可溯源性非熒光標記大腸桿菌及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物工程技術領域，具體涉及一種可溯源性非熒光標記大腸桿菌及其 制備方法。
【背景技術】
[0002] 大腸桿菌（Escherichiacoli，E.coli)作為一種模式生物，其一個重要方面是可 以通過改造后作為宿主菌生產各種有用的產品，比如燃料、蛋白質和聚合物等等。早先大腸 桿菌改造方面，比如有非必需基因敲除技術、內源性或外源性基因高效表達技術等。其中， 內源性或外源性基因高效表達技術多借助于質粒這一工具，通過質粒將目的基因重組并導 入表達，具有操作方便、表達可控等等優點。但是該方法一方面由于拷貝數和質粒自身攜帶 的多種其他DNA，使得增加宿主菌的代謝負擔，從而影響宿主生長；另一方面是質粒在宿主 菌中的維持都需要使用相應抗生素，從而增加了該抗性特點向環境中其他微生物傳播的風 險。
[0003] 因此，在上述基礎上，為了避免上述缺陷在大腸桿菌基因組工程改造方面，現常采 用轉座子的基因插入技術。但是該方法插入過程中，由于轉座子介導的基因插入具有隨機 性常導致插入位點無法控制，所以需要進行特異位點導向的基因插入技術多借助于λ噬 菌體的重組酶（Red系統）實現，它們由gam、bet和eX〇編碼。該系統具有的優點之一是基 因插入位點可以自由選擇，將Red系統和一些條件型質粒（如溫度敏感性質粒）結合使用， 可實現除了在基因組中插入目標基因外不留下其他任何痕跡的目的，從而最大限度地降低 了其他外源基因對宿主菌的影響。而且該插入和標記改造方法有利于后續的跟蹤溯源。

【發明內容】

[0004] 本發明實施例的目的在于克服現有技術的上述不足，提供一種在大大降低對宿主 影響的條件下，準確實現基因插入并方便后續跟蹤溯源的可溯源性非熒光標記動大腸桿菌 及其制備方法。
[0005] 為了實現上述發明目的，本發明實施例的技術方案如下：
[0006] -種可溯源性非熒光標記大腸桿菌的制備方法，包括如下步驟：
[0007] 以pKD4為模板，通過pKD4擴增引物PCR擴增，得到含有與待改造大腸桿菌manX 基因同源序列的FRTcassette產物；其中所述pKD4擴增引物包括上游引物HP1和下游引 物HP2 ;所述上游引物HP1具有序列表SEQ.ID.No. 1的堿基序列，所述下游引物HP2具有序 列表SEQ.ID.No. 2的喊基序列；
[0008] 將pKD78質粒轉入待改造大腸桿菌中，獲得含有pKD78質粒的大腸桿菌；
[0009] 將所述FRTcassette產物轉入含有PKD78質粒的大腸桿菌中進行定點重組，形成 重組大腸桿菌；
[0010] 通過自殺質粒pCP20敲除所述重組大腸桿菌染色體FRTcassette中的卡那霉素 抗性基因。 toon] 本發明進一步還提出根據上述方法制備得到的可溯源性非熒光標記大腸桿菌。
[0012] 本發明改造后的大腸桿菌最終大腸桿菌的基因組中只在定點位置留下了一個不 多于50個核苷酸的FRT痕跡，大大降低了插入序列對宿主菌的影響，并且不會改變置入宿 主后導致抗性特點的傳播，并且該FRT痕跡能方便后續該改造菌株的跟蹤溯源。
【附圖說明】
[0013] 下面將結合附圖及實施例對本發明作進一步說明，附圖中：
[0014] 圖1為本發明可溯源性非熒光標記大腸桿菌的制備方法示意圖；
[0015] 圖2為本發明驗證FRTcassette是否插入大腸桿菌的電泳圖；
[0016] 圖3為本發明驗證FRTcassette是否插入大腸桿菌manX基因位點的電泳圖；
[0017] 圖4為本發明驗證FRTcassette中的卡那霉素抗性基因是否被敲除的電泳圖；
[0018] 圖5為本發明驗證卡那霉素抗性基因被敲除后大腸桿菌基因中FRT遺留痕跡的電 泳圖。
【具體實施方式】
[0019] 為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合附圖及實施例，對 本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，并 不用于限定本發明。
[0020] 本發明實施例提供一種可溯源性非熒光標記大腸桿菌的制備方法，方法示意圖參 見圖1，包括如下步驟：
[0021] S10,以pKD4為模板，通過pKD4擴增引物PCR擴增出含有與manX基因同源序列的 FRTcassette產物；
[0022] S20,將pKD78質粒轉入待改造大腸桿菌中，獲得含有pKD78質粒的大腸桿菌；
[0023]S30,將FRTcassette產物轉入含有pKD78質粒的大腸桿菌中與大腸桿菌的染色 體進行定點重組，形成重組大腸桿菌；
[0024]S40,通過自殺質粒pCP20去除重組大腸桿菌染色體FRTcassette中的卡那霉素 抗性基因，即得到本發明可溯源性非熒光標記大腸桿菌。
[0025] 其中在上述步驟S10中，pKD4擴增引物包括上游引物HP1和下游引物HP2 ;
[0026] 其中上游引物HP1具有序列表SEQ.ID.No.1的堿基序列，下游引物HP2具有序列 表SEQ.ID.No.2的喊基序列；
[0029] 其中上游引物HP1和下游引物HP2設計基于大腸桿菌E.coli基因組中manX基因 序列（參見序列表SEQ.ID.No. 3的堿基序列），以pKD4中的FRTcassette序列（參見序 列表SEQ.ID.No.9的堿基序列）為模板，通過上述上游引物HP1和下游引物HP2擴增得到 的FRTcassette在序列的兩端引入了manX基因同源序列，因此便可以在之后的步驟中實 現定點植入。
[0030] 進一步在步驟S30中將上述擴增出具有manX基因同源序列的FRTcassette產物 導入大腸桿菌中進行定點重組。并且在該過程中大腸桿菌受體為步驟S20轉化后獲得的含 有PKD78質粒的大腸桿菌；步驟S30的完成其是基于pKD78質粒協助完成，因為pKD78質粒 自身可以表達與λ噬菌體等同的Red系統重組酶；Red重組系統由三種蛋白組成：Exo蛋白 是一種核酸外切酶，結合在雙鏈DNA的末端，從5'端向3'端降解DNA，產生3'突出端；Beta 蛋白結合在單鏈DNA上，介導互補單鏈DNA退火；Gam蛋白可與RecBCD酶結合，抑制其降解 外源DNA的活性。該Red系統重組酶系統的特點是可以識別同源序列，并在同源序列位置 進行外源DNA的插入重組。因此，在上述步驟S10中通過上述引物擴增出的manX基因同源 序列的FRTcassette產物便可以在大腸桿菌特定manX基因的位點植入FRTcassette,定 點植入后與manX基因形成的序列參見序列表SEQ.ID.No. 10。
[0031] 進一步在步驟S40中，采用自殺質粒pCP20去除重組大腸桿菌染色體FRT cassette中的卡那霉素抗性基因；該自殺質粒pCP20的特點在于可以表達翻轉酶并能特異 性識別FRT序列，并在宿主中將識別位點之后的一段抗性基因敲除。因此在本發明中于該 步驟S40中采用該自殺質粒pCP20去除重組后大腸桿菌染色體FRTcassette中的卡拉霉 素抗性基因，在最終大腸桿菌的基因組中只留下了一個不多于50個核苷酸的FRT痕跡，大 大降低了插入序列對宿主菌的影響，并且不會改變置入宿主后導致抗性特點的傳播，并且 由于該FRT痕跡能方便后續該改造菌株的跟蹤溯源。
[0032] 而其中，在上述實施過程中，除了上述主要步驟S10-S40之外，在實際操作中，更 重要的還需要配套進行各階段的驗證步驟，因為每一個過程進行是否成功直接影響最終的 改造菌株的結果。而在這些步驟過程中，并不存在比較通用的檢驗方式，因此在本發明上述 步驟實施過程中按照下述方法補充進行，以保證過程的正確實施和目的改造菌株的正確獲 得。
[0033] 其中，在步驟S30之后，可以采用FRTcassette驗證引物進行PCR進行驗證FRT cassette是否準確插入到了大腸桿菌manX基因區域；其中FRTcassette驗證引物包括具 有序列表SEQ.ID.No. 4堿基序列的驗證引物1、具有序列表SEQ.ID.No. 5堿基序列的驗證引 物2、具有序列表SEQ.ID.No. 6堿基序