專利名稱：基因重組融合蛋白k1－en的制備方法
技術領域：
本發明涉及一種基因重組融合蛋白K1-EN的制備方法。
背景技術：
惡性腫瘤即癌癥，是威脅人類健康的最嚴重的疾病之一。惡性實體腫瘤的常規治療包括手術摘除、化學治療、放射治療等，這些治療方法存在易復發，對人體的毒副作用大，會誘導抗藥性產生等不理想之處。生命科學基礎研究的突破和生物技術的發展，為惡性腫瘤的最終攻克提供了其他更加有效和可行的手段。
20世紀70年代初，Folkman博士提出“腫瘤增殖具有血管依賴性”的觀點，即體積超過1mm3～2mm3的腫瘤需要新生血管維持營養和氧氣的供給并且排出代謝產物，還需要新生血管提供轉移的通道。從這個觀點出發，提出一種治療腫瘤的新策略，即不直接從正面攻擊腫瘤，而是阻斷腫瘤的營養供應，間接地抑制腫瘤生長，使其處于休眠狀態。這就是抗血管生成療法，也被形象地稱為腫瘤的“餓死療法”。
抗血管生成療法是近幾年來腫瘤生物治療研究的熱點，與以往的方法相比，有著顯著的優越性①廣泛的抑瘤譜；②不易產生耐藥性；③無明顯毒副作用；④藥物易于到達靶部位；⑤可同時治療腫瘤的轉移；⑥與化療和放療有協同作用。目前已發現了多種血管生成抑制劑，有數百種藥物進入了臨床試驗階段，大多數處于二期臨床，有十幾種藥物進入了三期臨床，它們都顯示出了初步療效和光明的治療前景。
Angiostatin(血管抑素)是人纖溶酶原(Plasminogen)的kringle1-kringle4區域，具有抑制血管內皮細胞增殖的能力。目前血管抑素已進入一期臨床試驗。其中K1(Kringle 1)不僅能有效抑制內皮細胞的增殖，還具有結合賴氨酸的能力(可以用賴氨酸親和柱純化蛋白)。
Endostatin(內皮抑素，EN)是膠原蛋白XVIII C未端片段，根據人膠原蛋白XVIII得到的人Endostatin有183個氨基酸。Endostatin含有Zn結合位點，參與結合的氨基酸殘基是位于第1，3，11位的組氨酸和第76位的天冬氨酸，其N端環繞Zn形成二聚體結構。Endostatin含有11個精氨酸，與肝素有很高的親和力。Endostatin在癌癥的臨床治療方面具有廣闊的應用前景。一是它具有很強的抑制血管生成的作用，即使是腫瘤已發生轉移，也可以抑制其進一步發展。二是Endostatin具有高特異性。對正常細胞及其它組織無明顯影響，在觀察期內沒有發現對機體的毒害作用。三是不誘導杭藥性產生。四是可實現對腫瘤的休眠療法。

發明內容
本發明的目的在于提供一種基因重組融合蛋白K1-EN的制備方法，該方法利用畢赤酵母真核表達系統對重組基因K1-EN進行表達，從而得到一種多靶點、多功能、高效的抗腫瘤血管生成基因重組融合蛋白K1-EN。
為達到上述目的，本發明采用如下技術方案一種基因重組融合蛋白K1-EN的制備方法，其特征在于該方法，包括以下步驟a.重組質粒pPICZαA-K1-EN的構建重組質粒pPICZαA-K1-EN包括2個功能域片段和1段連接臂，2個功能域片段分別是K1基因和EN基因；1段連接臂是連接K1基因和EN基因的柔性連接臂(Gly)3；b.重組酵母基因工程菌pPICZαA-K1-EN/GS115的構建；c.重組融合蛋白K1-EN的表達；d.重組融合蛋白K1-EN的純化。
上述的重組質粒pPICZαA-K1-EN的構建方法為以K1基因為模板進行PCR擴增，得到約300bp的K1基因。K1片段用EcoRI和Kpn I雙酶切后插入質粒pPICZαA的EcoRI/Kpn I之間，構成重組質粒pPICZαA-K1。轉化大腸桿菌TOP10F’，挑選出抗Zeocin的陽性克隆。
上述的重組質粒pPICZαA-K1-EN的構建的方法為以EN基因為模板進行PCR擴增，得到約560bp的EN基因，EN片段用Kpn I和NotI雙酶切后插入重組質粒pPICZαA-K1的Kpn I/NotI之間，構成重組質粒pPICZαA-K1-EN；轉化大腸桿菌TOP10F’，挑選出抗Zeocin的陽性克隆。
上述的重組酵母基因工程菌pPICZαA-K1-EN/GS115的構建的方法為重組質粒pPICZαA-K1-EN用Sac I線性化后，電擊轉化畢赤酵母GS115，點擊參數為700V，5ms，將電擊后的混合液涂布在Zeocin濃度分別為100，250，500和1000ug/ml的YPDS平板上，30℃培養2～4天，待克隆長出。
上述的重組融合蛋白K1-EN的表達方法為將重組酵母接種在BMGY中，振蕩培養使菌增殖至O.D.＝5～6，離心收集菌體，將菌體重懸在BMMY中，使其O.D.值達到5.0，在28℃下進行甲醇誘導。每隔24小時補加甲醇至甲醇終濃度為1.0％，發酵至第96小時時停止發酵，收獲蛋白。
上述的重組融合蛋白K1-EN的純化為用環氧氯丙烷法制備Sepharose-4B-Lys親和柱，發酵上清液首先用0.002M PBS，PH＝7.4，4℃充分透析，然后加入用0.002MPBS，PH＝7.4平衡好的親和柱，0.01M PBS，PH＝7.4洗去雜蛋白，0.2M EACA(6-氨基正己酸)/0.002M PBS，PH＝7.4洗脫，洗脫產物經0.002M PBS，PH＝7.4，4℃，2×24小時透析后凍存在-20℃。
畢赤酵母是真核表達系統，能以甲醇為唯一碳源，pPICZαA是分泌型表達質粒，含有醇氧化酶的強啟動子(PAOX1)，在甲醇的誘導下能表達外源蛋白，并能分泌到胞外，方便蛋白的提取與純化。畢赤酵母能通過發酵罐發酵生產大量的目的蛋白，不需要外加熱源，成本低，規模大。


圖1為重組質粒pPICZαA-K1-EN的構建流程2為K1-EN蛋白對PIEC細胞生長的抑制率曲線圖具體實施方式
本發明主要包括三大部分重組酵母基因工程菌pPICZαA-K1-EN/GS115的構建，重組融合蛋白K1-EN的表達與純化，重組融合蛋白K1-EN生物活性的測定。
具體方案敘述如下1 重組質粒pPICZαA-K1-EN的構建和鑒定1.1構建重組質粒pPICZαA-K1根據K1的核苷酸序列設計K1的上下游引物上游引物5’-GGG GAA TTC GTG TAT CTC TCA GAG-3’；下游引物5’-TTT GGT ACC GCC ACC TTC CTC TTC ACA C-3’。
在K1的下游引物中引入連接臂(Gly)3的核苷酸序列，這樣在PCR擴增之后就能直接得到約300bp的COOH端帶有連接臂(Gly)3的K1片段。回收純化擴增產物。
K1片段用EcoRI和Kpn I雙酶切后插入質粒pPICZαA的EcoRI/Kpn I之間，構成重組質粒pPICZαA-K1。轉化大腸桿菌TOP10F’，挑選出抗Zeocin的陽性克隆。重組質粒pPICZαA-K1用EcoRI和Kpn I雙酶切，得到300bp和3.6kb兩個片段，與預期結果相符。DNA序列測定表明，K1基因的序列正確。
1.2構建重組質粒pPICZαA-PFK-EN根據EN的核苷酸序列設計EN的上下游引物上游引物5’-TTT GAA TTC CAC AGC CAC CGC GAC TTC-3’；
下游引物5’-TTC GCG GCC GCT CAT TAC TTG GAG GCA-3’。以EN的cDNA為模板進行PCR擴增，得到約560bp的EN基因。EN片段用Kpn I和NotI雙酶切后插入重組質粒pPICZαA-K1的Kpn I/NotI之間，構成重組質粒pPICZαA-K1-EN。轉化大腸桿菌TOP10F’，挑選出抗Zeocin的陽性克隆。
重組質粒pPICZαA-K1-EN用EcoRI和NotI雙酶切，得到約860bp和3.6kb兩個片段，與預期結果相符。DNA序列測定表明，K1-EN基因的序列正確。
2 重組酵母基因工程菌pPICZαA-K1-EN/GS115的構建和鑒定重組質粒pPICZαA-K1-EN用Sac I線性化后，電擊轉化畢赤酵母GS115，點擊參數為700V，5ms，將電擊后的混合液涂布在Zeocin濃度分別為100，250，500和1000ug/ml的YPDS平板上，30℃培養2～4天，待克隆長出。挑選Zeocin濃度為1000ug/ml平板上長出的克隆。用玻璃珠法提取重組酵母的染色體組，以其為模板，以K1-EN的上下游引物進行PCR擴增，得到約860bp大小的片段，說明融合基因K1-EN成功地整合到了酵母染色體上。
3 重組融合蛋白K1-EN的表達將重組酵母接種在BMGY中，振蕩培養使菌增殖至O.D.＝5～6，離心收集菌體，將菌體重懸在BMMY中，使其O.D.值達到5.0，在28℃下進行甲醇誘導。每隔24小時補加甲醇至甲醇終濃度為1.0％，并且每隔24小時(0，24，48，72，96小時)取出1ml菌液，將取出來的菌液離心，把上清液和菌體分別保存在-80℃。
將甲醇誘導不同時間(0，24，48，72，96小時)的發酵上清液濃縮后用SDS-PAGE分析，觀察到在39KD處有特異性蛋白條帶；并且隨誘導時間延長，重組酵母表達目的產物的量也隨之增加。Bradford法測定發酵液中總蛋白含量并用凝膠圖像掃描測定目的蛋白所占的比例，計算出

4 重組融合蛋白K1-EN的純化融合蛋白K1-EN中的K1具有結合賴氨酸的能力，因此可以用Sepharose 4B-Lys親和柱純化。用環氧氯丙烷法制備Sepharose-4B-Lys親和柱，發酵上清液首先用0.002MPBS，PH＝7.4，4℃充分透析，然后加入用0.002M PBS，PH＝7.4平衡好的親和柱，0.01MPBS，PH＝7.4洗去雜蛋白，0.2M EACA(6-氨基正己酸)/0.002M PBS，PH＝7.4洗脫，洗脫產物經0.002M PBS，PH＝7.4，4℃，2×24小時透析后凍存在-20℃。
SDS-PAGE電泳圖經凝膠圖像密度掃描表明，純化的重組融合蛋白K1-EN的純度到達92.3％。本發明保留進一步提高純度的可能。
5 12.8升發酵罐生產重組融合蛋白K1-EN在優化了的發酵條件下，重組融合蛋白K1-EN的表達量達到145mg/L。
6 MTT法測定重組融合蛋白K1-EN的生物活性將純化得到的重組融合蛋白K1-EN，分別以終濃度100，50，25ng/ml加入豬髖動脈內皮細胞(PIEC)培養液中，用MTT比色分析法測定K1-EN蛋白對PIEC細胞生長的抑制率。圖2的抑制率曲線表明K1-EN能抑制豬髖動脈內皮細胞的生長，ID50≈85ng/ml。
7 重組菌株的遺傳穩定性將重組酵母菌pPICZαA-K1-EN/GS115傳代10次以上后，PCR分析表明目的基因仍穩定地整合在染色體上，SDS-PAGE結果說明目的蛋白仍然表達，Bradford法測定和凝膠圖像密度掃描證實目的蛋白的表達量基本維持不變。
重組融合基因K1-EN的核苷酸序列為GTGTATCTCTCAGAGTGCAAGACTGGGAATGGAAAGAACTACAGAGGGACGATGTCCAAAACAAAAAATGGCATCACCTGTCAAAAATGGAGTTCCACTTCTCCCCACAGACCTAGATTCTCACCTGCTACACACCCCTCAGAGGGACTGGAGGAGAACTACTGCAGGAATCCAGACAACGATCCGCAGGGGCCCTGGTGCTATACTACTGATCCAGAAAAGAGATATGACTACTGCGACATTCTTGAGTGTGAAGAGGAAGGTGGCGGTACCCACAGCCACCGCGACTTCCAGCCGGTGCTCCACCTGGTTGCGCTCAACAGCCCCCTGTCAGGCGGCATGCGGGGCATCCGCGGGGCCGACTTCCAGTGCTTCCAGCAGGCGCGGGCCGTGGGGCTGGCGGGCACCTTCCGCGCCTTCCTGTCCTCGCGCCTGCAGGACCTGTACAGCATCGTGCGCCGTGCCGACCGCGCAGCCGTGCCCATCGTCAACCTCAAGGACGAGCTGCTGTTTCCCAGCTGGGAGGCTCTGTTCTCAGGCTCTGAGGGTCCGCTGAAGCCCGGGGCACGCATCTTCTCCTTTGACGGCAAGGACGTCCTGAGGCACCCCACCTGGCCCCAGAAGAGCGTGTGGCATGGCTCGGACCCCAACGGGCGCAGGCTGACCGAGAGCTACTGTGAGACGTGGCGGACGGAGGCTCCCTCGGCCACGGGCCAGGCCTCCTCGCTGCTGGGGGGCAGGCTCCTGGGGCAGAGTGCCGCGAGCTGCCATCACGCCTACATCGTGCTCTGCATTGAGAACAGCTTCATGACTGCCTCCAAG最終獲得的重組融合蛋白K1-EN的氨基酸序列為VYLSECKTGNGKNYRGTMSKTKNGITCQKWSSTSPHRPRFSPATHPSEGLEENYCRNPDNDPQGPWCYTTDPE
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權利要求
1.一種基因重組融合蛋白K1-EN的制備方法，其特征在于該方法，包括以下步驟a.重組質粒pPICZαA-K1-EN的構建重組質粒pPICZαA-K1-EN包括2個功能域片段和1段連接臂，2個功能域片段分別是K1基因和EN基因；1段連接臂是連接K1基因和EN基因的柔性連接臂(Gly)3；b.重組酵母基因工程菌pPICZαA-K1-EN/GS115的構建；c.重組融合蛋白K1-EN的表達；d.重組融合蛋白K1-EN的純化。
2.根據權利要求1所述的基因重組融合蛋白K1-EN的制備方法，其特征在于所述的重組質粒pPICZαA-K1的構建方法為根據K1的核苷酸序列設計K1的上下游引物上游引物5’-GGG GAA TTC GTG TAT CTC TCA GAG-3’；下游引物5’-TTT GGT ACC GCC ACC TTC CTC TTC ACA C-3’。在K1的下游引物中引入連接臂(Gly)3的核苷酸序列，用來連接K1基因和EN基因。以K1的cDNA為模板，通過PCR直接得到約300bp的COOH端帶有連接臂(Gly)3的K1片段。回收純化擴增產物。K1片段用EcoRI和Kpn I雙酶切后插入質粒pPICZαA的EcoRI/Kpn I之間，構成重組質粒pPICZαA-K1。轉化大腸桿菌TOP10F’，挑選出抗Zeocin的陽性克隆。
3.根據權利要求1所述的基因重組融合蛋白K1-EN的制備方法，其特征在于所述的重組質粒pPICZαA-K1-EN的構建方法為根據EN的核苷酸序列設計EN的上下游引物上游引物5’-TTT GAA TTC CAC AGC CAC CGC GAC TTC-3’；下游引物5’-TTC GCG GCC GCT CAT TAC TTG GAG GCA-3’。以EN的cDNA為模板進行PCR擴增，得到約560bp的EN基因。EN片段用Kpn I和NotI雙酶切后插入重組質粒pPICZαA-K1的Kpn I/NotI之間，構成重組質粒pPICZαA-K1-EN。轉化大腸桿菌TOP10F’，挑選出抗Zeocin的陽性克隆。
4.根據權利要求1所述的基因重組融合蛋白K1-EN的制備方法，其特征在于所述的重組酵母基因工程菌pPICZαA-K1-EN/GS115的構建的方法為重組質粒pPICZαA-K1-EN用Sac I線性化后，電擊轉化畢赤酵母GS115，點擊參數為700V，5ms，將電擊后的混合液涂布在Zeocin濃度分別為100，250，500和1000ug/ml的YPDS平板上，30℃培養2～4天，待克隆長出。
5.根據權利要求1所述的基因重組融合蛋白K1-EN的制備方法，其特征在于所述的重組融合蛋白K1-EN的表達方法為將重組酵母接種在BMGY中，振蕩培養使菌增殖至O.D.＝5～6，離心收集菌體，將菌體重懸在BMMY中，使其O.D.值達到5.0，在28℃下進行甲醇誘導。每隔24小時補加甲醇至甲醇終濃度為1.0％，發酵至第96小時時停止發酵，收獲蛋白。
6.根據權利要求1所述的基因重組融合蛋白K1-EN的制備方法，其特征在于所述的重組融合蛋白K1-EN的純化為用環氧氯丙烷法制備Sepharose-4B-Lys親和柱，發酵上清液首先用0.002M PBS，PH＝7.4，4℃充分透析，然后加入用0.002M PBS，PH＝7.4平衡好的親和柱，0.01M PBS，PH＝7.4洗去雜蛋白，0.2M EACA(6-氨基正己酸)/0.002M PBS，PH＝7.4洗脫，洗脫產物經0.002M PBS，PH＝7.4，4℃，2×24小時透析后凍存在-20℃。
全文摘要
本發明涉及一種基因重組融合蛋白K1－EN的制備方法。該方法包括以下步驟重組質粒pPICZαA－K1－EN的構建、重組酵母基因工程菌pPICZαA－K1－EN/ GS115的構建、重組融合蛋白K1－EN的表達、重組融合蛋白K1－EN的純化。畢赤酵母是真核表達系統，能以甲醇為唯一碳源，pPICZαA是分泌型表達質粒，含有醇氧化酶的強啟動子(P
文檔編號C07K1/00GK1896245SQ20061002620
公開日2007年1月17日 申請日期2006年4月28日 優先權日2006年4月28日
發明者黃筱穎, 陳宇光 申請人:上海大學