專利名稱：：抑制血管新生的融合蛋白質及其用途的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一系列能有效抑制血管新生(angiogenesis)的基因重組蛋白質。血管新生是指從已經存在的血管生長出新的血管的過程。成人體內的血管絕大多數處于靜止狀態，血管新生只見于少數病理或生理狀態，例如腫瘤，糖尿病人的病變視網目，關節炎，貧血器官，增生期子宮內膜等。在腫瘤的發生過程中，血管新生對腫瘤的快速生長起到關鍵的作用(HanahanandFolkmanPatternsandemergingmechanismsoftheangiogenicswitchduringtumorigenesis。Cell。1996，86353-364)。動物腫瘤模型的研究和人體臨床試驗已經證明，抑制腫瘤內新生血管的形成可以有效地阻止腫瘤的生長和發展，從而延長病人的生命血管新生受到多種生物活性物質的調節和控制。主導血管新生過程的主要細胞是構成血管壁最內層的血管內皮細胞。多種生長因子能與血管內皮細胞表面相應的受體結合，經細胞內的信號傳遞系統調節血管內皮細胞的活動，從而調控血管的新生。
背景技術：
：在各種生長因子中，血管內皮細胞生長因子(Vascularendothelialcellgrowthfactor，VEGF)是調節血管新生的最重要的因子(FerraraVEGFandthequestfortumorangiogenesisfactor。Nat。Rev。Cancer，2002，10795-803。FerraraRoleofvascularendothelialgrowthfactorinphysiologicandpathologicangiogenesistherapeuticimplications。Semin。Oncol。2002，29(6sumppl)10-14)。血管內皮細胞生長因子可由多種細胞分泌，但它在腫瘤細胞常常過量表達。內皮細胞生長因子通過與相應的受體結合而起作用。與VEGF相結合的受體主要有兩種FLT-1和KDR。在分子結構上，這兩種受體均由三個不同的功能區組成。第一個功能區是位于細胞之外的細胞外部分。它由七個免疫球蛋白樣區域(d1-d7)組成。這一部分對VEGF具有特異親和性，是VEGF與受體相結合的關鍵部位。第二個功能區是由疏水性氨基酸組成的跨細胞膜部分。第三個功能區是細胞內部分，其中包括酪氨酸激酶基團。在受體被VEGF激活后，酪氨酸激酶基團發生磷酸化，從而啟動細胞內部的信號傳遞系統，最終造成內皮細胞的功能變化，導致血管新生。FLT-1和KDR主要分布于血管內皮細胞。因此，VEGF對于血管內皮細胞具有高度專一性的調節作用。VEGF具有促進內皮細胞分裂，引導內皮細胞遷移，抑制細胞調亡，和誘導血管形態發生等等功能，是血管新生的高效誘導劑。在腫瘤組織，VEGF的表達水平比正常組織為高。另外，腫瘤的快速生長常常導致腫瘤內部的缺氧。而氧分壓的降低又導致VEGF表達的增高。因此，VEGF是導致腫瘤中血管新生的關鍵因子。許多動物試驗表明，阻斷VEGF與其受體的結合能有效地抑制腫瘤中血管的新生，從而阻止腫瘤的生長。在其他與血管新生相關的疾病中，例如糖尿病的視網目病變和關節炎的關節病變等等，VEGF也與這些疾病的發展有密切的關系。鑒于VEGF在腫瘤及其他疾病中所起到的關鍵作用，能特異性地阻斷VEGF的蛋白質或化合物將具有治療這些疾病的可能。例如，研究證明抗VEGF的中和抗體能有效的抑制腫瘤的生長(JainTumorangiogenesisandaccessibilityroleofvascularendothelialgrowthfactor。Semin。Oncol。2002，29(6suppl)3-9)。因此，尋找新的更為有效的VEGF阻斷劑在臨床上具有重大的意義。由于FLT-1和KDR對VEGF有天然的親和性，已有研究探討可溶性FLT-1(FLT-1的細胞外部分)或可溶性KDR(KDR的細胞外部分)的抗血管新生作用。可溶性FLT-1可以在體外有效的抑制血管內皮細胞的增生，但其在血清中的半衰期很短，不能達到有效的血清濃度。可溶性KDR在體外也具有抑制血管內皮細胞的增生的作用，但在動物試驗中其抗腫瘤效果不佳。FLT-1的第三免疫球蛋白樣區域的部分堿性氨基酸是導致FLT-1在體內不穩定的主要原因，因此用KDR的部分氨基酸取代這些堿性氨基酸可以增加FLT-1的穩定性。美國專利6100071、5952199、6383486描述了幾種用KDR的部分片段和FLT-1部分片段融合的蛋白，但由于其不穩定，副作用大，沒有進一步開發。
發明內容本發明涉及用基因工程技術構建和生產能阻斷VEGF的蛋白質藥物的方法以及這類藥物在疾病治療上的應用。本發明提供一種由FLT-1和KDR的片斷以及免疫球蛋白Fc片斷經融合得到的六種具有阻斷血管內皮細胞生長因子生物作用，抑制血管新生的融合蛋白，簡稱為FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6，具有以下結構a.FP1由FLT-1的第2免疫球蛋白樣區域和KDR的第3免疫球蛋白樣區域融合而成的蛋白FLTd2-KDRd3-Fc；b.FP2由KDR的第1免疫球蛋白樣區域，FLT-1的第2免疫球蛋白樣區域和KDR的第3免疫球蛋白樣區域融合而成的蛋白KDRd1-FLTd2-KDRd3-Fc；c.FP3由FLT-1的第2免疫球蛋白樣區域和KDR的第3-4免疫球蛋白樣區域融合而成的蛋白FLTd2-KDRd3，4-Fc；d.FP4由FLT-1的第2免疫球蛋白樣區域，KDR的第3免疫球蛋白樣區域和FLT-1的第4免疫球蛋白樣區域融合而成的蛋白FLTd2-KDRd3-FLTd4-Fc；e.FP5由FLT-1的第2免疫球蛋白樣區域和KDR的第3-5免疫球蛋白樣區域融合而成的蛋白FLTd2-KDRd3，4，5-Fc；f.FP6由FLT-1的第2免疫球蛋白樣區域，KDR的第3免疫球蛋白樣區域和FLT-1的第4-5免疫球蛋白樣區域融合而成的蛋白FLTd2-KDRd3-FLTd4，5-Fc。以上FLT-1和KDR免疫球蛋白樣區域的氨基酸FLT-1D2、FLT-1D4、KDR，D1、KDRD3、KDRD4、FP3序列見序列表1-6，FP3的編碼DNA序列見序列表7。其中FLT代表FLT-1序列，KDR代表KDR序列，d是FLT-1或KDR的免疫球蛋白樣區域，也可用大寫D表示(domain)，Fc為人免疫球蛋白Fc序列。其中的免疫球蛋白FC片段選自是人免疫球蛋白FC或動物的免疫球蛋白FC。如IgG，IgM，IgA或亞型IgG1，IgG2，IgG3，IgG4。其中的免疫球蛋白FC片段是FC全長或是部分FC序列，選自CH2片斷，CH3片斷，絞合區域片段，這些序列和片段都是現有技術，在教科書中可以找到。本發明還提供本發明的融合蛋白在制備阻斷血管內皮細胞生長因子生物作用，抑制血管新生的藥物中的應用。這一發明的關鍵在于根據FLT-1和KDR的結構設計構建了一系列由不同的FLT-1片段，KDR片段，和人免疫球蛋白Fc相融合而成的融合蛋白質，再用VEGF結合試驗等方法篩選對VEGF具有最大親和性的融合蛋白質。從而得到最優的VEGF阻斷劑。融合蛋白質的構建技術基于分子克隆方法，具體實驗方法可參考《分子克隆》第二版和第三版等實驗手冊。根據FLT-1和KDR分子各區域的氨基酸序列結構，在上列融合蛋白中，FP1融合蛋白將可以提供與VEGF相結合的基本結構，它由FLT-1的第二免疫球蛋白區域(FLTd2)序列，KDR的第三免疫球蛋白區域(KDRd3)序列和Fc組成。FP2融合蛋白中增加了來自KDR的第一免疫球蛋白樣區域(KDRd1)的氨基酸序列，這些序列可以增加與VEGF相結合的位點，從而增加對VEGF的親和力。FP3和FP4融合蛋白中增加了FLT-1或KDR的第四(FLTd4或KDRd4)免疫球蛋白樣區域的序列。FP5和FP6是在FP1的基礎上增加了FLT-1或KDR的第四和第五免疫球蛋白樣區域(FLT-1d4，5，KDRd4，5)。這些新增的序列將有利于融合蛋白之間的偶聯，從而進一步形成有利于和VEGF相結合的空間結構，增加與VEGF結合的親和力。本發明的融合蛋白可通過基因重組技術獲得，該技術為常規技術，首先獲得編碼有上述融合蛋白的DNA，DNA的獲得可以通過常規技術，如PCR合成等方法，在用PCR合成后被克隆到載體中。所用載體可以是分子生物學所常用的質粒、病毒或DNA片斷。各融合蛋白的氨基末斷前加上蛋白分泌信號序列以保證蛋白質從細胞中分泌出來。載體序列中包括用于驅動基因表達的啟動子，蛋白質翻譯起始和終止信號，以及多聚腺苷酸(PolyA)序列。載體中有抗菌素抗性基因以利于質粒在細菌中所繁殖。另外，載體中還包括真核細胞選擇性基因用于穩定轉染細胞株的選擇。由于FLT-1和KDR中各個免疫球蛋白樣區域的氨基酸序列之間并沒絕然的分界，因此各免疫球蛋白樣區域的氨基酸序列的長度可以有一定的變化。所以，本發明所涉及的融合蛋白質的氨基酸序列也可以有一定的變化。它們都屬于本發明的范圍。在完成上列各種融合蛋白的質粒構建以后，即可用質粒DNA轉染細胞，表達相應的蛋白質。能夠用于表達這些融合蛋白的表達系統有多種，它們包括(但不限于)哺乳動物細胞，細菌，酵母，昆蟲細胞，等等(其中哺乳動物細胞和昆蟲細胞為真核細胞，細菌和酵母細胞為原核細胞。從哺乳動物細胞所表達的蛋白質具有糖基修飾。由于本發明的融合蛋白質的氨基酸序列中包括可糖基化的氨基酸，因此，哺乳動物細胞是表達這些蛋白質的最佳細胞。可用于蛋白質大規模表達的哺乳動物細胞有多種，例如293細胞，CHO細胞，SP20細胞，NS0細胞，COS細胞，BHK細胞，PerC6細胞，等等。許多其他細胞也可用于這些蛋白質的表達和生產，因此都包括在本發明所能使用的細胞之列。編碼多肽的質粒可經轉染(transfection)進入細胞。轉染細胞的方法有多種，其中包括(但不限于)電鉆孔(electroporation)，脂質體(liposome)介導，鈣介導，等等。除了哺乳動物細胞，其他表達系統也能用于這些多肽的表達，例如細菌，酵母，昆蟲細胞，等等。它們也包括在本發明所能使用的細胞之列。這些表達系統的蛋白質產量比哺乳動物細胞為高，但是，所表達的蛋白質缺乏糖基化或者所形成的糖鏈與哺乳動物細胞不同。融合蛋白質表達后，可用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)或其他方法測定細胞培養液中融合蛋白質的濃度。由于這些融合蛋白質具有免疫球蛋白Fc片斷，因此可用蛋白A親和層析法提取所表達的融合蛋白質。本發明從質粒轉染的293細胞培養液中獲得相應的各種融合蛋白質。然后利用VEGF結合試驗來比較各種蛋白質對VEGF的親和力。進而，利用VEGF誘導下的人血管內皮細胞分裂試驗檢測和比較各融合蛋白對VEGF的阻斷作用。實驗結果證明本發明所構建的各種融合蛋白質對VEGF具有高度的親和力(見圖2)，而且，它們能有效地阻斷VEGF對血管內皮細胞刺激，抑制內皮細胞的分裂。進一步的試驗發現，FP3對VEGF的阻斷效果最好。是阻斷VEGF最有效的融合蛋白質。因此，本發明所構建的融合蛋白質對VEGF具有阻斷作用。其中FP1的分子量最小。FP3對阻斷VEGF最為有效。這些融合蛋白質都具有抗血管新生的生物學特性，從而具有治療疾病可能。由于本發明的各種融合蛋白質的基本作用是阻斷VEGF，因此這些蛋白質可能應用于與血管新生或者VEGF相關的疾病。這些疾病可能包括(但不限于)各種腫瘤，視網目血管病變，關節炎，等等。融合蛋白可以作為提取的重組蛋白質注射到病人體內。也可以將融合蛋白DNA序列插入到適當的載體中，用基因治療或細胞治療的方法在病人體內表達。所以，本發明所涉及的融合蛋白質的使用方法有多種形色，不僅包括蛋白質本身，也包括編碼融合蛋白的DNA。為了進一步證明融合蛋白質在體內的抗血管作用，本發明試驗了FP3融合蛋白質在動物體內的抗腫瘤作用。在小鼠B16F10黑色素瘤和異種移植(Xenograft)模型人PC-3前列腺癌，融合蛋白質非常有效地抑制了腫瘤的生長，延長了個體的生命。因此，本發明所構建的融合蛋白質具有高效的抗癌能力。本發明還包括含有本發明融合蛋白的藥物組合物，組合物中可以含有藥物可接受的載體。組合物可以以任何形式的藥物制劑形式存在，優選的是注射劑，最優選的是冷凍干燥注射劑，該藥物制劑形式藥物組合物，可以按照制劑學常規技術制備，包括將藥物活性成分，本發明的融合蛋白與藥物載體混合，按照制劑學常規技術制成所需要的劑型。本發明的融合蛋白，與現有技術相比，優點明顯，具有穩定性好，產率高，副作用小的特點，本發明特別優選的融合蛋白是FP3，是經過大量篩選得到的，經與本發明的其他融合蛋白以及現有技術中其他類似的融合蛋白進行比較實驗研究，發現，該融合蛋白具有特別優良的在動物體內的抗腫瘤作用。在小鼠B16F10黑色素瘤和異種移植(Xenograft)模型人PC-3前列腺癌，FP3融合蛋白非常有效地抑制了腫瘤的生長，延長了個體的生命，實驗證明，FP3比其他融合蛋白更有效，副作用更小，制成制劑后穩定性最好。在本發明融合蛋白質中最具抗癌應用價值。圖1展示了六種融合蛋白的結構組成。它們由不同的FLT-1和KDR多肽片斷以及免疫球蛋白Fc片斷用基因工程構建而成。圖2顯示六種融合蛋白與VEGF結合的試驗結果。OD讀數代表融合蛋白質與VEGF的結合信號。結果顯示它們與VEGF具有很強的結合能力，尤其以FP3的結合能力最強。圖3融合蛋白有效地抑制人血管內皮細胞的在體外的分裂。圖4顯示融合蛋白質FP3有效地抑制小鼠B16F10黑色素瘤在體內的生長。圖5顯示融合蛋白質有效地抑制人PC-3前列腺癌在小鼠體內的生長。圖6融合多肽FP1與FP3有效地抑制小鼠腫瘤的生長的比較研究。具體實施例方式以下實例對本發明所涉及的融合蛋白構建，試驗和應用作了詳細說明。但是本發明的內容及用途并不限制于實例的范圍。實施例1融合蛋白質及其質粒的構建。除了免疫球蛋白Fc片斷，構建本發明中各種融合蛋白的原始序列來自FLT-1和KDR相應的cDNA。由于FLT-1和KDR的表達主要見于血管內皮細胞，故本發明用RNA提純藥盒(QIAGEN公司)從人臍帶靜脈血管內皮細胞(HUVEC)提取了總RNA。然后用逆轉錄酶從RNA合成cDNA。再用不同的引物利用聚合酶鏈反應(PCR)擴增獲得所需要的FLT-1和KDR片斷。最后用PCR將來自FLT-1，KDR，和人免疫球蛋白Fc(IgG1Fc)序列相融合，從而構建成不同融合蛋白質的DNA序列。六種融合蛋白的結構見圖1。FP3基因的構建用EGM-2培養基(Clonetics)在T-175培養瓶中培養人臍帶靜脈血管內皮細胞(HUVEC細胞)(Clonetics)。收集大約1×10e7個細胞，利用Qiagen公司的RNA提取試劑盒提取細胞總RNA，并用InvitrogencDNA試劑盒合成cDNA，-80℃凍存備用。采用下列特異引物從HUVECcDNA中擴增到FLT-1andKDR基因片段。用人IgG1Fc特異引物從來源自淋巴結(BDClontech)的cDNA中擴增到IgG1Fc基因片段。Primers(引物)FLT-1D2forwardcctttcgtagagatgtacagtgaFLT-1D2reversetatgattgtattggtttgtccatKDRD3-4forwardgatgtggttctgagtccgtctcaKDRD3-4reversecggtgggacatacacaaccagaHumanIgG1FcforwardgacaaaactcacacatgcccactHumanIgG1Fcreversetcatttacccggagacagggagag在變性95℃，30分，退火56℃，45秒，延伸72℃，2分的條件下，進行PCR擴增，30個循環，獲得FLT-1和KDRIgG樣結構域的PCR產物及人IgG1Fc段PCR產物。用TAcloning試劑盒，把PCR產物克隆入pCR2.1質粒，并轉染E.coli，選取白色菌落，加入LB培養基，培養過夜。Qiangen質粒提取試劑盒提取質粒后酶切，及測序鑒定。采用拼接PCR(sewingPCR)方法，把FLT-1、KDR和IgGFccDNA連接在一起，在引物中設計有EcoRI的酶切位點，用EcoRI酶切后，Qiangen純化試劑盒純化DNA片段并插入pcDNA3.1質粒，重組質粒轉染E.coli，選取陽性菌落，加入LB培養基，培養過夜。Qiagen質粒提取試劑盒提取質粒后酶切，及測序鑒定。已獲證實的質粒再轉染293或CHO細胞獲得穩定表達FP3的細胞系。FP3的具體氨基酸序列見序列表6，實施例2融合蛋白質在細胞中的表達。本發明的組成部分之一是在細胞中表達所構建的融合蛋白質。在完成各質粒的構建以后，用質粒DNA提純藥盒(QIAGEN公司)提取了高純度質粒DNA。然后，利用FUGEN6質粒轉染藥盒(ROCHE公司)將質粒DNA導入293細胞中。按所需蛋白質量的多少，采用了兩種不同的質粒轉染的方法表達融合蛋白。第一種方法是瞬時轉染(Transienttransfection)法，用這一方法可以得到小規模量的融合蛋白質。首先用含10％胎牛血清的DMEM完全培養基將293細胞在細胞培養皿內培養。當細胞生長至覆蓋60-80％面積時，將質粒DNA與FUGEN6試劑的復合物加入細胞培養液中。第二天，用無血清DMEM培養基換液。再繼續培養三天，然后收集上清液。這些上清液中含有從細胞表達的融合蛋白多肽。融合多肽的濃度用ELISA法定量確定。用這一方法，本發明表達了上述六種融合多肽。第二種方法是用穩定轉染(Stabletransfection)法建立穩定細胞，以表達大量的融合蛋白多肽。所用細胞亦是293細胞。質粒的轉染方法與上述瞬時轉染法相同，但是，在轉染第二天，細胞在含有新酶素的DMEM完全培養中用有限密度稀釋法經行克隆培養。大約21天后，挑取新酶素抗性克隆，進行細胞的擴大培養。最后，細胞在轉鼓培養瓶中培養生產融合多肽。融合多肽的濃度用ELISA法定量確定。本發明證明可以從質粒經細胞轉染表達和生產所構建的融合多肽。實施例3融合多肽與VEGF的結合實驗。本發明用VEGF結合試驗測定了各融合多肽與VEGF的結合能力。在這一試驗中，首先將重組VEGF(Chemicom公司)蛋白質包被在96孔ELISA板上。然后用百分之五的牛奶粉溶液阻斷非特異性蛋白結合位點。再向各孔加入含有不同濃度的各種融合蛋白質，在37度培養兩個小時。清洗以后，加入兔抗人Ig抗體-HRP。最終用過氧化物酶底物顯色。用ELISA閱讀儀測量96孔板各孔OD值。高OD值代表融合蛋白質與VEGF的結合信號。如圖2所示，本發明所構建和表達的六種融合蛋白都具有與VEGF結合的能力。在每毫升1毫微克的濃度，便能檢測到它們與VEGF的結合信號。因此，這六種融合蛋白都與VEGF具有很高的親和力。但是，比較而言，FP3與VEGF的結合能力最大，是最強大的VEGF阻斷劑。它的半數最大結合濃度(Halfmaximalbindingconcentration)比FP1低約5倍。FP5與VEGF的結合能力比FP3稍弱。這一結果說明KDR的第四免疫球蛋白樣區域的氨基酸序列可增進融合蛋白對VEGF的阻斷能力。但是，在融合蛋白中進一步增加KDR的序列，例如第五免疫球蛋白樣區域，并不進一步增加對VEGF的抑制能力。其他三個融合蛋白質的抑制能力比FP3和FP5為弱，但比FP1強。實施例4融合蛋白有效地抑制人血管內皮細胞的在體外的分裂。本發明另一關鍵實例是證明了所構建的融合蛋白能有效地阻斷VEGF所誘導的血管內皮細胞的分裂。在這一實驗中，將臍帶靜脈血管內皮細胞(HUVEC細胞，CLONETICS公司)接種于96孔細胞培養板。細胞培養液為EBM基本培養基(CLONETICS公司)，含2％胎牛血清和15ng/mlVEGF。在實驗組的細胞培養液中，加入含不同濃度融合蛋白的293細胞上清液。在陰性對照組的細胞培養液中，加入未經質粒轉染的293細胞上清液(不含融合蛋白)。不同處理的HUVEC細胞在37度繼續培養。三天后，細胞計數確定各孔中的HUVEC密度。如圖3所示，六種蛋白質都能有效的阻斷VEGF對其受體的刺激作用。其中FP3對HUVEC生長抑制作用最明顯。HUVEC細胞分裂試驗顯示，本發明所構建的六種融合蛋白質鈞能抑制血管內皮細胞的分裂。鑒于在這個實驗中HUVEC細胞的分裂由VEGF刺激造成，因此，這六種蛋白質都能有效的阻斷VEGF對其受體的刺激作用。它們都有抑制血管新生的功能。在這六種蛋白質中，以FP3對HUVEC細胞分裂的阻抑作用最強，它們的半數抑制濃度(IC50)在3ng/ml左右。FP1的IC50為12ng/ml左右。FP2，FP4，FP5，和FP6的IC50在5-8ng/ml。實施例5融合多肽能有效地抑制小鼠腫瘤的生長。作為VEGF阻斷劑，本發明所構建的融合蛋白質的應用之一是用于腫瘤的治療。鑒于FP3融合蛋白對VEGF有高效的阻斷作用，本發明選擇FP3進行了動物體內抗腫瘤效果的試驗。本發明所試驗的小鼠腫瘤模型是B16F10黑色素瘤。這是一種快速生長的惡性腫瘤。在這個試驗中，先將B16F10細胞注入小鼠背部皮下。經尾靜脈注射提純的融合蛋白質。注射劑量為每小鼠每次400微克(小鼠平均體重約22克)，每周兩次。對照組注射同劑量的提純人免疫球蛋白Fc。圖4顯示腫瘤的生長曲線。融合蛋白非常有效抑制了該黑色素瘤的生長(P＜0.01)。讓人類腫瘤細胞在裸鼠體內生長的異種移植(Xenograft)模型是與人體腫瘤最為接近的動物腫瘤模型。裸鼠缺乏免疫排斥能力，因此，許多來自人的腫瘤細胞系能在裸鼠體內生長，形成腫瘤。本發明試驗了融合蛋白FP3對人前列腺癌PC-3細胞在裸鼠體內生長的抑制作用。在這一模型，首先將PC-3細胞注入裸鼠背部皮下，從尾靜脈注射提純的融合蛋白。每個小鼠每次400微克，每周兩次。對照組注射相同劑量的人免疫球蛋白Fc。實驗結果如圖5所示。在對照組，腫瘤細胞接種后45天，腫瘤已長至大于1000立方毫米。而在用融合蛋白質注射的動物，融合蛋白幾乎完全抑制了PC-3腫瘤的生長(P＜0.01)，對腫瘤具有非常顯著的治療作用。實施例6融合多肽FP1與FP3有效地抑制小鼠腫瘤的生長的比較研究。為更好地說明FP3具有較好的腫瘤抑制作用，選用了FP1同FP3做抑制腫瘤生長的比較試驗。選用10只生長良好的裸鼠，每只背部注射鼠神經膠質瘤C6細胞1×105，0.05ml，再尾靜脈分別注射提純的融合蛋白FP1和FP3，2.5mg/kg，每周兩次，到31天。對照組注射相同劑量的人免疫球蛋白Fc。實驗結果如圖6所示。FP1和FP3對腫瘤具有非常顯著的治療作用，到第35天，FP1組腫瘤體積是1167.3，而FP3組是557.6，對照組再第24天已到1312.3。所以，FP3的作用更明顯(P＜0.05.)。結果如圖6所示。綜上所述，本發明所構建的融合蛋白質對VEGF具有高度的親和性，能在體外抑制血管內皮細胞的增生，并能在體內非常顯著抑制腫瘤的生長。鑒于血管新生為所有腫瘤增生之必需，本發明所涉及的融合蛋白質可用于多種腫瘤的治療。序列表<110>成都康弘科技實業(集團)有限公司<120>抑制血管新生的融合蛋白質及其用途<160>7<210>1<211>93<212>PRT<213>人工序列<400>1ProPheValGluMetTyrSerGluIleProGluIleIleHisMetThrGluGlyArgGlu15101520LeuValIleProCysArgValThrSerProAsnIleThrValThrLeuLysLysPhePro25303540LeuAspThrLeuIleProAspGlyLysArgIleIleTrpAspSerArgLysGlyPheIle45505560IleSerAsnAlaThrTyrLysGluIleGlyLeuLeuThrCysGluAlaThrValAsnGly65707580HisLeuTyrLysThrAsnTyrLeuThrHisArgGlnThr859093<210>2<211>96<212>PRT<213>人工序列<400>2PheIleThrValLysHisArgLysGlnGlnValLeuGluThrValAlaGlyLysArgSer15101520TyrArgLeuSerMetLysValLysAlaPheProSerProGluValValTrpLeuLysAsp25303540GlyLeuProAlaThrGluLysSerAlaArgTyrLeuThrArgGlyTyrSerLeuIleIle45505560LysAspValThrGluGluAspAlaGlyAsnTyrThrIleLeuLeuSerIleLysGlnSer65707580AsnValPheLysAsnLeuThrAlaThrLeuIleValAsnValLysPro85909596<210>3<211>86<212>PRT<213>人工序列<400>3ProArgLeuSerIleGlnLysAspIleLeuThrIleLysAlaAsnThrThrLeuGlnIle15101520ThrCysArgGlyGlnArgAspLeuAspTrpLeuTrpProAsnAsnGlnSerGlySerGlu25303540GlnArgValGluValThrGluCysSerAspGlyLeuPheCysLysThrLeuThrIlePro45505560LysValIleGlyAsnAspThrGlyAlaTyrLysCysPheTyrArgGluThrAspLeuAla65707580SerValIleTyrValTyr8586<210>4<211>102<212>PRT<213>人工序列<400>4ValValLeuSerProSerHisGlyIleGluLeuSerValGlyGluLysLeuValLeuAsn115101520CysThrAlaArgThrGluLeuAsnValGlyIleAspPheAsnTrpGluTyrProSerSer25303540LysHisGlnHisLysLysLeuValAsnArgAspLeuLysThrGlnSerGlySerGluMet45505560LysLysPheLeuSerThrLeuThrIleAspGlyValThrArgSerAspGlnGlyLeuTyr65707580ThrCysAlaAlaSerSerGlyLeuMetThrLysLysAsnSerThrPheValArgValHis859095100GluLys102<210>5<211>92<212>PRT<213>人工序列<400>5PheValAlaPheGlySerGlyMetGluSerLeuValGluAlaThrValGlyGluArgVal15101520ArgIleProAlaLysTyrLeuGlyTyrProProProGluIleLysTrpTyrLysAsnGly25303540IleProLeuGluSerAsnHisThrIleLysAlaGlyHisValLeuThrIleMetGluVal45505560SerGluArgAspThrGlyAsnTyrThrValIleLeuThrAsnProIleSerLysGluLys65707580GlnSerHisValValSerLeuValValTyrValPro859092<210>6<211>552<212>PRT<213>人工序列<400>6MetValSerTyrTrpAspThrGlyValLeuLeuCysAlaLeuLeuSerCysLeuLeuLeu15101520ThrGlySerSerSerGlyGlyArgProPheValGluMetTyrSerGluIleProGluIle25303540IleHisMetThrGluGlyArgGluLeuValIleProCysArgValThrSerProAsnIle45505560ThrValThrLeuLysLysPheProLeuAspThrLeuIleProAspGlyLysArgIleIle65707580TrpAspSerArgLysGlyPheIleIleSerAsnAlaThrTyrLysGluIleGlyLeuLeu859095100ThrCysGluAlaThrValAsnGlyHisLeuTyrLysThrAsnTyrLeuThrHisArgGln0ThrAsnThrIleIleAspValValLeuSerProSerHisGlyIleGluLeuSerValGly0GluLysLeuValLeuAsnCysThrAlaArgThrGluLeuAsnValGlyIleAspPheAsn0TrpGluTyrProSerSerLysHisGlnHisLysLysLeuValAsnArgAspLeuLysThr0GlnSerGlySerGluMetLysLysPheLeuSerThrLeuThrIleAspGlyValThrArg0SerAspGlnGlyLeuTyrThrCysAlaAlaSerSerGlyLeuMetThrLysLysAsnSer205210215220ThrPheValArgValHisGluLysProPheValAlaPheGlySerGlyMetGluSerLeu225230235240ValGluAlaThrValGlyGluArgValArgleuProAlaLysTyrLeuGlyTyrProPro245250255260ProGluIleLysTrpTyrLysAsnGlyIleProLeuGluSerAsnHisThrIleLysAla265270275280GlyHisValLeuThrIleMetGluValSerGluArgAspThrGlyAsnTyrThrValIle285290295300LeuThrAsnProIleSerLysGluLysGlnSerHisValValSerLeuValValTyrVal305310315320ProProGlyProGlyAspLysThrHisThrCysProLeuCysProAlaProGluLeuLeu325330335340GlyGlyProSerValPheLeuPheProProLysProLysAspThrLeuMetIleSerArg345350355360ThrProGluValThrCysValValValAspValSerHisGluAspProGluValLysPhe365370375380AsnTrpTyrValAspGlyValGluValHisAsnAlaLysThrLysProArgGluGluGln385390395400TyrAsnSerThrTyrArgValValSerValLeuThrValLeuHisGlnAspTrpLeuAsn405410415420GlyLysGluTyrLysCysLysValSerAsnLysAlaLeuProAlaProIleGluLysThr425430435440IleSerLysAlaLysGlyGlnProArgGluProGlnValTyrThrLeuProProSerArg445450455460AspGluLeuThrLysAsnGlnValSerLeuThrCysLeuValLysGlyPheTyrProSer465470475480AspIleAlaValGluTrpGluSerAsnGlyGlnProGluAsnAsnTyrLysAlaThrPro485490495500ProValLeuAspSerAspGlySerPhePheLeuTyrSerLysLeuThrValAspLysSer505510515520ArgTrpGlnGlnGlyAsnValPheSerCysSerValMetHisGluAlaLeuHisAsnHis525530535540TyrThrGlnLysSerLeuSerLeuSerProGlyLys545550552<210>7<211>1656<212>DNA<213>人工序列<400>7atggtcagctactgggacaccggggtcctgctgtgcgcgctgctcagctgtctgcttctc60acaggatctagttccggaggtagacctttcgtagagatgtacagtgaaatccccgaaatt120atacacatgactgaaggaagggagctcgtcattccctgccgggttacgtcacctaacatc180actgttactttaaaaaagtttccacttgacactttgatccctgatggaaaacgcataatc240tgggacagtagaaagggcttcatcatatcaaatgcaacgtacaaagaaatagggcttctg300acctgtgaagcaacagtcaatgggcatttgtataagacaaactatctcacacatcgacaa360accaatacaatcatagatgtggttctgagtccgtctcatggaattgaactatctgttgga420gaaaagcttgtcttaaattgtacagcaagaactgaactaaatgtggggattgacttcaac480tgggaatacccttcttcgaagcatcagcataagaaacttgtaaaccgagacctaaaaacc540cagtctgggagtgagatgaagaaatttttgagcaccttaactatagatggtgtaacccgg600agtgaccaaggattgtacacctgtgcagcatccagtgggctgatgaccaagaagaacagc660acatttgtcagggtccatgaaaacctttctgttgcttttggaagtggcatggaatctctg720gtggaagccacggtgggggagcgtgtcagaatccctgcgaagtaccttggttacccaccc780ccagaaataaaatggtataaaaatggaataccccttgagtccaatcacacaattaaagcg840gggcatgtactgacgattatggaagtgagtgaaagagacacaggaaattacactgtcatc900cttaccaatcccatttcaaaggagaagcagagccatgtggtctctctggttgtgtatgtc960ccaccgggcccgggcgacaaaactcacacatgcccactgtgcccagcacctgaactcctg1020gggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccgg1080acccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttc1140aactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcag1200tacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaat1260ggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaacc1320atctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgg1380gatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctagtcaaaggcttctatcccagc1440gacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaaggccacgcct1500cccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagc1560aggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccac1620tacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa165權利要求1.由FLT-1和KDR的片斷以及免疫球蛋白Fc片斷經融合得到的六種具有阻斷血管內皮細胞生長因子生物作用，抑制血管新生的融合蛋白，其特征在于，具有以下結構a.FP1由FLT-1的第2免疫球蛋白樣區域和KDR的第3免疫球蛋白樣區域融合而成的蛋白FLTd2-KDRd3-Fc；b.FP2由KDR的第1免疫球蛋白樣區域，FLT-1的第2免疫球蛋白樣區域和KDR的第3免疫球蛋白樣區域融合而成的蛋白KDRd1-FLTd2-KDRd3-Fcc.FP3由FLT-1的第2免疫球蛋白樣區域和KDR的第3-4免疫球蛋白樣區域融合而成的蛋白FLTd2-KDRd3，4-Fc；d.FP4由FLT-1的第2免疫球蛋白樣區域，KDR的第3免疫球蛋白樣區域和FLT-1的第4免疫球蛋白樣區域融合而成的蛋白FLTd2-KDRd3-FLTd4-Fc；e.FP5由FLT-1的第2免疫球蛋白樣區域和KDR的第3-5免疫球蛋白樣區域融合而成的蛋白FLTd2-KDRd3，4，5-Fc；或f.FP6由FLT-1的第2免疫球蛋白樣區域，KDR的第3免疫球蛋白樣區域和FLT-1的第4-5免疫球蛋白樣區域融合而成的蛋白FLTd2-KDRd3-FLTd4，5-Fc。2.權利要求1的融合蛋白，其特征在于，其中的免疫球蛋白FC片段選自是人免疫球蛋白FC或動物的免疫球蛋白FC。3.權利要求1的融合蛋白，其特征在于，其中的免疫球蛋白FC片段選自IgG，，IgM，IgA或亞型IgG1，IgG2，IgG3，IgG4。4.權利要求1的融合蛋白，其特征在于，其中的免疫球蛋白FC片段是FC全長或是部分FC序列，選自CH2片斷，CH3片斷，絞合區域片段。5.編碼有權利要求1的融合蛋白的DNA序列。6.含有權利要求2中所述DNA序列的載體，這些載體選自質粒，病毒或DNA片斷。7.含有權利要求6中所述載體的細胞，這些細胞可用于相應的權利要求1中的融合蛋白質的表達，它們選自真核細胞或原核細胞。8.權利要求1的融合蛋白在制備阻斷血管內皮細胞生長因子生物作用，抑制血管新生的藥物中的應用。9.含有權利要求1的融合蛋白的藥物組合物。10.權利要求9的藥物組合物，是注射劑，其活性成分是融合蛋白FP3，根據需要，所述組合物還含有藥物可接受的載體。全文摘要本發明涉及一種抑制血管新生的融合蛋白質及其用途，本發明的融合蛋白由FLT－1和KDR的片斷以及免疫球蛋白Fc片斷經融合得到的，稱為FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6，其中FLT－1和KDR免疫球蛋白樣區域的氨基酸FLT－1D2、FLT－1D4、KDR，D1、KDRD3、KDRD4、FP3序列見序列表1－6，FP3的編碼DNA序列見序列表7。文檔編號C07K19/00GK1706867SQ20051007359公開日2005年12月14日申請日期2005年6月6日優先權日2004年6月8日發明者劉征申請人:成都康弘科技實業(集團)有限公司