發酵生產咖啡堿的工程菌、其構建方法及應用
【專利摘要】本發明提供一種發酵生產咖啡堿的工程菌，所述工程菌是通過將咖啡堿生物合成途徑中的關鍵酶基因導入谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)構建而成的重組谷氨酸棒狀桿菌。本發明通過過量表達咖啡堿合成途徑中的關鍵酶基因，使谷氨酸棒狀桿菌具備生產咖啡堿的能力，且產物咖啡堿能夠大量分泌到胞外，分離純化步驟少，咖啡堿的得率高，搖瓶發酵結果顯示，咖啡堿的產量達3.75mg/L，表明該重組工程菌具有良好的工業應用前景，為利用谷氨酸棒狀桿菌發酵生產食品安全級咖啡堿奠定了理論基礎。
【專利說明】
發酵生產咖啡堿的工程菌、其構建方法及應用
技術領域
[0001] 本發明涉及基因工程及微生物發酵領域，具體地說，涉及一種發酵生產咖啡堿的 工程菌、其構建方法及應用。
【背景技術】
[0002] 咖啡堿即1，3，7-三甲基黃嘌呤，是風靡世界的三大軟飲料植物（茶樹、咖啡和可 可）中嘌呤堿的主體成份。研究發現，世界上至少60多種植物含有咖啡堿，含量比較高的有 茶（Camellia sinensis)2%_5%、咖啡豆（Coffea arabica) 1 %_2%、可可（Theabronma cacao)0.03%、蘇丹可樂果（Cola acuminata)l .5%、爪拉拿泡林藤（Paullinia capana) 4% 以上、巴拉圭茶（Ilex paraguariensis)0 · 7%等。
[0003] 咖啡堿作為一種重要的植物次級代謝產物，具有抗菌、抵御生物入侵等生理作用， 對富含咖啡堿的植物的生長而言，咖啡堿是不可或缺的一種物質。同時，咖啡堿作為一種甲 基黃嘌呤衍生物，對人體的基本功能是對腺嘌呤受體的競爭性拮抗作用。咖啡堿對人體中 樞神經系統有較強的興奮作用，適量攝入能夠改善思維活動，振奮神經，消除和抵抗疲勞 等。咖啡堿還具有增強肌體免疫功能，解熱鎮痛，強心利尿等多種藥理功能，因此被廣泛用 于復方阿司匹林、復方感冒藥等多種藥品和多種可樂型飲料工業中，是貴重的藥物原料和 飲料、食品添加劑。國際市場上咖啡堿的價格達到25美元/公斤左右，且供應市場主要為西 方少數大企業壟斷控制。
[0004] 目前，市售咖啡堿的制備方法主要包括人工合成法、傳統溶劑萃取法、升華法和沉 淀法及新技術柱層析、微波萃取和超臨界流體萃取法等。其中化學合成方法最為常見，但存 在工藝繁瑣、附加產物多，產品純度低及毒害有機物質殘留弊端，有些歐美國家在法律中明 文禁止將化學合成的咖啡堿添加到食品飲料中。超臨界CO 2萃取法因具備良好的選擇性、萃 取效率高、產品純度高等優點而成為從茶葉中提取"天然咖啡堿"的主流技術。但是此方法 存在設備價格昂貴，生產成本相對較高等弊端。
[0005] 基于以上現狀，采用生物工程技術手段，通過構建重組工程菌，利用微生物體外發 酵生產咖啡堿成為制備天然咖啡堿的發展趨勢，具有廣闊的應用前景。而使原本不具備咖 啡堿代謝途徑的微生物能夠大量合成咖啡堿，提高咖啡堿的產量，需要對受體菌的生物合 成途徑進行改造。最常用的方法是將咖啡堿生物合成中關鍵酶基因連接到合適的表達載體 上，再導入到微生物中，使這些基因能夠在微生物體內實現過量表達。
[0006] 谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)是呈短桿狀的非致病土壤細菌， 具有過量合成多種氨基酸的能力，被稱作食品級安全菌，其全基因組測序工作已完成。近年 來利用谷氨酸棒狀桿菌來發酵生產已清楚合成路徑的生化物質的成功案例越來越多。目前 為止，尚未發現任何利用谷氨酸棒狀桿菌發酵生產咖啡堿的報道。

【發明內容】

[0007] 本發明的目的是提供一種發酵生產咖啡堿的工程菌，特別是一種產咖啡堿的重組 谷氨酸棒狀桿菌工程菌。
[0008] 具體策略為通過在谷氨酸棒狀桿菌中過表達咖啡堿生物合成核心途徑中的關鍵 基因，實現利用工程菌發酵生產咖啡堿的目的。
[0009] 為了實現本發明目的，本發明提供的發酵生產咖啡堿的工程菌，所述工程菌是通 過將咖啡堿生物合成途徑中的關鍵酶基因導入谷氨酸棒狀桿菌構建而成的重組谷氨酸棒 狀桿菌，所述關鍵酶基因包括CaXMT (7-黃嘌呤核苷甲基轉移酶)基因、TCS1 (茶樹咖啡堿合 成酶)基因、TAMPD(AMP脫氨酶)和TIDHaMP脫氫酶)基因。
[0010] 優選地，所述關鍵酶基因為來源于茶樹的TCSl基因、TAMPD基因、TIDH基因和來源 于咖啡果的CaXMT基因。
[0011] 更優選地，通過將所述關鍵酶基因全部構建到同一穿梭表達載體PZ8-1上，然后導 入谷氨酸棒狀桿菌(ATCC 13032)中得到重組菌。
[0012] 本發明還提供所述工程菌的構建方法，將咖啡堿生物合成途徑中的關鍵酶基因構 建到原核表達載體上，然后導入谷氨酸棒狀桿菌中，篩選陽性克隆。
[0013] 前述的方法，將CaXMT基因、TCSl基因、TAMH)基因和TIDH基因構建到同一穿梭表達 載體PZ8-1上，然后導入谷氨酸棒狀桿菌ATCC 13032中，篩選陽性克隆。
[0014] 在本發明的一個【具體實施方式】中，根據谷氨酸棒狀桿菌的密碼子使用頻率，對全 部四個目的基因的序列進行密碼子優化，再于目的基因序列前面各設計一段RBS序列。最終 構建得到含有啟動子、核糖體結合位點(RBS序列）、操縱子和終止子四大表達元件以及優化 的全部四個目的基因序列的表達盒（SEQ ID NO: 1)，然后將上述表達盒連接到載體pZ8-l 上，然后導入谷氨酸棒狀桿菌中得到重組菌。
[0015] 本發明進一步提供所述工程菌在發酵生產咖啡堿中的應用。
[0016] 所述應用是在發酵培養過程中，向發酵液中添加一定濃度的磷酸腺苷(AMP)，進行 發酵生產咖啡堿。
[0017] 所用發酵培養基配方為：（NH4)2S〇4 20g/L，K2HP〇4 lg/L，KH2P〇4 lg/L，MgS〇4.7H20 250mg/L，M0PS 42g/L，尿素5g/L，維生素 H 0 · 2mg/L，硫胺素500yg/L，微量元素0 · 2mg/L，葡 萄糖25g/L，pH值7.0-7.2。其中，微量元素的組成如下：FeS〇4 · 7H20 10g/L，MnS〇4 · 7H20 lOg/L,ZnSO4· 7H20 lg/L,CuSO4 0.2g/L,NiCl2· 6H2O 0.02g/L〇
[0018] 發酵條件為:250mL發酵罐內盛放50mL發酵液，于30 °C轉速200rpm的條件下進行發 酵。
[0019]前述的應用，發酵培養Sh后，向發酵液中添加終濃度為O.Hmg/mL的磷酸腺苷(優 選lmg/mL)，繼續振蕩培養120h。采用超高效液相色譜(UPLC)定量測定發酵產生的咖啡堿。
[0020] 咖啡堿樣品的制備：向4mL發酵液中加入等體積的乙酸乙酯或氯仿，充分振蕩并靜 置分層后，取有機層，30 °C真空離心干燥后，重懸于無菌水中，0.22μπτ2?|膜過濾后，濾液用于 UPLC檢測分析。
[0021] 本發明通過過量表達咖啡堿合成途徑中的關鍵酶基因，使谷氨酸棒狀桿菌具備生 產咖啡堿的能力，且產物咖啡堿能夠大量分泌到胞外，分離純化步驟少，咖啡堿的得率高， 搖瓶發酵結果顯示，咖啡堿的產量達到3.75mg/L，表明該重組工程菌具有良好的工業應用 前景，為利用谷氨酸棒狀桿菌發酵生產食品安全級咖啡堿奠定了理論基礎。
【附圖說明】
[0022]圖1為本發明實施例1中構建的重組表達載體的質粒圖譜。
[0023]圖2為本發明實施例2中重組谷氨酸棒狀桿菌工程菌的發酵液UPLC檢測結果。
【具體實施方式】
[0024]以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。若未特別指明，實施例 均按照常規實驗條件，如Sambrook等分子克隆實驗手冊（Sambrook J&Russell DW, Molecular Cloning:a Laboratory Manual ,2001)，或按照制造廠商說明書建議的條件。 [0025]以下實施例中所用的限制性內切酶、T4DNA連接酶、PCR試劑、In-f us ion試劑盒等 均購自TaKaRa生物公司，質粒提取試劑盒、膠回收試劑盒均購自Axygen公司，大腸桿菌感受 態細胞trans T1、DNA marker均購自北京全式金生物科技有限公司。所用引物由通用生物 公司合成，全基因合成由南京金斯瑞生物科技公司完成。
[0026] 實施例1產咖啡堿的谷氨酸棒狀桿菌重組工程菌的構建
[0027] 1、茶樹咖啡堿生物合成途徑中關鍵酶基因的克隆
[0028]本實施例中四個目的基因的原始序列來自于GenBank，其中基因 TAMPD登錄號為 AB480359963,基因 TIDH 登錄號為 AB156763654,基因 CaXMT 登錄號為 AB048793,基因 TCSl 登 錄號為AB031280。
[0029] 首先，為使插入的TAMPD、TIDH、CaXMT和TCSl基因能夠在谷氨酸棒狀桿菌中正常表 達，需構建含有啟動子、核糖體結合位點(RBS序列）、操縱子和終止子四大表達元件的表達 盒。同時，根據谷氨酸棒狀桿菌的密碼子使用頻率，對四個目的基因的序列進行密碼子優 化，再于四個目的基因序列前面各設計一段RBS序列。
[0030] 此外，為了使其定向插入表達載體PZ8-1中，分別在TAMPD基因序列的5'端加入 EcoRI酶切位點，在TIDH基因序列的3 '端加入BamHI酶切位點，在CaXMT基因序列的5 '端前加 入新的Ptac啟動子，Ptac序列的5'端加入BamHI酶切位點，在TCSl基因序列的3'端加入PstI 酶切位點。最后將優化后的基因片段交由南京金斯瑞生物科技公司人工合成。構建得到的 表達盒的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0031] 2、重組表達載體的構建
[0032] 純化后的表達盒，利用T4DNA連接酶將其與經EcoRI和PstI消化處理的表達質粒 PZ8-1在16°C水浴條件下過夜連接，并將連接液轉化至大腸桿菌感受態細胞trans Tl中，取 IOOyL轉化液涂布于含有50yg/mL卡那霉素的LB平板上，37°C培養箱中培養10-12h，并通過 菌落PCR篩選陽性單克隆，得到的陽性單克隆送公司測序，進一步驗證目的基因序列的正確 性，從而得到重組表達載體pZ8-TAMPD-TIDH-CaXMT-TCSl，質粒圖譜如圖1所示（即pZ8-A-B-C-D) 〇
[0033] 3、轉化宿主及重組工程菌的篩選
[0034] 利用化學方法制備C.glutamicum ATCC 13032感受態細胞，并將上述重組表達質 粒電轉化至C.glutamicum ATCC 13032感受態細胞中，取IOOyL轉化液涂布于含有25yg/mL 卡那霉素的LB平板上，30°C培養箱中培養36-48h至長出單菌落，并通過菌落PCR篩選目的重 組菌株。同時，為了排除表達載體PZ8-1的干擾，將不含有目的基因的空質粒pZ8-l也電轉入 ATCC 13032感受態細胞中作為對照組CK，最終成功構建得到重組工程菌C.glutamicum ATCC 13032/pZ8-TAMPD-TIDH-CaXMT-TCSl〇
[0035]實施例2重組谷氨酸棒狀桿菌發酵生產咖啡堿
[0036] 1、種子液的制備
[0037]所用種子培養基配方為：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，pH值7 · 0，121°C 高溫滅菌20min。
[0038] 種子液的制備方法:挑取活化后的新鮮重組工程菌接種于含有25yg/mL卡那霉素 的種子培養基中，30°C，200rpm條件下振蕩培養12h，即得種子液。
[0039] 2、重組谷氨酸棒狀桿菌的發酵培養
[0040] 所用發酵培養基配方為：（NH4)2S〇4 20g/L，K2HP〇4 lg/L，KH2P〇4 lg/L，MgS〇4 · 7H20 250mg/L，M0PS 42g/L，尿素 5g/L，維生素 H 0 · 2mg/L，硫胺素 500yg/L，微量元素 0 · 2mg/L，葡 萄糖25g/L，pH值7.0-7.2。其中，微量元素的組成如下：FeS〇4 · 7H20 10g/L，MnS〇4 · 7H20 lOg/L,ZnSO4· 7H20 lg/L,CuSO4 0.2g/L,NiCl2· 6H2O 0.02g/L〇
[0041] 發酵條件為:將上述種子液在4°C，6000rpm條件下冷凍離心收集菌體沉淀，并將所 有菌體沉淀接入盛放有50mL發酵培養基的250mL發酵罐內，于30°C轉速200rpm的條件下進 行發酵。
[0042]發酵培養8h后，即OD6(K)nm值為2.0-2.5時，向發酵液中添加終濃度為lmg/mL的磷酸 腺苷，繼續振蕩培養120h。
[0043]發酵結束后，采用超高效液相色譜(UPLC)定量測定發酵產生的咖啡堿。
[0044]咖啡堿樣品的制備：向4mL發酵液中加入等體積的乙酸乙酯或氯仿，充分振蕩并靜 置分層后，取有機層，30 °C真空離心干燥后，重懸于無菌水中，0.22μπτ2?|膜過濾后，濾液用于 UPLC檢測分析。
[0045] 儀器:Waters ACQUITY超高效液相色譜儀
[0046] 色譜柱：Phenomenex kinetex 2· 6μηι XB-C18 100A
[0047] 流動相:Α:0·2%乙酸水;Β:純乙腈
[0048] 梯度洗脫條件：0-8min，A:98%-90% ;8-10min，A:90%-75% ; 10-11.5min;
[0049] A：75% ；11.5min-14min,75%-98% ；14min-18min,A：98%
[0050] 色譜條件:流速，0.4mL/min;柱溫，30 °C ;進樣量，IOyL;紫外檢測波長，274nm。
[0051] 重組谷氨酸棒狀桿菌工程菌的發酵液UPLC檢測結果見圖2。其中，標準品是指黃嘌 呤核苷、7-甲基黃嘌呤、可可堿和咖啡堿四種標準品的UPLC檢測結果;樣品組是指重組谷氨 酸棒狀桿菌工程菌發酵液的UPLC檢測結果；對照組1是指含有空載體pZ8-l的出發菌株 C. glutamicum ATCC 13032發酵液的UPLC檢測結果；對照組2是指出發菌株C. glutamicum ATCC 13032發酵液的UPLC檢測結果。
[0052]搖瓶發酵結果顯示，重組工程菌中咖啡堿的產量達到3.75mg/L，而兩個對照組菌 株在整個發酵過程中均檢測不到咖啡堿的積累。本發明的重組谷氨酸棒狀桿菌工程菌適合 用于大規模工業化發酵生產咖啡堿，具有良好的應用前景。
[0053]雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述，但在 本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發明要求保護的范圍。
【主權項】
1. 發酵生產咖啡堿的工程菌，其特征在于，所述工程菌是通過將咖啡堿生物合成途徑 中的關鍵酶基因導入谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)構建而成的重組谷 氨酸棒狀桿菌，所述關鍵酶基因包括CaXMT基因、TCS1基因、TAMH)基因和TIDH基因。2. 根據權利要求1所述的工程菌，其特征在于，所述關鍵酶基因為來源于茶樹的TCS1基 因、TAMH)基因、TIDH基因和來源于咖啡果的CaXMT基因。3. 根據權利要求1或2所述的工程菌，其特征在于，其是將所述關鍵酶基因構建到同一 穿梭表達載體PZ8-1上，然后導入谷氨酸棒狀桿菌中得到的重組菌。4. 根據權利要求1-3任一項所述的工程菌，其特征在于，所述谷氨酸棒狀桿菌為ATCC 13032。5. 權利要求1-4任一項所述工程菌的構建方法，其特征在于，將咖啡堿生物合成途徑中 的關鍵酶基因構建到原核表達載體上，然后導入谷氨酸棒狀桿菌中，篩選陽性克隆。6. 根據權利要求5所述的方法，其特征在于，將CaXMT基因、TCS1基因、TAMPD基因和TIDH 基因構建到同一穿梭表達載體PZ8-1上，然后導入谷氨酸棒狀桿菌ATCC 13032中，篩選陽性 克隆。7. 權利要求1-4任一項所述工程菌在發酵生產咖啡堿中的應用。8. 根據權利要求7所述的應用，其特征在于，在發酵培養過程中，向發酵液中添加一定 濃度的磷酸腺苷，進行發酵生產咖啡堿。9. 根據權利要求8所述的應用，其特征在于，所用發酵培養基配方為：（NH4)2S〇4 20g/L， K2HP〇4 lg/L，KH2P〇4 lg/L，MgS〇4*7H20 250mg/L，M0PS 42g/L，尿素5g/L，維生素 H 0.2mg/ L，硫胺素 500yg/L，微量元素 0 · 2mg/L，葡萄糖 25g/L，pH值 7 · 0-7 · 2; 發酵條件為:250mL發酵罐內盛放50mL發酵液，于30 °C轉速200rpm的條件下進行發酵。10. 根據權利要求8或9所述的應用，其特征在于，發酵培養8h后，向發酵液中添加終濃 度為0.1-lmg/mL的磷酸腺苷，繼續振蕩培養120h。
【文檔編號】C12N15/77GK105861408SQ201610475914
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年6月22日
【發明人】張正竹, 李萌萌, 鄧威威, 寧井銘, 鄧騁
【申請人】安徽農業大學