一種表達重組vegf融合蛋白的基因工程菌的構建的制作方法
【技術領域】
[0001] 在基因工程領域，本發明公開了一種新的融合蛋白重組工程菌及其構建方法，以 及該融合蛋白的純化。
【背景技術】
[0002] 重組質粒指的是在基因工程的領域，在體外將目的基因和載體結合成一個具有自 我復制能力的DNA分子，繼而轉化或轉染入宿主菌株或細胞，篩選出含目的基因的重組子。 融合蛋白技術是為了獲得目標蛋白而進行的有目的性的基因重組和蛋白表達的方法。利用 融合蛋白技術，可構建和表達具有多種功能的新型目的蛋白。
[0003] 腫瘤疫苗按抗原成分的類型可分為腫瘤細胞型疫苗、腫瘤抗原多肽及蛋白疫苗、 DNA疫苗和樹突狀細胞疫苗等。無論何種類型的腫瘤疫苗，其研制的關鍵都在于選擇合適的 靶抗原和提高免疫原性。
[0004] 腫瘤細胞會表達腫瘤相關抗原或腫瘤特異性抗原，針對這些抗原發展起來的腫瘤 特異性免疫治療，是腫瘤生物治療的重要方法。
[0005] 腫瘤相關抗原（tumor-associatedantigen，TAA):指并非某一種腫瘤所特有，在 其他腫瘤細胞或正常細胞上也存在的抗原分子。正常細胞與腫瘤細胞僅在增殖中有量的差 異，因此稱為相關抗原。
[0006] 血管內皮生長因子（Vascularendothelialgrowthfactor)是最重要的血管內 皮細胞刺激因子，它可與血管內皮細胞相應受體結合，刺激血管內皮細胞的增殖、迀移，誘 導新生血管形成，提高血管通透性，使腫瘤持續生長。大多數腫瘤細胞均高水平表達VEGF， 而正常組織中僅腎、卵巢等少數臟器有較高水平的表達，因此VEGF是抗腫瘤血管治療理想 的靶部位。VEGFm突變體I是本實驗室用破傷風毒素兩個強T輔助表位618-627和831-838 替換hVEGF121的1-8和115-121兩個肽段。結果說明在保持半胱氨酸結原有二聚體結構的 前提下，破傷風毒素兩個強T輔助表位hVEGF非關鍵殘基置換后，可有效提高VEGF的免疫 原性。
[0007] 胃泌素釋放肽（gastrin-releasingpeptide，GRP)是哺乳動物中的娃皮素同系 物，為一種胃腸道神經激素，含有27個氨基酸，具有生長因子樣作用。通過自分泌或旁分泌 途徑，GRP可以刺激腫瘤細胞的生長，參與腫瘤新生血管的生成，促進腫瘤的轉移等。GRP及 其受體在多種腫瘤細胞中存在過表達，在有限的正常組織中有少量的分布，因此GRP及其 受體是腫瘤治療的理想靶點。GRP的C端7至8個氨基酸就是其抗原表位，因此我們選擇 GRP的C端十肽可以完全覆蓋GRP的表位。抗原表位多肽重復多次，可以增加抗原表位的劑 量，增加整個抗原的分子量，從而增加抗原表位多肽的免疫原性。
[0008] 由于單獨用VEGF或GRP免疫原性相對較低，本發明將VEGFmI-M2基因同GRP基 因連接起來，組建pET28a-VEGF1，2-61^6重組質粒，誘導表達融合蛋白，將其作為疫苗刺激 機體產生主動免疫，打破免疫耐受，產生針對VEGF和GRP特異性肽段的抗體，從而抑制腫 瘤的生長。

【發明內容】

[0009] 本發明公開一種表達重組VEGF融合蛋白的基因工程菌。
[0010] 本發明的一個目的是提供該重組菌的制備方法，方法簡便，易于操作。
[0011] 本發明的另一個目的是公開該重組蛋白的純化方法。
[0012] 在本發明的第一個方面，該大腸桿菌菌株命名為Escherichia coli BL21(DE3)/ VG6:pET28a-VEGF I-M2-GRP6，菌株已提交中國典型培養物保藏中心，保藏地址：中國、武 漢、武漢大學。保藏日期：2015年8月21日，保藏編號為CCTCC N0:M2015497,分類命名為 Escherichia coli BL21(DE3)/VG6,其細胞中含有重組質粒pET28a-VEGF I-M2-GRP6,質粒中 含有SEQ ID NO. 1所示的重組突變VEGF基因序列。
[0013] 在本發明的第二個方面，提供了該重組質粒的制備方法，其技術路線詳述如下：
[0014] 1.重組質粒pET28a-VEGF I-M2-GRP6及相應基因工程菌的構建
[0015] 根據本實驗室已有的關于重組質粒pET28a-HSP65-GRPf^P pET28a-VEGF I-M2的序 列信息，利用引物設計軟件Primer5和oligo7來設計上游引物VI、V2和下游引物Gl、 G2。上游引物VI中引入NcoI，NheI酶切位點以及DPTGG連接肽序列。采用PCR技術從 pET28a-VEGF I-M2質粒中克隆得到基因VEGF I-M2-DP TGG，以及從pET28a-HSP65-GRP6質 粒中克隆得到GRP6基因。通過酶切、酶連和轉化技術將PCR的產物VEGF I-M 2-DPTGG插入 pET-28a質粒載體的相應酶切位點中，再將GRP6基因轉入剛轉化成功的質粒中組成重組質 粒pET28a-VEGF I-M2-GRP6，將重組質粒轉化大腸桿菌E.coliBL21獲得需要的重組基因的 工程菌。
[0016] 2.融合蛋白的誘導表達
[0017] 將重組工程菌進行活化，接種至含卡那霉素的LB培養基中震蕩培養過夜，按 1 : 100轉接于新鮮LB培養液中，37°C培養至A600值為0. 6-0. 8時，加入乳糖（終濃度 7mM)進行誘導表達，7h后離心收取菌體沉淀，進行12%SDS-PAGE分析，觀察目的蛋白條帶 位置和表達量。
[0018] 3.融合蛋白的分離純化
[0019] 收集菌體，每克濕菌體加入10mL菌體裂解緩沖液溶解，再進行超聲裂解操作，充 分裂解菌體；離心收集沉淀。將沉淀先用包涵體洗滌液A溶解，室溫磁力攪拌30min，離 心取沉淀；再分別用包涵體洗滌液B和雙蒸水溶解，重復上述洗滌步驟，去除部分雜蛋白 和核酸。將沉淀加入包涵體裂解液，4°C攪拌過夜溶解，離心收集上清。將上清用梯度復 性法進行復性，最后用層析緩沖液于4°C充分透析，離心棄沉淀，上清液過陰離子交換柱 DEAE-cellulose做進一步純化，用濃度梯度為0-1MNaCl層析緩沖液梯度洗脫，收集洗脫 峰，檢測合并目的蛋白峰組分，對蒸餾水充分透析后凍干保存。
【附圖說明】
[0020] 圖1重組質粒構建原理示意圖。
[0021] 圖2 1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物VEGF121I-M2_DPTGG基因的結果。
[0022] Lanel :Protein Marker，Lane2 :VEGF121I_M2-DPTGG基因
[0023] 圖3 1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物GRP6基因的結果。
[0024]Lanel:ProteinMarker，Lane2 :GRP6基因
[0025] 圖4攜帶VEGF121I-M2-DPTGG基因的pET28a質粒正向測序圖
[0026] 圖5 1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物VEGF121I-M2-GRP6基因的結果。
[0027]Lanel:ProteinMarker，Lane2 :VEGF121I_M2-GRP6基因
[0028] 圖6重組質粒的基因正向測序圖。
[0029] 圖7 15%SDS-PAGE電泳檢測重組菌經乳糖誘導表達融合蛋白的誘導曲線。
[0030]Lanel:ProteinMarker，Lane2 :誘導前的全菌蛋白樣品，Lane3_10 :誘導后l_8h 每個小時的全菌蛋白樣品
[0031] 圖8 15%SDS-PAGE電泳檢測融合蛋白破碎后圖。
[0032]Lanel:誘導前全菌蛋白，Lane2 :誘導后6h全菌蛋白，Lane3 :菌體離心后上清， Lane4 :菌體離心后沉淀，Lane5 :超聲破碎后取樣，Lane6 :超聲破碎后離心上清，Lane7 :超 聲破碎后沉淀
[0033] 圖9 15%SDS-PAGE電泳檢測蛋白梯度復性
[0034]Lanel:ProteinMarker，Lane2 :8M尿素溶解上清，Lane3 :4M尿素透析外液， Lane4 :4M尿素透析內液，Lane5 :2M尿素透析外液，Lane6 :2M尿素透析內液，Lane7 :1M尿 素透析內液，Lane8 :Tris_HCL透析內液，Lane9:Tris-HCL透析外液
【具體實施方式】
[0035] 材料
[0036](1)菌株
[0037]載體pET28a-HSP65-GRP6,EscherichiacoliBL21(DE3)，菌株pET28a-VEGF121I-M2 均為本實驗室保存。
[0038](2)酶和試劑
[0039] 分子克隆工具酶為Fermentas公司產品；質粒抽提試劑盒為上海捷瑞生物科技有 限公司；產物純化試劑盒以及PCR膠回收試劑盒為上海生工生物科技有限公司的產品。
[0040] (3)培養基
[0041]LB培養基，配方見參考文獻SambrookJ，FristshEF，ManiatisT.Molecular Cloning；ALaboratoryManual2nded.NY：ColdSpringHarborLaboratoryPress， 1989〇
[0042] 本說明書所提及的方法中質粒提取、PCR反應、內切酶酶切、PCR產物的回收、連 接和轉化大腸桿菌，這些都是基因工程研究領域的常規操作方法，具體參見SambrookJ， FristshEF，ManiatisT.MolecularCloning；ALaboratoryManual2nded.NY：Cold SpringHarborLaboratoryPress，1989,pp.16-340。
[0043] 實施例1VEGF121I-M2_GRP6基因的克隆
[0044] 根據本實驗室已構建的關于pET28a-VEGFmI_M2的序列信息，利用引物設計軟件 primer、oligo分別設計兩對引物VI、V2 :
[0045]VI:5, -CATGCCATGGACATCATCGACGACT-3'
[0046]V2 :5, -CGGCTAGCGCCACCAGTCGGATCCTTGTTGTGAGCGGCAA-3，
[0047] 上游引物VI中引入酶切位點NcoI，下游V2中引入酶切位點NheI以及柔性肽 DPTGG。用質粒提取試劑盒提取質粒pET28a-VEGF121 I-M2和質粒pET28a。利用引物V1、V2克隆VE