一種嵌合Fc受體的融合蛋白及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種新型重組融合蛋白及其制備方法和應用，特別涉及一種嵌合了 Fc 受體的重組融合蛋白及其制備方法和應用。
【背景技術】
[0002] 腫瘤尤其是惡性腫瘤是當今世界嚴重危害人類健康的疾病，在各種疾病所致死亡 中高居第二位。而且近年來，其發病率呈明顯上升趨勢。惡性腫瘤治療效果差，晚期轉移率 高，預后多不佳。目前臨床上所采用的常規治療方法如放、化療和手術治療雖然在很大程 度上緩解了病痛，延長了生存時間，但這些方法均存在很大的局限性，其療效難以進一步提 尚。
[0003] 大量研究表明，腫瘤在形成過程中，可通過多重機制，逃避免疫系統的監視，我們 將這一過程稱之為腫瘤組織的免疫逃逸或免疫編輯。T細胞在腫瘤免疫的過程中處于核心 地位，如果能調動體內的殺傷武器，將是非常有效且安全的治療策略。T細胞的活化啟動和 效應發揮的過程中至少需要兩種信號存在，第一種信號是抗原特異性的，由主要組織相容 性復合體（Major histocompatibility complex，MHC)以及與其結合的抗原肽被T細胞受 體（T cell reCeptor，TCR)識別并結合后，由TCR復合物向T細胞內傳導激活信號；第二種 激活信號是抗原非特異性的，是由抗原遞呈細胞（antigen presenting cell，APC)和T細 胞上多種輔助分子之間的配對和相互作用而提供的，能夠提供第二種激活信號的一類T細 胞膜蛋白又被稱為共刺激分子，在T細胞活化中發揮重要作用。
[0004] 隨著腫瘤免疫學理論和技術的發展，免疫治療在腫瘤治療中的作用日益受到重 視。T淋巴細胞在腫瘤免疫應答中起主要作用，包括CIK(cytokine_induced killer)細 胞治療在內的T細胞過繼性細胞免疫治療雖然在部分腫瘤中取得了一定的效果，但在大多 數腫瘤中療效尚不能令人滿意。近年來發展的利用基因改造技術表達腫瘤特異性嵌合抗 原受體（chimeric antigen receptor，CAR)的T細胞顯示出持久的革巴向殺傷活性，為過繼 性細胞免疫治療注入了新的解決方案。CAR是將識別腫瘤相關抗原的ScFv(single-chain variable fragment，ScFv)單鏈抗體、跨膜區和能誘導T細胞活化的信號轉導結構域在體 外進行基因重組，形成重組質粒，在體外通過慢病毒轉染技術轉染經純化和大規模擴增后 的Τ細胞，穩定表達CAR的Τ細胞稱之為CAR-T細胞。這種基因改造也可幫助Τ細胞直接 識別腫瘤而不必要求通過TCR來識別MHC-抗原肽的限制性。臨床前和臨床研究均顯示 (Cancer Res 2010;70:9053-9061 ;Sci Transl Med 3,95ra73)，CAR-Τ 在體外及體內均有 對特定腫瘤抗原的高度親和性及對抗原負荷細胞的高效殺傷性。
[0005] CAR-Τ細胞較其他基于T細胞的治療方式存在以下優勢：①使用患者自體細胞，降 低排異反應風險；②鑒于很多腫瘤細胞表達相同的腫瘤抗原，針對某一種腫瘤抗原的CAR 基因構建一旦完成，便可以被廣泛利用；③CAR既可以利用腫瘤蛋白質抗原，又可利用糖 脂類非蛋白質抗原，擴大了腫瘤抗原靶點范圍；④CAR-Τ細胞作用過程不受MHC的限制； ⑤CAR-Τ細胞具有免疫記憶功能，可以長期在體內存活。
[0006] 通常情況下，CAR包含一個用來識別腫瘤細胞表面抗原的胞外結構域，一個保證 抗原識別域具有一定自由度鉸鏈區，一個跨膜結構域，以及一個或幾個串聯的胞內結構域/ 模體（motif)用以觸發能導致T細胞活化的下游信號（Leukemia (2004) 18, 676 - 684)。大多 數CAR的抗原識別域是一種ScFv單鏈抗體，整合了單克隆抗體重鏈和輕鏈的可變區。許多 CAR的識別域來自抗體可變區，這可能被宿主的免疫系統識別并導致抗可變區片段的免疫 反應，這有可能限制體內過繼性T細胞的持久性。最初CAR的胞內信號轉導結構域/模體一 般僅含有CD3 ζ結構域，往往不能有效誘導T細胞的活化，但經過近十年的發展，新一代融 合了多種免疫共刺激分子（如CD28和4-1ΒΒ等）信號轉導結構域的CAR能夠充分誘導過繼 性T淋巴細胞的增殖和效應活性（Molecular Therapy νο?. 17ηο· 8, 1453 - 1464aug. 2009)。 CD28分子在調節淋巴細胞生存和增殖方面有著重要作用，也對的效應功能和細胞記憶的建 立起著關鍵作用；這些作用的產生是由于募集如PI3K，Grb2和Lck之類的信號轉導分子， 這些分子反過來調節關鍵轉錄因子如NF- κ B的活性，進而增加 IL-2和INF- γ的合成和分 泌。TNF受體超家族，如4-1ΒΒ，也為維持Τ細胞應答提供共刺激信號，在Τ細胞生存和⑶8+Τ 細胞的記憶維持中發揮關鍵作用；這類受體通過招募腫瘤壞死因子受體相關因子-1/2 (TNF receptor-associated factor 1/2，TRAF1)和下游的銜接子，激活下游的ΜΑΡΚ和NF-κΒ信 號途徑。
[0007] 尋找完美的信號組合時，除了增加共刺激結構域，目前還有其他一些方法用于增 加 CARS的抗腫瘤活性。在最近的一項研究中，經基因改造的T細胞表達含⑶28和⑶3 ζ 結構域的CARs并產生IL-15 ( -種對Τ淋巴細胞穩態和生存至關重要的細胞因子），這一組 合將使T淋巴細胞在體內和體外具有較高的生存能力和增殖潛能，以及體內更高效的抗腫 瘤活性。另外，過繼性T淋巴細胞還可被修飾使其可誘導表達自殺基因 iCasp9以限制其增 殖和毒性，因為這些刺激信號的結合可以造成危險的無法控制的過度增殖。
[0008] 最初的CAR用總的T淋巴細胞作為基因轉化的靶細胞。然而，最近研究顯示，中央 記憶性T細胞（central memory T cells)這一亞群更適合進行CAR轉移，它們在體內具有 更持久性且更高效的抗腫瘤活性。除了利用T淋巴細胞外，一些研究者提出利用其它淋巴 細胞群進行CAR修飾。例如，NK細胞經過CAR修飾后，對靶細胞表現出高的細胞毒性。
[0009] 重度免疫缺陷小鼠（N0D/Shi-scid/IL-2Rynull，N0G)是體內檢測CARs修飾淋巴 細胞最常用的動物模型。這種小鼠沒有成熟的T和B淋巴細胞，允許接種人細胞（腫瘤細 胞或淋巴細胞）到體內而沒有明顯的排斥反應。
[0010] FcR為一類能結合免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig)可結晶段（fragment crystallizable，Fc)的受體，在免疫調節過程中發揮重要作用。人Ig根據其重鏈的差異可 分為IgM、IgG、IgA、IgD和IgE五類，各類Ig的功能差異主要與其Fc段結構有關。機體內 許多細胞表面表達不同類Ig的Fc受體，通過Fc受體與Fc的結合，參與Ig介導的生理功 能或病理損傷過程。目前已鑒定明確屬于簇分化抗原（cluster of differentiation，CD) 的Fc受體有Fc γ R、Fc a R、Fc ε R，它們分別可以結合IgG、IgA和IgE。
[0011] 小鼠 FcyR 有四種，分別為 FcyRI、FcyRIIB、FcyRIII 和 FcyRIV。FcyR 很 保守，相應的人類蛋白為 Fc γ RIA(CD64)、Fc γ RIIA(CD32A)、Fc γ RIIB (CD32B)、Fc γ RIIC、 FcyRIIIA(CD16A)和FcyRIIIB(CD16B)。從結構上說，FcR及其配體都屬于一個免疫球 蛋白的大家族。大多數Fey R都有兩個胞外結構域，而Fey RI有三個。按照它們與配體 結合的親和力不同，FcyR又可大致分為高親和力和低親和力受體；按照它們的功能差異， Fc γ R可大致分為激活性和抑制性受體。小鼠和人的Fc γ R中，Fc γ RI均為唯一高親和力 受體，而其它均為低親和力受體。信號通路方面，小鼠和人的Fc γ RIIB結合相應配體后可 以轉導抑制性信號，其它Fc γ R -般在配體結合后轉導激活性信號。
[0012] CAR-T細胞技術在美國已獲得III期臨床研究許可。目前，重大產業項目部門致 力于CAR技術的前期技術轉化及與現有CIK-Prominent技術的產業整合研究。在此，我們 將常規CAR識別腫瘤相關抗原的ScFv置換成Fc γ R的Fc結合結構域，構建了一類新型嵌 合Fc受體，轉染這類受體的T細胞與腫瘤特異性抗體組合使用，在體外對表達特定抗原的 腫瘤細胞具有很高的殺傷效能，在體內也有很好的抑制腫瘤生長的作用。

【發明內容】

[0013] 本發明的目的在于提供一種全新的嵌合了 Fc受體的融合蛋白及其制備方法和應 用，該融合蛋白能與Ig結合并誘導T細胞活化從而實現抗腫瘤的作用。
[0014] 本發明的第一方面，提供了一種嵌合Fc受體的融合蛋白，所述融合蛋白的氨基酸 序列為 SEQ ID N0 :2 或 SEQ ID N0 :4。
[0015] 本發明的第二方面，提供了一種編碼本發明第一方面所述融合蛋白的核苷酸序 列，編碼氨基酸序列SEQ ID N0:2的核苷酸序列為SEQ ID NO: 1;編碼氨基酸序列