重組融合蛋白制劑的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物技術藥物制劑領域，具體涉及穩定的重組融合蛋白制劑及其制備 方法和應用。
【背景技術】
[0002] 年齡相關性黃斑變性（AMD)又稱老年黃斑變性，為視網膜黃斑區結構的衰老性改 變，主要由視網膜色素上皮細胞和視網膜退行性病變引起的不可逆的視力下降或喪失。該 病在臨床上分為干性（萎縮性）AMD和濕性（滲出性）AMD兩種，其中，濕性AMD約占 AMD總 病例數的20%，不過，在西方國家，濕性AMD卻是老年人失明的首要原因。眼內異常血管增 生是濕性AMD發生和發展的主要原因之一，阻斷異常血管增生是濕性AMD的治療基礎，它有 可能減緩甚至阻止疾病的進程。血管內皮生長因子（VEGF)是一種分泌性蛋白質，它可誘發 血管生成，增加血管滲透性，引發炎癥，而這些因素又與濕性AMD的發展進程密切相關。因 此，在開發濕性AMD治療藥物時，都將VEGF當作潛在的治療靶標。
[0003] 重組人血管內皮生長因子受體-抗體-人補體受體1融合蛋白（以下簡稱IBI302) 就是根據以上機理而設計研發的針對AMD病癥的大分子藥物。它是申請人自主設計的具有 全球知識產權的I類新藥，其給藥途徑設計為玻璃體內注射，劑量預計為0. 5~2mg/眼。
[0004] 自1982年第一個重組藥物--人工胰島素上市以來，應用蛋白質工程技術制造的 重組融合蛋白藥物已經越來越多被開發出來，其中部分已經作為常規藥品被人們所接受。 但是由于該類藥物均為分子量較大的多肽或蛋白質，其性能很不穩定，極易變質，而且蛋白 質高濃度時容易發生自我聚集。這些不利因素使得將這類藥物制成穩定、安全、有效的制劑 提出了巨大挑戰。
[0005] 重組融合蛋白為生物大分子，其結構非常復雜。在生產及儲存過程中，表達的蛋白 分子會發生各種物理和化學變化。物理變化有：吸附、去折疊變性、聚集和沉淀等。化學變 化有：脫酰胺，異構化，氧化等。這些變化可能會對最終產品安全性和有效性產生影響。因 此，建立一個合適的制劑處方以保障產品的穩定性和安全性非常重要。
[0006] IBI302是雙靶點特異性融合蛋白，為國家I類新藥。由于其結構的復雜性，導致其 化學性質不穩定，蛋白容易發生聚集且電荷異構體易于從堿性組分轉化為酸性組分。
[0007] 因此，本領域尚需研發重組蛋白制劑，保障產品的穩定性。

【發明內容】

[0008] 本發明的目的在于提供一種重組蛋白制劑，可以使融合蛋白在較高濃度下穩定保 存，此外，制劑在高溫加速、長期冷藏和反復凍融等條件下均能保持其穩定性，提高臨床使 用安全性。
[0009] 本發明的第一方面，提供一種重組融合蛋白液體制劑，所述液體制劑包含：重組融 合蛋白、緩沖鹽、穩定劑、表面活性劑和無菌注射用水，其中，
[0010] 所述重組融合蛋白的濃度為5~45mg/mL ; toon] 所述緩沖鹽為枸櫞酸鹽、醋酸鹽中的一種或兩種以上的組合，且所述鹽的濃度為 5-25mmol/L，較佳地為 8-22mmol/L ;
[0012] 所述穩定劑為氯化鈉、氨基酸、多元醇中的一種或兩種以上的組合，所述氨基酸為 精氨酸、甘氨酸、組氨酸中的一種或兩種以上的組合，所述多元醇為蔗糖、山梨醇、甘露醇中 的一種或兩種以上的組合，且所述氯化鈉的濃度為100-200mmol/L，所述氨基酸的濃度為 50-350mmol/L,所述多元醇的濃度為1重量％~15重量％,以所述液體制劑的總重量計；
[0013] 所述表面活性劑為聚山梨酯20、聚山梨酯80、泊洛沙姆188中的一種或兩種以上 的組合，且所述表面活性劑的濃度為0. 01重量％~0. 08重量％，以所述液體制劑的總重量 計；
[0014] 且所述液體制劑的pH為4. 5~7. 5。
[0015] 在另一優選例中，所述重組融合蛋白為重組人血管內皮生長因子受體-抗體-人 補體受體1融合蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO. : 1或SEQ ID NO. : 3所示。
[0016] 在另一優選例中，所述穩定劑為氨基酸、多元醇中的一種或兩種以上的組合。
[0017] 在另一優選例中，所述氯化鈉的濃度為120-180mmol/L。
[0018] 在另一優選例中，所述氨基酸的濃度為70-260mmol/L
[0019] 在另一優選例中，所述多元醇的濃度為3重量％~10重量％。
[0020] 在另一優選例中，所述多元醇的濃度為200-300mmol/L，較佳地，為220~ 270mmol/L〇
[0021] 在另一優選例中，所述液體制劑的pH為5. 0-7. 2,較佳地，pH為5. 5-7. 0。
[0022] 在另一優選例中，所述緩沖鹽為枸櫞酸鹽；
[0023] 所述氨基酸為精氨酸；
[0024] 所述多元醇為蔗糖；
[0025] 所述表面活性劑為聚山梨酯20。
[0026] 本發明中，所述緩沖鹽為枸櫞酸鈉、醋酸鈉中的一種或兩種以上的組合。
[0027] 本發明的第二方面，提供一種試劑盒，所述試劑盒含有第一方面所述的液體制劑， 以及盛裝所述液體制劑的容器。
[0028] 進一步地，所述試劑盒中還含有說明書。
[0029] 本發明的第三方面，提供第一方面所述的液體制劑的用途，用于制備預防和/或 治療年齡相關性黃斑變性的藥物。
[0030] 在另一優選例中,所述年齡相關性黃斑變性為濕性年齡相關性黃斑變性。
[0031] 本發明的液體制劑，可使重組融合蛋白保持穩定，使得該重組蛋白能穩定存在于 處方中，提高產品的質量，延長產品的貨架期，提高臨床使用安全性。液體制劑具有較佳的 熱穩定性，在高溫加速、長期冷藏和反復凍融等條件下均能保持穩定。
[0032] 應理解，在本發明范圍內中，本發明的上述各技術特征和在下文（如實施例）中具 體描述的各技術特征之間都可以互相組合，從而構成新的或優選的技術方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【具體實施方式】
[0033] 本申請的發明人經過廣泛而深入地研究，首次意外研發出一種重組融合蛋白制 劑，在加速、長期和凍融等條件下，能保障產品的穩定性。本發明可應用的重組融合蛋白 (VEGF抑制劑）還包括其他基因工程技術獲得的重組融合蛋白（VEGF抑制劑）。在此基礎 上，完成了本發明。
[0034] 重組人血管內皮生長因子受體-抗體-人補體受體1融合蛋白
[0035] 本發明優選的重組融合蛋白是重組人血管內皮生長因子受體-抗體-人補體受 體 1 融合蛋白（參見 US61/629, 932 (PCT/US2012/067489);專利名稱：Protein inhibitors to complement and vegf pathways and methods of use thereof),氨基酸序列如 SEQ ID NO. : I所示。
[0036] 本發明另一優選的重組融合蛋白是重組人血管內皮生長因子受體-抗體-人補體 受體1融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO. : 3所示。
[0037] 液體制劑
[0038] 本發明的重組融合蛋白液體制劑，包含：重組融合蛋白、緩沖鹽、穩定劑、表面活性 劑和無菌注射用水。
[0039] 在另一優選例中，所述液體制劑，包含：重組融合蛋白、緩沖鹽、氯化鈉、表面活性 劑和無菌注射用水。
[0040] 在另一優選例中，所述液體制劑，包含：重組融合蛋白、緩沖鹽、多元醇、表面活性 劑和無菌注射用水。
[0041] 在另一優選例中，所述液體制劑，包含：重組融合蛋白、緩沖鹽、氨基酸、表面活性 劑和無菌注射用水。
[0042] 在另一優選例中，所述液體制劑，包含：重組融合蛋白、緩沖鹽、多元醇、氨基酸、表 面活性劑和無菌注射用水。
[0043] 所述重組融合蛋白的濃度為5~45mg/mL。
[0044] 所述緩沖鹽為枸櫞酸鹽、醋酸鹽中的一種或兩種以上的組合，且所述鹽的濃度為 5-25mmol/L，較佳地為 8-22mmol/L。
[0045] 所述穩定劑為氯化鈉、氨基酸、多元醇中的一種或兩種以上的組合。
[0046] 所述氨基酸為精氨酸、甘氨酸、組氨酸中的一種或兩種以上的組合。所述氨基酸的 濃度為 50-350mmol/L，較佳地為 70 ~260mmol/L。
[0047] 所述多元醇為蔗糖、山梨醇、甘露醇中的一種或兩種以上的組合。所述多元醇的濃 度為1重量％~15重量％，較佳地為3重量％~10重量％。
[0048] 所述氯化鈉的濃度為100-200mmol/L。
[0049] 所述表面活性劑為聚山梨酯20、聚山梨酯80、泊洛沙姆188中的一種或兩種以上 的組合。
[0050] 所述表面活性劑的濃度為0. 01重量％~0. 08重量％，較佳地為0. 02重量％~ 0. 06重量％,以所述液體制劑的總重量計。
[0051] 所述液體制劑的pH為4. 5~7. 5,較佳地為5-7。
[0052] 本發明的液體制劑或包含液體制劑的試劑盒，可以用于制備預防和/或治療年齡 相關性黃斑變性的藥物。重組融合蛋白可以保持穩定，產品質量高，保質期長，提高臨床使 用安全性。
[0053] 本發明提到的上述特征，或實施例提到的特征可以任意組合。本案說明書所揭示 的所有特征可與任何組合物形式并用，說明書中所揭示的各個特征，可以被任何提供相同、 均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特別說明，所揭示的特征僅為均等或相似特 征的一般性例子。
[0054] 本發明的有益之處在于：
[0055] (1)本發明提供具有較長保質期的新型制劑，可使重組融合蛋白，如重組人血管內 皮生長因子受體-抗體-人補體受體1融合蛋白保持穩定，制劑在高溫加速、長期冷藏和反 復凍融等條件下均能保持其穩定性。
[0056] (2)本發明的液體制劑，可以提高重組融合蛋白制劑的物理化學穩定性，使得該重 組蛋白能穩定存在于處方中，提高產品的質量，延長產品的貨架期，提高臨床使用安全性。
[0057] 下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明 而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條 件如 Sambrook 等人，分子克隆：實驗室手冊（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和 份數按重量計算。
[0058] 除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意 義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發明方法中。文 中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。
[0059] 通用方法
[0060] SEC-HPLC方法：按照《中華人民共和國藥典》（2010年版，三部）附錄IIIB進行測 定，用親水硅膠體積排阻色譜柱進行檢測，面積歸一化法計算樣品純度。
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