一種長效的重組人粒細胞集落刺激因子的及其制備方法和用圖
【技術領域】
[0001]本發明屬生物制藥技術領域，涉及人粒細胞集落刺激因子的重組融合蛋白，具體涉及一種長效的重組人粒細胞集落刺激因子及其制備方法和用途。本發明在保持人粒細胞集落刺激因子的原有活性的前提下，延長該蛋白質在體內的半衰期，進一步用于制備抗放化療或其他原因造成的中性粒細胞減少癥以及骨髓抑制的藥物。
【背景技術】
[0002]據報道，惡性腫瘤是當前嚴重影響人類健康、威脅人類生命的主要疾病之一。據統計，2007年全球有760萬人死于癌癥，其中有大約24%發生在中國，并呈現出逐步年輕化的趨勢。目前癌癥的治療仍以手術、放療和化療為主要治療手段，其中，放療和化療會大量殺傷人體正常的白細胞，造成病人骨髓抑制、免疫力低下，容易引發各種感染等并發癥。
[0003]研究顯示,重組人粒細胞集落刺激因子(Recombinant human granulocyte colonystimulating factor, rhG-CSF)與人體自身分泌的粒細胞集落刺激因子相似或相同，主要作用于中性粒細胞系造血細胞的增殖、分化和活化；能刺激骨髓造血祖細胞中中性粒細胞集落的形成，延長成熟中性粒細胞的存活時間(Roberts Aff.G-CSF.A key regulator ofneutrophil product1n, but that，，s not all ! Growth Factors.2005 ；23 (I): 33 - 41 ；Demetri GD, Griffin JD.Granulocyte colony stimulating factor and its receptor.Blood.1991 ;78(II):2791-2808 ;DeJesus CE,Egen J,Metzger M, et al.Transientneutropenia after granulocyte-colony stimulating factor administrat1n isassociated with neutrophil accumulat1n in pulmonary vasculature.ExperimentalHematology.2011 ；39(2): 142-150.)，臨床上主要用于治療腫瘤化療后的中性粒細胞減少癥等疾病，其應用量巨大。目前國內主要銷售的該類藥物有:瑞白，惠爾血等，至2010年，該類藥物的銷售額已經達到近10億元。但臨床實踐顯示，該類藥物在體內半衰期較短，通常只有 4-6 小時(Yoshida Tl, Nakamura S，Ohtake S, Okafuji K, Kobayashi K, Kondo K, KannoM, Matano S，Matsuda T, Kanai M, et al.Effect of granulocyte colony-stimulatingfactor on neutropenia due to chemotherapy for non-Hodgkin’s lymphoma.Cancer.1990 ;66 (9): 1904-9.)，因此，患者需要每天注射以維持藥效，病人耐受較差。
[0004]有研究公開了對重組人粒細胞集落刺激因子的長效化改造中，制備了聚乙二醇修飾的重組人粒細胞集落刺激因子，其中，長效重組人粒細胞集落刺激因子產品Neulasta (pegfilgrastim)是PEG化的G-CSF,于2002年被美國FDA批準上市；所述Neulasta在體內半衰期和藥效方面顯示了其較同類產品有較明顯的提升，患者只需在每次化療前注射一次即可在化療中保持原本的粒細胞水平，極大地減少了患者的痛苦；目前，該藥物價格昂貴，每支售價5000美元，國內尚無該進口藥，在研的G-CSF-Fc等融合蛋白類藥物尚處于臨床或臨床前階段。
[0005]CTP (Carboxyl-Terminal Peptide of Human Chor1nicGonadotropin β -Subunit)是由人域毛膜促性腺激素(hCG) β亞基端118位到145位的氨基酸所組成的短肽。研究發現，hCG的體內半衰期相比其他生長激素類的要長，而HCG的β亞基C端的CTP在其中起了相當重要的作用(Bouloux PM, Handelsman DJj Jockenh velF，et al.First human exposure to FSH-CTP in hypogonadotrophic hypogonadal males.Human reproduct1n.2001；16(8):1592-1597 ；Duijkers IJ，Klipping C，BoerrigterPJj et al.Single dose pharmacokinetics and effects on follicular growth andserum hormones of a long-acting recombinant FSH preparat1n (FSH-CTP) in healthypituitary-suppressed females.Human reproduct1n.2002 ； 17(8):1987-1993 ；MatzukMM，Hsueh AJ，Lapolt P，et al.The b1logical role of the carboxyl-terminalextens1n of human chor1nic gonadotropin [corrected]beta-subunit.Endocrinology.1990 ；126(1): 376-383.)，表明CTP融合蛋白可能比野生型蛋白質具有更長的半衰期。還有研究對CTP-FSH(卵泡刺激素)CTP-TSH0 (促甲狀腺激素)研究發現(Fares FAj Suganuma N，Nishimori K，et al.Design of a long-acting follitropinagonist by fusing the Cterminal sequence of the chor1nic gonadotropinβ -subunit to the follitropin β -subunit.Proc Natl Acad Sci USA 1992 ；89 (10):4304 - 4308 ；LaPolt PSj Nishimori Kj Fares FAj Perlas E，Boime I，Hsueh AJff.Enhanced stimulat1n of follicle maturat1n and ovulatory potential by longacting follicle-stimulating hormone agonists with extended carboxyl-terminalpeptides.Endocrinology.1992 ; 131 (6):2514 - 2520)，CTP-hCG a (Furuhashi M，ShikoneT，Fares FA，Sugahara T，Hsueh AJ，Boime 1.Fusing the carboxy-terminal peptide ofthe chor1nic gonadotropin (CG) β-subunit to the common β-subunit:retent1n ofOlinked glycosylat1n and enhanced in vivo b1activity of chimeric human CG.MolEndocrinol.1995 ；9 (I):54 - 63)，(Joshi L，Murata Y，Wondisford FE，SzkudlinskiMWj Desai R，Weintraub BD.Recombinant thyrotropin containing a β -subunit chimerawith the human chor1nic gonadotropin-β carboxy terminus is b1logicallyactive, with a prolonged plasma half_life:role of carbohydrate in b1activityand metabolic clearance.Endocrinology.1995 ；136 (9):3839 - 3848)，重組CTP 融合蛋白的生物活性及其它性質和野生型蛋白質相比幾乎沒有差異，但是半衰期則相對要長得多；證明了重組CTP融合蛋白不但具有良好的生物學活性，而且還具有較長的體內半衰期。
[0006]目前延長蛋白半衰期的方法主要是利用PEG進行化學修飾，其優點是反應簡單，能顯著地增加被修飾蛋白質的體內半衰期；其缺點是修飾后蛋白分子量急劇增加，不利于體內代謝；化學修飾物多為異源物質，經常使用可能會引起人體的免疫應答；而且化學修飾后會使原有蛋白質的生物活性明顯降低，一般僅為修飾前的10% ;另外化學修飾的最終產物需要多進行一次純化，得率相對較低，而且修飾劑本身價格不菲，生產成本相對較高。
[0007]基于上述現狀，本申請的發明人擬提供一種長效的重組人粒細胞集落刺激因子的及其制備方法和用途，使制得的人粒細胞集落刺激因子的重組融合蛋白保持人粒細胞集落刺激因子