專利名稱：一種重組人血白蛋白及其融合蛋白的分離純化工藝的制作方法
技術領域：
本發明屬于蛋白質分離純化技術領域，特別是對重組的人血白蛋白的純化。
背景技術：
人血白蛋白(HSA)，是血漿中含量最多的蛋白質，占血漿總蛋白的40% -60%，它是血漿中很重要的載體，在體液PH7. 4的環境中，白蛋白為負離子，每分子可以帶有200個以上負電荷。許多水溶性差的物質可以通過與白蛋白的結合而被運輸。這些物質包括膽紅素、長鏈脂肪酸(每分子可以結合4-6個分子)、膽汁酸鹽、前列腺素、類固醇激素、金屬離子 (如Cu2+、Ni2+、Ca2+)藥物(如阿司匹林、青霉素等)。另一個作用為維持滲透壓。白蛋白的分子結構已于1975年闡明，為含585個氨基酸殘基的球狀蛋白質，分子量為66458Da，分子中含17個二硫鍵，不含有糖的組分。人血白蛋白基因位于4號染色體上有16961對堿基對，分為15個間隔區。經過RNA加工拼接后表達的m RNA可以編碼一個具有585個氨基酸的蛋白質。人血白蛋白有很大的應用及臨床應用價值。例如作為藥物可用于治療因血清白蛋白合成障礙和創傷失血造成的白蛋白含量下降引起的低蛋白血癥；可以作為細胞培養基的添加成份，可以作為藥物的輔劑，賦型劑；具有活性的激素或藥物當與白蛋白結合時，可以不表現其活性，而視為其儲存形式，由于這種結合的可逆性和處于動態平衡，因此在調節這些激素和藥物的代謝上，具有重要意義。現在人類是從人血液中分離純化人血白蛋白的。然而這一方法存在巨大的問題， 例如血源的短缺、受到乙肝病毒、AIDS病毒等病原微生物的污染，因此基于重組DNA的技術方法生產重組人血白蛋白(rHA)的多種方法獲得研發。利用微生物體重組表達人血白蛋白的大規模生產和純化方法可行。這種方法最近已經得到了開發。為數不少的重組方法可以使用，但從發酵液中提純rHA仍是至關緊要的且隨時有待提高的步驟。從人血液中分離純化人血白蛋白，抗原性物質少，對提純的技術要求相對較低。 與之相比，利用基因工程重組技術表達的白蛋白，外源性物質較多，而且由于人血白蛋白注射劑量較大，微量的抗原性物質都可能引起過敏反應，甚至危害患者的生命安全，因此對基因工程重組人血白蛋白的純度要求更高，純化技術難度更大。EP0612761公開了一種生產高純度重組人血白蛋白的方法，其產品中不含自由的非抗原性雜質。這一方法在特定環境下運用了疏水層析色譜(HIC)，還有其它步驟如離子交換色譜，硼酸或硼酸鹽處理，超濾及加熱處理。然而，這一方法因步驟多而太復雜，從而難于滿足大規模工業生產的要求。EP0570916公開了用基因操作技術生產rHA的方法，該方法包括超濾發酵上清液、加熱處理、酸處理和再次超濾，隨后使用陽離子交換、疏水層析和陰離子交換以及鹽析等一系列純化步驟。然而，因與EP0612761存在相似的問題，純化過程太復雜、周期長、成本高而不能成為大規模生產的有效方法。EP0699687公開的rHA純化方法為加熱細胞培養液以滅活蛋白酶，再經陽離子交換微粒的流化床處理，洗脫液再經超濾、HIC和陰離子交換層析而得到純rHA。然而，流化床對設備的要求與常規裝填的層析設備不同，因而，仍需更經濟有效的方法從發酵液中純化 rHA。所以，開發一種穩定的、高效的、用于重組人血白蛋白及其融合蛋白的分離純化方
法非常重要。

發明內容
本發明的目的之一是提供一種區別于目前常用的從人血漿中提純人血白蛋白的方法，本發明是一種適合大規模操作的從發酵液或哺乳動物培養液中分離提純重組人血白蛋白的方法。本發明可以通過以下層析步驟達到(1)將含重組人血白蛋白的發酵上清液進行固定化金屬螯合親和層析，(2)將步驟(1)的產物經過疏水層析，(3)將步驟O)的產物經過陰離子交換層析(疏水型陰離子交換層析)。1975年，Poroth首次提出“固定化金屬螯合親和層析(Immobilized Metal-ChelatedAffinity Chromatography) ”的概念，首次成功地在瓊脂糖上偶聯了亞氨基二乙酸(IDA)鈉。IDA鈉鹽與金屬離子如Cu++螯合后，可與生物分子如蛋白質結合，不同的蛋白質與金屬離子結合力不同，從而將蛋白質分離。后來的研究表明經固定的金屬離子不僅與基質以螯合形式結合，還可以離子鍵、共價鍵形式結合，或分散在固體基質中以膠體狀存在。1983年Poroth把凡是固定在基質上的金屬(不管是否以離子狀態存在)與溶質的親和作用定義為“固定化金屬親和層析(IMAC) ”。目前，固定化金屬螯合親和層析技術已成為蛋白質，特別是基因重組蛋白和多肽分離純化最有效的工具之一。固定化金屬螯合親和層析的基本原理是過渡金屬離子能與電子供體氮、硫、氧等原子以配位鍵結合，金屬離子上剩余的空軌道是電子供體的配位點，在溶液中被水分子或陰離子占據。當蛋白質表面氨基酸殘基與金屬離子的結合力比它們更強時，則蛋白質取代它們與金屬離子形成復合物，從而使生物分子被吸附。用某種與吸附蛋白質競爭結合的溶質洗脫親和基質，特異性地將吸附的各種蛋白質分別洗脫下來，如咪唑。IMAC填料的基質可以選自瓊脂糖、纖維素、葡聚糖、聚酰胺、聚碳酸酯、聚羥乙基甲基丙烯酸酯、聚砜、聚乙烯醇、聚丙烯酸環氧烷、樹脂及上述物質的衍生物和共聚物，此外還有大孔硅膠、多孔玻璃、磷灰石等無機材料。IMAC填料的基質上含有配基，常用的配基有亞氨基二乙酸(IDA)、三羥甲基乙二胺(TED)，還有次氨基三乙酸(NTA)、羧甲基取代天冬氨酸(TEPA)及CMASP、CMDASA。已加好配基的IMAC填料有市售的，其中配基為三羥甲基乙二胺(TED)的填料商品名稱為IMAC Sepharose 6Fast Flow，配基為亞氨基二乙酸(IDA)的填料商品名稱為 Chelating Sepharose Fast Flow。與IMAC填料螯合的金屬離子有Cu2+、Ni2+、Zn2\ Co2+等，以Cu2+為最好。本發明的步驟(1)按照下述工藝進行操作我們從GE公司購買IMAC填料(IMAC Sepharose 6Fast Flow 1升)，來裝填 XK50/30層析柱，然后，在IMAC填料上螯合金屬離子。方法是使用0. 5倍層析柱體積的0. 2M金屬離子溶液，優選為銅離子溶液，流過層析柱，銅離子會與配基結合，再用純化水洗去未與配基結合的金屬離子。然后用含10-200mmol/L磷酸鹽、10-1500mmol/L氯化鈉、pH6-8的緩沖液A平衡層析柱，優選含20mmol/L磷酸鹽、600mmol/L氯化鈉、pH7. 5的緩沖液A，直到流入層析柱的緩沖液與流出層析柱的緩沖液的電導值、PH值相同，可視為已經平衡好。然后將含有重組人血白蛋白的樣品調整到與緩沖液A相同的條件，優選含 10-IOOmmol/L 磷酸鹽、10-1500mmol/L 氯化鈉、pH6_8。然后將調整好的含有重組人血白蛋白樣品的液體通過層析柱，用緩沖溶液A洗去未被層析柱吸附的物質。然后用含10-200mmol/L 磷酸鹽、10-1500mmol/L 氯化鈉、0. 1-1. OM 咪唑，pH6_8 的緩沖液B來洗脫目標蛋白，優選為20mmol/L磷酸鹽、600mmol/L氯化鈉、0. 3M咪唑、pH7. 5的緩沖液B，收集緩沖溶液B的洗脫峰。其重組人血白蛋白的純度可達65% -70%。在進入步驟(1)前，可以在穩定劑和還原劑存在的條件下，對發酵上清液進行熱處理。其中穩定劑是辛酸鈉，還原劑是半胱氨酸。本發明的步驟(1)使用了 IMAC柱層析，適用于各種鹽濃度下的重組蛋白質的純化，并允許含較高鹽濃度的發酵上清液直接上樣，甚至高達1. 5M鹽濃度的樣品也可以直接上樣。這一優點可有效減少上樣液總體積或省去超濾脫鹽的步驟而降低成本。還可以在 PH6-8的條件下吸附重組白蛋白，避免了在低PH值條件下(pH3-5)重組白蛋白被蛋白酶降解。IMAC柱層析還適用于實驗室、中試及工業化生產的重組人血白蛋白的有效分離和純化工作。本發明的另一個目的是除去重組人血白蛋白中的蛋白降解產物及降低色素含量， 以便進一步提高終產品的純度。將步驟(1)獲得的目標蛋白進一步經過步驟O)的疏水層析，可以達到上述目的。疏水層析(HIC)是眾所周知的色譜技術，其分離原理是基于蛋白表面疏水性的差異。許多被認為是親水性的生物大分子，仍然有足夠多的疏水基團暴露在外面，使其與連接于色譜基質的疏水基團相互作用。例如在專利EP0699687中，疏水層析早被建議用于重組人血白蛋白的純化。本發明步驟O)的疏水層析可以除去重組人血白蛋白中的重組人血白蛋白的降解產物，這些降解產物分子量通常在10-50Kda。應用疏水層析吸附重組人血白蛋白的降解產物，而全長的重組人血白蛋白在未結合部分被洗脫。重組人血白蛋白的降解產物與介質疏水基團之間的疏水作用強度可以通過小幅度提高所使用的緩沖液的離子強度而得以加強。目前許多市售的疏水介質都是可以使用的，生產廠家有美國通用公司(GE公司) 和日本東曹達公司(T0S0H公司)等，本發明對疏水介質不限定任何特定的基質和/或基質上的配基。疏水介質的實例比如但不限于美國通用公司的Wienyl Sepharose 6FF high sub, Phenyl S印harose 6FF low sub, ButylS印harose FF ；日本 TOSOH 公司的 Butyl-650M、Pheny 1-650M、Ether-650S 等等。所用基質可為有機材料或無機材料。有機材料例如天然聚合物如瓊脂糖、葡聚糖、 纖維素、淀粉等，或合成聚合物如二乙烯苯、苯乙烯。無機材料有大孔硅膠、多孔玻璃等，其中硅膠是眾所周知的廣泛使用的一種。基質上的配基可以是苯基、丁基、辛基、醚、異丙基等。步驟⑵的疏水介質與重組人血白蛋白之間可以有一個或多個作用位點。優選以瓊脂糖為基質的介質，優選含有苯基、丁基如正丁基、辛基如正辛基等的配基。還優選以二乙烯苯為基質、以醚、異丙基或苯基為配基的介質，例如GE公司的Source 。步驟(2)最優為應用交聯瓊脂糖連結苯基配基的介質，商品名稱為美國通用公司生產的 Phenyl S印harose 6FF high sub。步驟( 的疏水層析可以在pH4_8，優選pH6. 5-7,鹽濃度0. 1-0. 5M之間進行。過程是先用含10-100讓01/1磷酸鹽、10-500讓01/1氯化鈉、？!16-8的緩沖液C來平衡疏水層析柱，優選含50mmol/L磷酸鹽、0. 5M氯化鈉、pH6. 5的緩沖液C ；然后將步驟(1)得到的樣品調節到緩沖液C的條件；然后將樣品流過疏水層析柱，并用緩沖液C洗脫未與層析柱吸附的部分；最后，收集流穿和未與層析柱吸附的部分。在步驟⑵之前，可以在穩定劑，還原劑和金屬螯合劑存在下，對步驟⑴得到的產物進行熱處理。其中穩定劑是辛酸鈉，還原劑是半胱氨酸，金屬螯合劑是EDTA。與疏水作用分離原理相似的反相色譜相比，疏水層析使用的配基濃度低得多。這一特點提高了其選擇性，并且可使用溫和的洗脫條件以助于保持目的蛋白的生物活性。本發明的另一個目的是有效地去除rHA聚體，同時去除內毒素。將步驟O)獲得的目標蛋白進一步經過步驟(3)的陰離子交換層析，可以達到上述目的。陰離子交換層析介質可以使用GE公司的Q Sepharose Fast Flow、QSepharose high preformance>DEAE Sepahrose Fast Flow、Q Sepharose highpreformance 或Capto adhere ；或 T0S0H 公司的 T0Y0PEARL 樹脂QAE、SuperQ、DEAE ；或 BIO-RAD 公司的 UN0SPHERE Q ；或 PALL 公司的 Q CeramicHyperD 20、Q Ceramic HyperF^DEAE Ceramic HyperD F 等填料。Q介質除了具有去除雜蛋白及色素的功能，還具有去除融合蛋白樣品中聚合物和濃縮樣品的功能。復合型填料Capto adhere具有陰離子交換和疏水作用的雙重性質，它至少包含了與目的物作用的兩個位點，一個提供電荷相互作用，一個提供基于氫鍵和/或疏水的相互作用。此介質能有效地去除核酸、宿主蛋白、二聚體、多聚體、病毒。在步驟C3)之前，可以將步驟( 得到的產物經過IOK的超濾膜脫鹽，將溶液里的鹽脫掉。在本發明的另一實施方案中，在步驟(3)陰離子交換層析之前，使用硼酸鹽和氯化鈣，在PH9.0條件下處理步驟( 得到的層析液0. 5-M小時，能有效地降低糖及宿主蛋白的殘留量，同時能促使重組人血白蛋白的聚體向重組人血白蛋白單體轉化。本發明提供了一種從發酵液或哺乳動物培養液中分離提純重組人血白蛋白及其融合蛋白的方法。在本申請中，發酵上清液是通過克隆技術構建含人血白蛋白基困的畢赤酵母進行表達，得到發酵液，然后用日立大容量高速冷凍離心機(型號CR21G)在IOOOOg條件下，離心20分鐘，取上清液體除菌過濾后得到。與以往方法相比，操作步驟少、操作穩定、 純化方法簡單、具有獨特性。各步驟建立在等度洗脫的基礎上，因此適于實驗室、中試及工業化生產放大。特別是步驟(1)使用的IMAC柱層析，適用于各種鹽濃度下的重組蛋白質的純化，允許含較高鹽濃度的發酵上清液直接上樣。有效減少了上樣液總體積，省去超濾脫鹽的成本。還可以在PH6-8的條件下吸附重組白蛋白，避免了在低PH值條件下(ρΗ34)重組白蛋白被蛋白酶降解。


附圖1、純化前的發酵液樣品分析圖譜發酵液樣品經TSK-SW3000分析，顯示純度12%設備Agilent1200 液相色譜儀，液相色譜柱 TSK-GEL G3000SffXL 7. 8 X 300mm 色譜條件流動相含1 %異丙醇的pH7. 0的0. 2mol/L磷酸鹽緩沖液(取0. 5mol/L磷酸二氫鈉200ml,0. 5mol/L磷酸氫二鈉420ml、異丙醇15. 5ml及水914. 5ml，混勻)流速0. 6ml/ min，檢測波長280nm，進樣量20 μ 1，運行時間等度運行30分鐘，柱溫室溫附圖2、經過本專利工藝純化后的樣品分析圖譜經過實施例1方法獲得的樣品純化后樣品經TSK-SW3000分析，顯示純度99%以上附圖3、非還原電泳SDS-PAGE圖譜其中分離膠濃度(12% )、上樣量(8ug) 由左至右由左至右IMaker2參照的人血白蛋白樣品3發酵液4金屬螯合層析目的蛋白收集液5疏水層析樣品6陰離子層析后樣品7Capto adhere 層析后樣品
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例公用于說明本發明而不限制于本發明的范圍。實施例1 步驟(1)用固定化金屬螯合親和層析(IMAC)來捕獲樣品填料IMAC Sepharose 6Fast Flow 1升購自于GE公司，自己裝填層析柱，XK50/30 柱子，柱直徑5cm，填料高度15cm，用純化水沖掉保存液(20%乙醇)。用0. 5倍柱體積的0. 2M硫酸銅溶液過柱，用純化水沖掉未被吸附的銅離子。然后使用緩沖液A :20mmol/L磷酸鹽、600mmol/L氯化鈉、pH7. 5，平衡層析柱。把含人血白蛋白的發酵上清液加入磷酸鹽、氯化鈉、使之的達到20mmol/L磷酸鹽、600mmol/L 氯化鈉、pH7. 5。然后使用AKTATMPurify層析系統上樣，流速50ml/min。上樣后，用緩沖液A洗滌， 至吸收值達到基點。用緩沖液B :20mmol/L磷酸鹽、600mmol/L氯化鈉、0. 3M咪唑、PH7. 5來洗脫目標蛋白，收集緩沖溶液B的洗脫峰。
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步驟( 用疏水層析(HIC)進行純化對步驟(1)收集的B緩沖溶液洗脫峰進行疏水層析純化。用苯基疏水層析介質Phenyl Sepharose 6Fast Flow (high sub) (GE 公司)來裝填直徑5cm的層析柱，柱高15cm。利用其它疏水性介質也具有相同的分離效果，但其疏水性與苯基介質的疏水性有所不同，試驗者可根據所分離的目標蛋白的疏水性來選擇。介質在使用前需用3倍柱體積的緩沖液C :50mmol/L磷酸鹽、0. 5M氯化鈉、PH6. 5平衡。向步驟(1)得到含目標蛋白的B緩沖溶液的洗脫液中加入去離子水，稀釋至 0. 5MNaCl的濃度，用磷酸調pH值至6. 5。用AKTA Purify層析系統上樣，流速50ml/min，上樣結束后，用2倍柱體積的緩沖液C :50mmol/L磷酸鹽、0. 5M氯化鈉、PH6. 5繼續洗脫。收集流穿峰和用緩沖液C的洗脫峰。 與疏水層析柱結合的部分，用2倍柱體積的去離子水洗脫，流出液丟棄。將疏水層析柱收集液，加入終濃度為0. IM的四硼酸鈉和氯化鈣溶液，調節pH至 9. 0，處理0. 5-24小時，然后IOOOOrpm離心20min，取上清液，用MIPP0RE公司的IOK超濾膜脫鹽。步驟(3)使用陰離子交換層析精制樣品裝Q S印harose High Preformance ±真料于一根直徑2. 6cm、高15cm的層析柱子中，填料體積80毫升。用2倍柱體積的去離子水洗滌，然后用5倍柱體積的緩沖液E(50mM PB, pH7. 0)平衡。上樣后使用2個柱體積的緩沖液E洗滌。然后用0-0. 5M NaCl經10倍柱體積梯度洗脫，收集主峰。實施例2:步驟(1)用金屬螯合層析介質的層析柱來捕獲樣品填料Chelating購自于GE公司，自己裝填層析柱，直徑5cm，填料高度15cm，用純化水沖掉保存液(20%乙醇)然后用0. 5倍柱體積的0. 2M硫酸銅溶液過柱，然后用純化水沖掉未被吸附的銅離子。使用平衡液A :20mmol/L磷酸鹽、600mmol/L氯化鈉、pH7. 5平衡層析柱，然后把含目標蛋白的樣品調整到緩沖液與A相同的條件，即20mmol/L磷酸鹽、600mmol/L氯化鈉、 PH7. 5。然后使用AKTA Purify層析系統上樣，流速50ml/min。上樣后，用平衡液A洗滌，至吸收值達到基點，流出液棄去。然后用緩沖液B :20mmol/L磷酸鹽、600mmol/L氯化鈉、0. 3M咪唑、PH7. 5的緩沖液來洗脫目標蛋白，收集緩沖溶液B的洗脫峰。步驟( 利用疏水層析填料(HIC)進行純化用實施例(1)中收集的B緩沖溶液洗脫峰的純化，來說明利用疏水性介質來純化目標蛋白。用苯基(Phenyl Sepharose 6Fast Flow (high sub)GE公司)層析介質來裝填直徑5cm的層析柱，柱高15cm，用于疏水性分離。其它疏水性介質也具有相同的分離效果，但疏水性與苯基的疏水性有所不同，試驗者可根據所分離的目標蛋白的疏水性來選擇。
介質在使用前需用3倍柱體積的緩沖液C :50mmol/L磷酸鹽緩沖液、0. 5M氯化鈉、 PH6.5平衡，將實施例(1)步驟(1)中得到的含目標蛋白的溶液加入去離子水稀釋至0.5M NaCl的濃度，用磷酸調pH值至6. 5。用AKTA Purify層析系統上樣，流速50ml/min。上樣結束后，用2倍柱體積的緩沖液-C :50mmol/L磷酸鹽緩沖液、0. 5M氯化鈉、PH6. 5繼續洗脫。收集流穿峰和用緩沖液C 的洗脫峰。與疏水層析柱結合部分用2倍柱體積的去離子水洗脫，流出液棄去。將疏水層析柱收集液，加入終濃度為0. IM的四硼酸鈉和氯化鈣，調節pH至9. 0， 處理0. 5-24小時，然后IOOOOrpm離心20min，取上清液，用Millipore公司的IOK超濾膜脫鹽。步驟(3)使用離子交換介質精制樣品裝 Q Sepharose High Preformance 介質于一根直徑 2. 6cm 高 15cm 的層析柱子 (填料體積80毫升)中。用2倍柱體積的去離子水洗滌，然后用5倍柱體積的緩沖液E (50mM PB，pH7. 0)平衡。上樣后使用2個柱體積的緩沖液E洗滌。然后用0-0. 5MNaCl經10倍柱體積梯度洗脫，收集主峰。Q介質除了具有去除雜蛋白的功能，還具有去除融合蛋白樣品中聚合物和濃縮樣品的功能。
權利要求
1.一種純化重組人血白蛋白的方法，該方法包括以下層析步驟(1)將含重組人血白蛋白的發酵上清液，進行固定化金屬螯合親和層析，(2)將步驟(1)的產物經過疏水層析，(3)將步驟O)的產物經過陰離子交換層析(疏水型陰離子交換層析)。
2.根據權利要求1所述的方法，其中固定化金屬螯合親和層析填料的基質選自下列的一種或多種瓊脂糖、纖維素、葡聚糖、聚酰胺、聚碳酸酯、聚羥乙基甲基丙烯酸酯、聚砜、聚乙烯醇、聚丙烯酸環氧烷、樹脂、或上述物質的衍生物和共聚物、或大孔硅膠、多孔玻璃、磷灰石。
3.根據權利要求2所述的方法，所述基質材料是瓊脂糖。
4.根據權利要求1所述的方法，固定化金屬螯合親和層析填料的基質上含有的配基選自亞氨基二乙酸、三羥甲基乙二胺和次氨基三乙酸。
5.根據權利要求4所述的方法，其中配基選自三羥甲基乙二胺或亞氨基二乙酸。
6.根據權利要求1所述的方法，與固定化金屬螯合親和層析填料螯合的金屬離子選自 Cu++、Ni++、Zn++ 或 Co++。
7.根據權利要求6所述的方法，所述金屬離子為Cu++。
8.根據前面任一權利要求所述的方法，其中在進入步驟(1)前，在穩定劑和還原劑存在的條件下，對發酵上清液進行熱處理。
9.根據前面任一權利要求所述的方法，其中在步驟( 之前，在穩定劑，還原劑和金屬螯合劑存在下，對步驟(1)得到的產物進行熱處理。
10.根據權利要求8或9所述的方法，其中穩定劑是辛酸鈉，還原劑是半胱氨酸，金屬螯合劑是EDTA。
11.根據前面任一權利要求所述的方法，其中步驟( 所使用疏水層析介質是含有苯基、脂肪族和/或雜環為配基的疏水層析介質。
12.根據前面任一權利要求所述的方法，其中在步驟(3)之前，將步驟(2)得到的產物經過超濾膜脫鹽。
全文摘要
本發明區別于目前常用的從人血漿中提純人血白蛋白的方法，提供了一種從發酵液或哺乳動物細胞培養液中分離提純重組人血白蛋白的簡單方法。本發明使用的固定化金屬螯合親和層析(IMAC)步驟，適用于各種鹽濃度下的重組蛋白質的純化，允許含較高鹽濃度的發酵上清液直接上樣，有效地減少了上樣液總體積，降低成本。本發明方法穩定、高效，并適于實驗室、中試及工業化生產放大。
文檔編號C07K1/20GK102234332SQ20101015498
公開日2011年11月9日 申請日期2010年4月26日 優先權日2010年4月26日
發明者王歡, 白驊, 聶磊, 蔡秀云, 郭婷婷 申請人:浙江海正藥業股份有限公司