightarm；
[0067] 步驟3:將GAL1啟動子、HIS5t終止子通過0E-PCR方法拼接起來，得到兩端包含Xbal 和Smal酶切位點，且在GAL1啟動子和HIS5t終止子之間包含兩個BsmBI酶切位點的片段 PGALl-THIS5t;
[0068] 步驟4:將片段？641^1-1'!1155七通過乂匕31和51^頂每切位點與口貝1'1.2-11〇16代3?-DRURADR-ho rightarm進行連接，得到整合質粒。
[0069] 本發明提供的整合質粒在構建產藏紅花工程菌中的應用。
[0070] 本發明提供的整合質粒為CrtZ基因的表達提供了合適的啟動子和終止子，其中的 ho左右同源臂能夠使CrtZ基因順利整合入起始菌株的整合位點，DRURADR標簽能夠用于轉 化子的篩選，從而保證了工程菌構建工作的順利進行。
[0071] 本發明還提供了一種含有CrtZ基因的整合質粒，其在本發明提供的整合質粒中插 入CrtZ基因，CrtZ基因的插入位點為BsmBI。其構建方法和質粒圖譜如圖3所示。具體的，本 發明提供的含有CrtZ基因整合質粒，以pJETl. 2質粒為骨架，包括順序鏈接的ho左同源臂、 GAL啟動子、CrtZ基因、His5t終止子、DRURADR和ho右同源臂。
[0072] 本發明對CrtZ基因的獲取方式不做限定，在CrtZ基因的5'端添加 SEQIDN0:14所 示的核苷酸序列；3'端添加 SEQ ID NO: 15所示的核苷酸序列。
[0073]本發明提供的用于構建產藏紅花酸的整合質粒中Crtz基因的插入位點為BsmBI酶 切位點。
[0074] 本發明提供的含有CrtZ基因的整合質粒在構建產藏紅花工程菌中的應用。
[0075] 本發明還提供了一種含有CCD基因的著絲粒質粒，其構建方法和質粒圖譜如圖4所 示。該著絲粒質粒以PRS416質粒為骨架，包括順序連接的His5t終止子、GAL啟動子、(XD基 因、TEF2t終止子。
[0076] 作為優選，其中(XD基因為(XD2基因。
[0077] His5t終止子、GAL啟動子、TEF2t終止子的序列來自酵母菌SyBE_Sc0014CY06;皆通 過PCR擴增獲得。
[0078] 其中，擴增His5t終止子的引物對的核苷酸序列如SEQ ID N0:21~22所示；
[0079]擴增GAL啟動子的引物對的核苷酸序列如SEQ ID N0:23~24所示;擴增獲得的為 GAL10啟動子；
[0080] 擴增TEF2t終止子的引物對的核苷酸序列如SEQ ID N0:25~26所示。
[0081 ]本發明提供的含有CCD基因的整合質粒在構建產藏紅花工程菌中的應用。
[0082] 本發明提供的著絲粒質粒的構建方法包括：
[0083] 步驟l:以釀酒酵母SyBE_Sc0014CY06的基因組DNA為模板，分別以SEQIDN0 :21~ 22所示引物對、SEQ ID N0: 23~24所示引物對、SEQ ID N0: 25~26所示引物對擴增得到 HIS5t終止子、GAL10啟動子、TEF2t終止子；
[0084] 步驟2:制備C⑶基因片段后，將HIS5t終止子、GAL10啟動子、C⑶基因片段、TEF2t終 止子通過0E-PCR拼接得到兩端包含Not頂每切位點的片段THIS5t-PGALl-CCD-TTEF2t;
[0085] 步驟3:將片段THis5t-PGALi-CCD-TTEF2t與PRS416質粒通過Notl酶切位點進行連接，得 到本發明提供的著絲粒質粒。
[0086]本發明對CCD基因片段的制備方法不做限定，在(XD基因的5'端添加 SEQ ID N0:14 所示的核苷酸序列；3'端添加 SEQ ID NO: 15所示的核苷酸序列。
[0087]本發明還提供了產藏紅花酸工程菌的構建方法，該方法將CrtZ基因和CCD基因轉 化入起始菌。
[0088] 本發明中，起始菌為酵母菌，優選的酵母菌為SyBE_Sc0014CY06。
[0089] 作為優選，轉化所述CrtZ基因采用的整合質粒以pJETl .2質粒為骨架，包括順序鏈 接的ho左同源臂、GAL啟動子、CrtZ基因、His5t終止子、DRURADR和ho右同源臂；
[0090] 轉化所述CCD基因采用的著絲粒質粒以PRS416質粒為骨架，包括順序連接的His5t 終止子、GAL啟動子、CCD基因、TEF2t終止子。
[0091 ] 本發明構建產藏紅花酸工程菌采用的CrtZ基因為Aa crtZ、As crtZ、Eu crtZ、Pa crtZ、Ps crtZ、Ss crtZ、B.SD212 crtZ、B.DC263 crtZ或Hp crtZ;所述CCD基因為CsCCD2。
[0092] 轉化方法采用醋酸鋰法。先轉化含CrtZ基因的整合質粒再轉化含CCD基因的著絲 粒質粒。
[0093] 轉化含CrtZ基因的整合質粒后采用缺陷型培養基和抗性培養基對轉化子進行篩 選，再以PCR進行驗證。
[0094]缺陷型培養基中包括:合成酵母氮源YNB 6.7g/L，葡萄糖20g/L，缺色氨酸、亮氨 酸、組氨酸和尿嘧啶的混合氨基酸粉末2g/L，質量分數為2 %的瓊脂粉。
[0095]抗性培養基中包括5-氟乳清酸。
[0096]轉化含CCD基因的著絲粒質粒后采用缺陷型培養基對轉化子進行篩選，再以PCR進 行驗證。
[0097]缺陷型培養基中包括:合成酵母氮源YNB 6.7g/L，葡萄糖20g/L，缺色氨酸、亮氨 酸、組氨酸和尿嘧啶的混合氨基酸粉末2g/L，質量分數為2 %的瓊脂粉。
[0098] 以本發明提供的含CrtZ基因的整合質粒和含CCD基因的著絲粒質粒，能夠將CrtZ 基因和CCD基因順利轉化入SyBE_Sc0014CY06酵母菌，獲得的工程菌能夠產生產藏紅花酸， 最高產量可達1.17mg/L。
[0099] 本發明提供的產藏紅花酸的工程菌的保存采用Yro培養基。
[0100] 本發明提供的藏紅花酸的制備方法為發酵本發明提供的產藏紅花酸的工程菌。
[0101] 作為優選，發酵的溫度為20 °C~25 °C。
[0102] 優選的，發酵溫度為20°C。
[0103] 作為優選，發酵采用的培養基為含有d-半乳糖的Yro培養基。
[0104] 優選的，發酵培養基中包括:40g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨、10g/L酵母浸粉，10g/L D-半乳糖。
[0105] 作為優選，發酵在震蕩條件下進行，轉速為250rpm。
[0106] 作為優選，發酵的起始菌體濃度為0D6Q() = 0.1。
[0107] 作為優選，發酵的時間為96h~108h。
[0108] 優選的，發酵的時間為108h。
[0109] 發酵培養基中D-半乳糖為誘導劑，負責開啟GAL 1和GAL 10啟動子的轉錄。初始培養 基中因有葡萄糖存在，GAL啟動子的轉錄受到葡萄糖抑制；隨著發酵的進行，葡萄糖迅速被 消耗，直至葡萄糖抑制效應解除，D-半乳糖開啟GAL啟動子的轉錄，從而逐漸積累藏紅花酸。
[0110] 本發明提供的藏紅花酸的制備方法在發酵后，還包括提取的步驟。
[0111] 所述提取的方法為:收集發酵后的菌體，用3N HC1重懸，反復凍融破碎的細胞后， 12000rpm、4°C離心4min，取沉淀經水洗2次后加入丙酮，并渦旋5min;離心收集丙酮相，揮去 丙酮制得藏紅花酸，
[0112] 本發明提供了一種工程菌及其構建方法與在生產藏紅花酸中的應用，本發明提供 的工程菌中過表達CrtZ基因和CCD基因。相對于現有技術中的通過組織培養等方法進行藏 紅花酸的生物合成具有更為環保、成本低廉的優勢，為藏紅花酸的生產提供了一種可行的 方法。且本發明提供的工程菌產藏紅花酸的效率較高，發酵96h，藏紅花酸的濃度可達 1 · 17mg/L〇
【附圖說明】
[0113] 圖1示利用重組釀酒酵母合成藏紅花酸的路徑圖；
[0114] 圖2示整合質粒構建過程圖；
[0115] 圖3示CrtZ基因表達盒構建過程圖；
[0116] 圖4示C⑶基因表達盒構建過程圖；
[0117] 圖5示重組菌株SyBE_Sc0014C001-SyBE_Sc0014C036的藏紅花酸搖瓶產量比較圖；
[0118] 圖6示不同發酵溫度的搖瓶產量比較圖；
[0119] 圖7示優化發酵條件后菌株SyBE_Sc0123C0017的藏紅花酸產量。
【具體實施方式】
[0120] 本發明提供了一種工程菌及其構建方法與在生產藏紅花酸中的應用，本領域技術 人員可以借鑒本文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改 動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發明。本發明的方法及應 用已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本
【發明內容】
、精神和范圍內 對本文的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本發明技術。
[0121] 本發明中，CrtZ基因為β-胡蘿卜素羥化酶基因，CrtZ以β胡蘿卜素為底物，將其轉化 為玉米黃質。本發明采用的CrtZ基因來源及序列如表1:
[0122] 表l:CrtZ基因來源及序列
[0124] (XD基因為玉米黃質裂解酶基因，(XD以玉米黃質為底物將其轉化成為crocetin dialdehyde(藏紅花醛）；本發明采用的(XD基因來源及序列如表2:
[0125] 表2: C⑶基因來源及序列
[0127] 根據現有技術，CCD2、ZCD和ZCD1均被報道過具備在C7,8(7'，8'）裂解玉米黃質的 功能，(XD3則是通過NCBI同源序列比對發現的一種來源于藏紅花的與(XD2有97 %同源性的 序列，
[0128] 本發明中，英文縮寫表示的含義如下：
[0129] CCD 玉米黃質裂解酶
[0130] ZCD 玉米黃質裂解酶
[0131] CrtZ β_胡蘿卜素羥化酶基因
[0132] DRURADR 營養標簽
[0133] ho leftarm ho左臂，也標記為L_arm
[0134] ho rightarm Ho右臂，也標記為R_arm
[0135] Pgali GAL 1 啟動子
[0136] Trasst His5t 終止子
[0137] Pgalio GAL10 啟動子
[0138] TxEF2t TEF2t 終止子
[0139] Aho:: ho被敲除后，被：：后面的序列取代
[0140] Glucose 葡萄糖
[0141] Acetyl-CoA 乙酰輔酶 A
[0142] HMG-CoA 3_羥基_3甲基戊二酰輔酶
[0143] mevalonate 甲輕戊酸
[0144] GGPP 香葉基焦磷酸
[0145] β-carotene 胡蘿卜素
[0146] zeaxanthin 玉米黃質
[0147] Crocetin dialdehyde 藏紅花酸
[0148] crocetin 藏紅花酸
[0149] ALD基因 醛脫氫酶基因
[0150] Ampr 氨芐霉素抗性標記
[0151] 0E-PCR 重疊延伸 PCR
[0152] T41igase T4 連接酶
[0153] Digested 酶切
[0154] 本發明提供的釀酒酵母工程菌株及其構建方法、應用中所用質粒等生物材料均可 由市場購得，引物序列均可由生物公司合成。
[0155] 下面結合實施例，進一步闡述本發明：
[0156] 實施例1
[0157] 本發明的生產藏紅花酸的重組釀酒酵母菌株的構建方法如下：
[0158] 高產β-胡蘿卜素釀酒酵母SyBE_Sc0014CY06,由元英進課題組提供，其構建方法為 參照申請號為201510435606.2的專利。
[0159] 1、外源功能基因元件的獲得
[0160] 根據表1和表2。上述基因均為經過釀酒酵母密碼子優化并適當規避常用限制性酶 切位點后，在基因兩端額外添加5'端gcggccgcggtctcca(SEQ ID N0 14);3' taaaggagaccgcggccgc(SEQ ID NO 15);本發明所使用的CCD和CrtZ基因片段皆通過人工合 成得到，具體為由金斯瑞公司制備質粒，使用過程中CrtZ通過Bsal酶切，CCD則使用相應引 物(表3所示)經PCR獲得。
[0161] 2、含有CrtZ基因的整合質粒的構建
[0162] 整合質粒的構建:將GAL1啟動子、HIS5t終止子通過0E-PCR方法拼接起來，得到兩 端包含Xbal和Smal酶切位點，且在GAL1啟動子和HIS5t終止子之間包含兩個BsmBI酶切位點 的片段PGAu-THIS5t;同時，構建含DRURADR營養標簽的ho左、右同源臂的ho整合質粒，PCR擴增 ho左同源臂、DRURADR、ho右同源臂，并通過0E-PCR的方法順次拼接，得到兩端包含Pme I酶切 位點、且在ho左同源臂與DRURADR、ho右同源臂之間包含XbaI和SmaI酶切位點的片段，然后 與平末端載體pJETl · 2連接得到ho整合質粒pJETl · 2_ho leftarm-DRURADR-ho rightarm。 之后將片段PGALl-THIS5t通過Xbal和Sma頂每切位點進行連接，得到整合質粒pJET1.2-ho 1 eftarm-PGALi-THis5t-DRURADR-ho rightarm。
[0163] 然后將9種不同來源的人工合成的crtz與整合質粒pJET1.2-h〇-PCAL1-THIS5t-DRURADR通過BsmB頂每切位點進行連接，得到9種整合質粒，統計為？貝1'1.2-11〇16代 &?!-PGALi-CrtZ-THis5f DRURADR-ho rightarm。
[0164] 3、含有C⑶基因的著絲粒質粒的構建
[0165] 以釀酒酵母SyBE_Sc0014CY06的基因組為模板擴增得到HIS5t終止子、GAL10啟動 子、TEF2t終止子，以由公司合成的基因質粒為模板，分別擴增出CCD2、CCD3、ZCD、ZCD1片段 (擴增引物對序列如表3所示）。將HIS5t終止子、GAL10啟動子、(XD基因、TEF2t終止子通過 0E-PCR方法拼接起來，得到兩端包含Notl酶切位點的片段T HIS5t-PGAL1Q-CCD-TTEF2t。之后將片 段T HIS5t-PGAL1-CCD-TTEF2t與pRS416通過Not頂每切位點進行連接，得到基因表達盒pRS416- THIS5t-PGALl〇-CCD_TTEF2t 〇
[0166] 上述構建的模塊一整合質粒和模塊二基因表達盒質粒分別轉化入大腸桿菌感受 態DH5a中，菌落PCR篩選，提質粒進行單、雙酶切驗證以及測序驗證，以確保目的片段連接正 確且堿基序列未發生突變。
[0167] 構建整合質粒和著絲粒質粒過程中采用的引物如表3:
[0168] 表3:構建質粒過程中采用的引物

[0170] 4、模塊化整合構建生產玉米黃質的重組釀酒酵母菌株
[0171] 首先，將9種含有CrtZ基因的整合質粒用Pmd酶切位點切割，獲得9種整合質粒的 片段ho leftarm-PGALi-crtz-THis5t_DRURADR-ho rightarm，然后采用醋酸鋰法將9種片段單 獨轉化如高產β-胡蘿卜素酵母菌株SyBE_Sc0014CY06,通過ho左、右同源序列與酵母基因組 上ho位點發生重組而整合到基因組上。轉化后采用SD-TRP-LEU-HIS-URA固體板(合成酵母 氮源YNB 6.7g/L，葡萄糖20g/L，缺色氨酸、亮氨酸、組氨酸和尿嘧啶的混合氨基酸粉末2g/ L，2%的瓊脂粉)進行篩選，得到的轉化子進行劃線分純培養后提取酵母基因組進行PCR驗 證(序列如SEQ ID N0:47~48)，用YPD液體培養基對驗證正確的重組菌株進行過夜培養后 取少許菌液涂布5-氟乳清酸(5-F0A)固體板，挑取單菌落分純培養后提取基因組進行PCR驗 證篩選通過DR序列間自發重組而刪除URA基因的正確菌株，將該正確菌株命名為Syffi_ Sc0123Cz01、SyBE_Sc0123Cz02、SyBE_Sc0123Cz03、SyBE_Sc0123Cz04、SyBE_Sc0123Cz05、 SyBE_ScO 123Cz06、SyBE_ScO 123Cz07、SyBE_ScO 123Cz08 和 SyBE_ScO 123Cz09。其中，
[0172] SyBE_Sc0123Cz01:SyBE_Sc0014CY06，Aho: :PGALi_Aa CrtZ-THis5t、
[0173] SyBE_Sc0123Cz02:SyBE_Sc0014CY06，Aho: :Pgali_As CrtZ-THis5t、
[0174] SyBE_Sc0123Cz03:SyBE_Sc0014CY06，Aho: :Pgali_Eu CrtZ-THis5t、
[0175] SyBE_Sc0123Cz04:SyBE_Sc0014CY06，Aho: :PGALi_Pa CrtZ-THis5t、
[0176] SyBE_Sc0123Cz05:SyBE_Sc0014CY06，Aho: :Pgali_Ps CrtZ-THis5t、
[0177] SyBE_Sc0123Cz06:SyBE_Sc0014CY06，Aho: :Pgali_Ss CrtZ-THis5t、
[0178] SyBE_Sc0123Cz07:SyBE_Sc0014CY06，Aho: :PGALi-B.SD212CrtZ-THis5t、
[0179] SyBE_Sc0123Cz08: SyBE_Sc0014CY06，Aho: :Pgali-B·DC263CrtZ-THis5t、
[0180] SyBE_Sc0123Cz09:SyBE_Sc0014CY06，Aho: :Pgali_Hp CrtZ-THis5t〇
[0181 ] 5、模塊化整合構建生產玉米黃質的重組釀酒酵母菌株
[0182]采用醋酸鋰法將4種含有CCD基因的著絲粒質粒分別單獨轉化yBE_Sc0123Cz01、 SyBE_Sc0123Cz02、SyBE_Sc0123Cz03、SyBE_Sc0123Cz04、SyBE_Sc0123Cz05、SyBE_ Sc0123Cz06、SyBE_Sc0123Cz07、SyBE_Sc0123Cz08 和 SyBE_Sc0123Cz09,使基因 CCD 以著絲粒 質粒的形式穩定存在于釀酒酵母細胞中，轉化后采用SD-TRP-LEU-HIS-URA固體板(合成酵 母氮源YNB 6.7g/L，葡萄糖20g/L，缺色氨酸、亮氨酸、組氨酸和尿嘧啶的混合氨基酸粉末 2g/L，2%的瓊脂粉)進行篩選，得到的轉化子進行劃線分純培養后提取酵母質粒進行PCR驗 證，將共計36種組合的正確菌株命名為：

[0219] 本發明制得的36株菌株敲除了SyBE_Sc0014CY06的基因組中的ho基因，并在其基 因組中添加了 GAL1啟動子、CrtZ基因和His5終止子;另外包括含有(XD基因的著絲粒質粒。
[0220] 實施例2
[0221] 比較實施例1制備的36種基因組合設計菌株的藏紅花酸的搖瓶產量
[0222] 試驗材料：菌株 SyBE_Sc0123C001、SyBE_Sc0123C002、SyBE_Sc0123C003、SyBE_ Sc0123C004、SyBE_Sc0123C005、SyBE_Sc0123C006、SyBE_Sc0123C007、SyBE_Sc0123C008、 SyBE_Sc0123C009、SyBE_Sc0123C010、SyBE_Sc0123C011、SyBE_Sc0123C012、SyBE_ Sc0123C013、SyBE_Sc0123C014、SyBE_Sc0123C015、SyBE_Sc0123C016、SyBE_Sc0123C017、 SyBE_Sc0123C018、SyBE_Sc0123C019、SyBE_Sc0123C020、SyBE_Sc0123C021、SyBE_ Sc0123C022、SyBE_Sc0123C023、SyBE_Sc0123C024、SyBE_Sc0123C025、SyBE_Sc0123C026、 SyBE_Sc0123C027、SyBE_Sc0123C028、SyBE_Sc0123C029、SyBE_Sc0123C030、SyBE_ Sc0123C031、SyBE_Sc0123C032、SyBE_Sc0123C033、SyBE_Sc0123C034、SyBE_Sc0123C035和 SyBE_Sc0123C036
[0223] 試驗方法：
[0224] 種子培養基:40g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨、lOg/L酵母浸粉；
[0225] 發酵培養基:40g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨、10g/L酵母浸粉，10g/L D-半乳糖。
[0226] 將實施例1制備的菌株接種于5mL種子培養基中，在30°C、250rpm培養14-16h，以初 始菌體濃度0D600 = 0.1分別接種于50mL發酵培養基中，于25°C、250rpm條件下培養，監測發 酵96h時藏紅花酸產量。
[0227] 藏紅花酸定量方法:每個發酵瓶均取等量的發酵液，4000g離心2min收集菌體，并 水洗兩次后用以產物提取，具體方法為：用3N HC1重懸細胞，置于沸水浴中煮沸2min，然后 立即冰浴3min;將破碎的細胞12000rpm、4°C離心4min棄上清，水洗2次后加入丙酮，并渦旋 5min;最后離心收集丙酮相，并用氮吹儀將丙酮揮發干凈，加入200yL的DMF:甲醇=1:7，并 用2μπι濾膜過濾后上紫外液相檢測，藏紅花酸檢測波長為430nm。
[0228] 試驗結果：發酵培養基中D-半乳糖為誘導劑，負責開啟GAL1和GAL10啟動子的轉 錄。初始培養基中因有葡萄糖存在，GAL啟動子的轉錄受到葡萄糖抑制;隨著發酵的進行，葡 萄糖迅速被消耗，直至葡萄糖抑制效應解除，D-半乳糖開啟GAL啟動子的轉錄，從而逐漸積 累藏紅花酸。由圖5所示的藏紅花酸產量來看，發酵96h，由基因 CCD3、Z⑶、Z⑶1所形成的組 合均沒有檢測到藏紅花酸，只有基因 CCD2所形成的組合檢測到了藏紅花酸，其中Ps crtZ和 CCD2的組合藏紅花酸產量最高。檢測數據如表4:
[0229] 表4藏紅花酸濃度
[0231] 實施例3
[0232] 1、比較實施例1菌株SyBE_ScO 123C009和SyBE_ScO 123C013的藏紅花酸在不同發酵 溫度時搖瓶產量
[0233] 試驗材料：菌株 SyBE_Sc0123C009 和 SyBE_Sc0123C013
[0234] 試驗方法：
[0235] 種子培養基:40g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨、10g/L酵母浸粉；
[0236] 發酵培養基:40g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨、10g/L酵母浸粉，10g/L D-半乳糖。
[0237] 將上述菌株接種于5mL種子培養基中，在30°C、250rpm培養14-16h，以初始菌體濃 度0D600 = 0.1分別接種于50mL發酵培養基中，分別于于30°C、250rpm;25°C、250rpm;20°C、 250rpm條件下培養，監測發酵96h時藏紅花酸產量。
[0238] 藏紅花酸定量方法:每個發酵瓶均取等量的發酵液，4000g離心2min收集菌體，并 水洗兩次后用以產物提取，具體方法為：用3N HC1重懸細胞，置于沸水浴中煮沸2min，然后 立即冰浴3min;將破碎的細胞12000rpm、4°C離心4min棄上清，水洗2次后加入丙酮，并渦旋 5min;最后離心收集丙酮相，并用氮吹儀將丙酮揮發干凈，加入200yL的DMF:甲醇=1:7，并 用2μπι濾膜過濾后上紫外液相檢測，藏紅花酸檢測波長為430nm。
[0239] 試驗結果：發酵培養基中D-半乳糖為誘導劑，負責開啟GAL1和GAL10啟動子的轉 錄。初始培養基中因有葡萄糖存在，GAL啟動子的轉錄受到葡萄糖抑制;隨著發酵的進行，葡 萄糖迅速被消耗，直至葡萄糖抑制效應解除，D-半乳糖開啟GAL啟動子的轉錄，從而逐漸積 累藏紅花酸。由圖6所示的藏紅花酸產量來看，發酵96h，低溫(20 °C和25 °C)發酵時可以檢測 到藏紅花酸，隨著溫度的升高，藏紅花酸的產量顯著下降，25°C發酵檢測到的藏紅花含量顯 著低于20°C (p〈0.05);30°C發酵時檢測不到藏紅花酸的積累。由此可知，溫度是影響裂解酶 表達或催化的關鍵因素。
[0240] 實施例4
[0241] 根據實施例3的結論，對菌株SyBE_Sc0123C0017的發酵條件進行優化，優化后的發 酵方法為：
[0242]種子培養基:40g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨、10g/L酵母浸粉；
[0243] 發酵培養基:40g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨、10g/L酵母浸粉，10g/L D-半乳糖。
[0244] 將實施例1制備的菌株接種于5mL種子培養基中，在30°C、250rpm培養14-16h，以初 始菌體濃度0D600 = 0.1分別接種于50mL發酵培養基中，于20°C、250rpm條件下培養，監測發 酵108h時藏紅花酸產量。
[0245] 藏紅花酸定量方法:每個發酵瓶均取等量的發酵液，4000g離心2min收集菌體，并 水洗兩次后用以產物提取，具體方法為：用3N HC1重懸細胞，置于沸水浴中煮沸2min，然后 立即冰浴3min;將破碎的細胞12000rpm、4°C離心4min棄上清，水洗2次后加入丙酮，并渦旋 5min;最后離心收集丙酮相，并用氮吹儀將丙酮揮發干凈，加入200yL的DMF:甲醇=1:7，并 用2μπι濾膜過濾后上紫外液相檢測，藏紅花酸檢測波長為430nm。
[0246] 結果顯示，在適宜條件下，SyBE_Sc0123C0017菌株藏紅花酸的產量可達1.17mg/L。 是條件未優化前的5倍。（圖7)
[0247] 以上僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來 說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為 本發明的保護范圍。
【主權項】
1. 一種工程菌，其特征在于，其表達CrtZ基因和CXD基因。2. 根據權利要求1所述的工程菌，其特征在于，所述CrtZ基因為Aa crtZ、As crtZ、Eu CCD2〇3. 根據權利要求1所述的工程菌，其特征在于， Aa crtZ基因的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示； As crtZ基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示； Eu crtZ基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示； Pa crtZ基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示； Ps crtZ基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示； Ss crtZ基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示； B.SD212crtZ基因的核苷酸序列如SEQIDN0:7所示； B.DC263crtZ基因的核苷酸序列如SEQ ID N0:8所示； Hp crtZ基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示； (XD2基因的核苷酸序列如SEQ ID N013所示。4. 根據權利要求1所述的工程菌，其特征在于，其起始菌株為酵母菌SyBE_Sc0014CY06。5. 根據權利要求1~4任一項所述的工程菌，其特征在于，其基因型為： SyBE_Sc0014CY06, Aho: :PGALi-Aa CrtZ-THis5t，pRS416-PGALi〇-CCD2; SyBE_Sc0014CY06，Aho: :Pgali_As CrtZ-THis5t，pRS416-PGALi〇-CCD2; SyBE_Sc0014CY06，Aho: :Pgali_Eu CrtZ-THis5t，pRS416-PGALi〇-CCD2; SyBE_Sc0014CY06，Aho: :PGALi_Pa CrtZ-THis5t，pRS416-PGALi〇-CCD2; SyBE_Sc0014CY06，Aho: :Pgali_Ps CrtZ-THis5t，pRS416-PGALi〇-CCD2; SyBE_Sc0014CY06，Aho: :Pgali_Ss CrtZ-THis5t，pRS416-PGALi〇-CCD2; SyBE_ScOO 14CY06，Aho: : Pgali-B · SD212CrtZ-THis5t，pRS416-Pgaliq-CCD2 ; SyBE_ScOO 14CY06，Aho: : Pgali-B · DC263CrtZ-THis5t，pRS416-Pgaliq-CCD2 ; 或，SyBE_ScOO 14CY06，Aho: : Pgali-Hp CrtZ-THis5t，pRS416-Pgaliq-CCD2 〇6. 權利要求1~5任一項所述的工程菌在制備藏紅花酸中的應用。7. -種CrtZ基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1~9中任一項所示。8. -種C⑶基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 13所示。9. 權利要求1~5任一項所述工程菌的構建方法，其特征在于，將CrtZ基因和CCD基因轉 化入起始菌。10. 根據權利要求9所述的構建方法，其特征在于，轉化所述CrtZ基因采用的整合質粒 以pJETl. 2質粒為骨架，包括順序鏈接的ho左同源臂、GAL啟動子、CrtZ基因、His5t終止子、 DRURADR和ho右同源臂； 轉化所述CCD基因采用的著絲粒質粒以pRS416質粒為骨架，包括順序連接的His5t終止 子、GAL啟動子、CCD基因、TEF2t終止子。11. 一種藏紅花酸的制備方法，其特征在于，發酵權利要求1~5任一項所述的工程菌。12. 根據權利要求11所述的制備方法，其特征在于，所述發酵的溫度為20°C~25°C。
【文檔編號】C12N1/19GK105950493SQ201610382407
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年6月1日
【發明人】肖文海, 梅雪昂, 陳艷, 王穎, 元英進
【申請人】天津大學