一種長效白細胞介素-1受體拮抗劑重組融合蛋白及其制備方法和用圖
【技術領域】
[0001]本發明屬生物制藥技術領域。涉及基因工程長效細胞因子及其制備方法，具體涉及一種長效白細胞介素-1受體拮抗劑重組融合蛋白及其制備方法，和在用于制備治療類風濕性關節炎、糖尿病、動脈粥樣硬化及炎癥和神經退行性疾病的藥物中的用途。
【背景技術】
[0002]現有技術公開了白細胞介素-1受體措抗劑(interleukin-1 receptorantagonist, IL-lRa),與IL-1 α、IL-1 β三者共同屬于IL-1家族成員，也是由單核細胞、巨嗷細胞等產生(Garlanda C, Dinarello CA, Mantovani A The interleukin-1family:back to the future.1mmunity.2013 Dec 12 ；39(6):1003-18.do1:10.1016/j.1mmun1.2013.11.010.)。IL-lRa是IL-1 a、IL-1 β共同的拮抗劑，雖然結合后并不激活受體，但能阻斷白細胞介素-1與該受體的結合及信號傳導，達到特異性地封閉白細胞介素-1活性的目的。研究顯示，白細胞介素-1受體拮抗劑蛋白序列與IL-la、IL-Ιβ在受體結合部位即C-末端區顯著相似。hIL-1Ra的氨基酸序列與小鼠的IL-lRa有77%的同源性，IL-lRa的生物學作用沒有種屬特異性(van de Veerdonk FL, Netea MG.NewInsights in the Immunob1logy of IL-1 Family Members.Front Immunol.2013 Jul8 ；4:167.do1: 10.3389/fimmu.2013.00167.eCollect1n 2013.)。不同細胞產生的 IL-lRa 分子量差異主要由糖基化程度的不同所致。已有研究證實，糖基化對IL-lRa的生物學活性沒有影響(Hannum CH, Wilcox CJ, Arend WP, Joslin FG, Dripps DJ, Heimdal PL, ArmesLG, Sommer A, Eisenberg SP，Thompson RC.1nterleukin-lreceptor antagonist activityof a human interleukin-1 inhibitor.Nature.1990Jan 25 ；343(6256):336-40.MalyakM，Smith MF Jr, Abel AA，Arend WP.Peripheral blood neutrophil product1n ofinterleukin-1 receptor antagonist and interleukin-1 beta.J Clin Immunol.1994Jan ；14(1):20-30.)。
[0003]研究發現，白細胞介素-1由機體對炎癥刺激反應產生，并介導炎癥反應；IL_1受體信號傳導的紊亂可引起類風濕性關節炎、糖尿病等嚴重的病況；白細胞介素-1受體拮抗劑能特異性地與IL-1受體結合，從而拮抗IL-1的各種生物學效應。在臨床上廣泛應用于治療 IL-1 參與病理變化過程的相關疾病(Arend WP.The balance between IL-1 and IL-lRain disease.Cytokine Growth Factor Rev.2002 Aug-0ct ; 13 (4-5):323-40.)。2001 年11月美國食品藥品監督管理局批準了由美國Amgen公司研制的rhlL-lRa，用于減輕年滿18周歲，曾經一種或多種緩解病情的抗風濕藥治療失敗患者的中至重度風濕性關節炎癥狀，是第一個以抑制IL-1為靶點的類風濕性關節炎治療藥物，成為類風濕性關節炎生物學治療領域的研究熱點(Fleischmann R，Stern R，Iqbal 1.Anakinra:an inhibitor ofIL-1 for the treatment of rheumatoid arthritis.Expert Opin B1l Ther.2004 Aug ；4(8): 1333-44.)。還有研究顯示，IL-lRa的臨床用量很大，需單次給藥劑量高達100mg，由于IL-lRa的分子量小，易被腎小球的濾過作用清除，其在血漿中的終末半衰期相對較短，只有4-6小時，為了維持體內有效的血藥濃度，通常需要每天注射一次。延長IL-lRa的血漿半衰期可帶來廣泛的臨床益處，如，允許更低頻率地給藥，減輕注射部位的反應，減輕病人的痛苦等，因此，提供長效化的IL-lRa將具有重要的社會意義和商業價值。
[0004]有關蛋白質的重組多肽修飾研究公開了重組多肽的氨基酸序列由天然存在的親水性氨基酸組成，因而可生物降解且沒有免疫原性，采用分子遺傳操作將重組多肽與治療性目的蛋白進行融合表達，可顯著延長治療性蛋白的半衰期(Schellenberger V，WangCff, Geething NC，Spink BJ，Campbell A，To ff, Scholle MD, Yin Y，Yao Y, Bogin 0 et al: Arecombinant polypeptide extends the in vivo half-life of peptides and proteinsin a tunable manner.Nat B1techno 1 2009，27(12): 1186-1190)。目前已有研究證實重組多肽與人生長激素形成的融合蛋白、與胰高血糖素形成的蛋白均能有效延長目的蛋白的半衰期；與胰高血糖素樣肽2相比，重組多肽與其融合形成的重組蛋白在小鼠、大鼠及猴子體內的半衰期分別為 34h、38h和 120h (Cleland JL, Geething NC，Moore JA，Rogers BC，SpinkBJ，Wang CW，Alters SE，Stemmer WP, Schellenberger V:Anovel long-acting humangrowth hormone fus1n protein(VRS-317):enhanced in vivo potency and half-life.J Pharm Sci 2012，101 (8):2744-2754 ;Alters SE,McLaughlin B，Spink B,LachinyanT，Wang Cff, Podust V, Schellenberger V，Stemmer WP:GLP2-2G-XTEN:a pharmaceuticalprotein with improved serum half-life and efficacy in arat Crohn’s diseasemodel.PLoS One 2012，7 (11): e50630)。此外，重組多肽與治療性蛋白融合基因可通過大腸桿菌工程菌實現原核表達，與人血清白蛋白和人免疫球蛋白IgGFc片段真核表達相比，更具有產業化優勢。
[0005]本申請的發明人擬提供一種長效白細胞介素-1受體拮抗劑重組融合蛋白，利用其生物相容性及生物可降解性的特點，延長相關藥物蛋白的半衰期。

【發明內容】

[0006]本發明的目的是提供一種長效白細胞介素-1受體拮抗劑重組融合蛋白及其制備方法，和在用于制備治療類風濕性關節炎、糖尿病、動脈粥樣硬化及炎癥和神經退行性疾病的藥物中的用途。本發明解決的關鍵技術問題是在延長白細胞介素-1受體拮抗劑的體內半衰期的同時保持其活性，降低免疫原性。
[0007]本發明提供了一種長效白細胞介素-1受體拮抗劑重組融合蛋白，該重組融合蛋白是由N-端白細胞介素-1受體拮抗劑與C-端天然存在的親水性無重復序列多肽融合制成的重組蛋白；所述的長效白細胞介素-1受體拮抗劑能減少白細胞介素-1受體拮抗劑的免疫原性，延長白細胞介素-1受體拮抗劑在體內的半衰期；該融合蛋白可在大腸桿菌中高效表達，且制備工藝簡單，可用于大規模的藥物級融合蛋白的生產和制備。
[0008]本發明中，所述天然存在的親水性無重復序列多肽的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示；其編碼的核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示；本發明中優選適合于大腸桿菌原核表達的編碼的核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示；
[0009]SEQ ID N0.1
[0010]Gly Thr Ser Thr Pro Glu Ser Gly Ser Ala Ser Pro Gly Thr Ser Pro Ser GlyGlu Ser Ser Thr Ala Pro Gly Thr Ser Pro Ser Gly Glu Ser Ser Thr Ala Pro Gly SerThr Ser Ser Thr Ala Glu Ser Pro Gly Pro Gly Ser Thr Ser Glu Ser Pro Ser Gly ThrAla Pro Gly Ser Thr Ser Ser Thr Ala Glu Ser ProGly Pro Gly Thr Ser Pro Ser GlyGlu Ser Ser Thr Ala Pro Gly Thr Se