日本七鰓鰻基因重組蛋白rLj-RGD3在制備腦缺血再灌保護藥物中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明一種日本七鰓鰻基因重組蛋白rLj-RGD3在制備腦缺血再灌保護藥物中的應用，實驗結果證明日本七鰓鰻基因重組蛋白rLj-RGD3對缺血再灌注呈劑量依賴性降低神經功能損傷、呈劑量依賴性降低梗死面積比及可改善腦組織病理性形態學改變，日本七鰓鰻基因重組蛋白rLj-RGD3對缺血再灌注所引起的腦損傷有很好的保護作用，其保護作用優于依達拉奉和依非巴特，可應用于制備腦缺血再灌保護藥物。
【專利說明】日本七鰓鰻基因重組蛋白rLj-RGD3在制備腦缺血再灌保
護藥物中的應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種日本七鰓鰻基因重組蛋白rLj_RGD3的新用途，尤其是日本七鰓鰻基因重組蛋白rLj-RGD3在制備腦缺血再灌保護藥物中的應用。
【背景技術】
[0002]腦缺血性疾病嚴重威脅著人類的健康甚至生命，而缺血性腦中風已經成為人類死亡的主要原因之一。缺血性腦中風，又稱腦梗死，是一種由于局部腦組織缺血、缺氧導致腦組織軟化、壞死，進而在臨床上表現為相應神經功能缺失癥狀的疾病。
[0003]整合素家族為細胞黏附分子家族的重要成員，主要介導細胞與細胞、細胞與細胞外基質(ECM)之間的相互黏附，并介導細胞與ECM之間的雙向信號傳導。整合素介導的黏附作用調節著許多細胞功能，其中包括細胞凋亡、細胞增殖、細胞黏附與遷移、淋巴細胞歸巢等。目前，細胞外基質蛋白和整合素受體結合的特異性識別位點已經確定，為精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp，RGD)序列，即含有RGD序列的多肽能夠識別整合素受體蛋白并與之結合從而影響細胞的生物功能。
[0004]中國專利號為ZL200510083437.7、名稱為“具抗腫瘤作用的日本七鰓鰻口腔腺RGD模體蛋白的基因克隆與表達”的發明專利公開了三種日本七鰓鰻基因重組蛋白，包括日本七鰓鰻基因重組蛋白rLj-RGD3。rLj-RGD3cDNA序列351bp長，其蛋白質由117個氨基酸組成，含有三個RGD模體，其以NdeI和HindIII酶切位點構建于pET23b載體表達的帶有六個組氨酸標簽的基因重組蛋白分子量為11.934 kDa，可通過分子生物學方法獲得。目前，已有研究表明日本七鰓鰻基因重組蛋白rLj-RGD3具有抑制血管新生、抗血小板聚集的活性，但對其對急性腦缺血再灌注損`傷的保護作用尚無研究報道。

【發明內容】

[0005]本發明是發現了日本七鰓鰻基因重組蛋白rLj_RGD3對大鼠腦缺血再灌注致腦及遠隔器官損傷具有保護作用，從而發明了日本七鰓鰻基因重組蛋白rLj-RGD3在制備腦缺血再灌保護藥物中的應用。
[0006]本發明的技術解決方案是一種日本七鰓鰻基因重組蛋白rLj_RGD3在制備腦缺血再灌保護藥物中的應用。
[0007]實驗結果證明日本七鰓鰻基因重組蛋白rLj_RGD3對缺血再灌注呈劑量依賴性降低神經功能損傷、呈劑量依賴性降低梗死面積比及可改善腦組織病理性形態學改變，日本七鰓鰻基因重組蛋白rLj-RGD3對缺血再灌注所引起的腦損傷有很好的保護作用，其保護作用優于依達拉奉和依非巴特，可應用于制備腦缺血再灌保護藥物。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0008]圖1是不同實驗組大鼠MCA0/RF大腦中動脈閉塞/再灌注24 h后TTC染色結果圖。
[0009]圖2是不同實驗組對大鼠MCA0/RF腦梗死體積的影響示意圖。
[0010]圖3是不同實驗組大鼠MCA0/RF腦損傷組織HE染色圖。
【具體實施方式】
[0011]1.實驗組分組及給藥:健康雄性SD大鼠48只，體重280~320 g，實驗室條件適應性喂養一周，術前禁食12 h，自由飲水，隨機分為如下A~F組(每組8只):A-假手術組、B-模型組、C-rLj-RGD3 高(100.0 yg O'D-rLj-R ⑶ 3 低(50.0 yg -kg—1)劑量組、E-陽性對照藥依達拉奉(1.5 mg.kg-1)組和F-依非巴特(100 μ g.kg-1)組。各組大鼠經腦缺血2 h，恢復缺血區血流進行再灌注10 min后自舌下靜脈給藥，而假手術組和模型組給予等容量生理鹽水。
[0012]所用rLj_RGD3為按照上述專利方法所獲得的日本七鰓鰻基因重組蛋白rLj-RGD30
[0013]2.模型制備:10 %水合氯醛(0.35 mg.kg—1)腹腔注射麻醉后，將大鼠仰臥位固定于手術臺上，備皮，沿頸部正中切開皮膚，鈍性分離皮下組織。參照Zea Longal的大鼠大腦中動脈內栓線阻斷法(MCA0)，用線栓法阻斷大腦中脈，造成大腦中動脈供應區血流中斷，局灶性腦缺血。缺血2 h后，將栓線緩慢抽出，恢復缺血區血流進行再灌注24 h。假手術組只進行麻醉分離、暴露和結扎血管，不導入栓線。
[0014]大鼠經腦缺血2 h再灌注24 h后，以10 %水合氯醛(0.35 mg *kg_1)腹腔注射麻醉，自腹主動脈取血，制備血清待測；快速斷頭取腦進行TTC染色及HE染色。
[0015]3.觀察指標
3.1 TTC染色:取腦后并用生理鹽水沖洗殘血，切除嗅球、小腦以及低位腦干，間隔2mm冠狀切成5個連續腦片(第一刀于腦前極與視交叉連線中點處；第二刀于視交叉處；第三刀于漏斗柄部位；第四刀于漏斗柄與葉尾核之間)，置于2 %TTC緩沖溶液中，37 °C避光，水浴20 min，期間每隔7~8 min翻動一次使腦片染色均勻。TTC可被線粒體過氧化氫酶還原，會將正常腦組織染成紅色，缺血梗死區因無此反應而呈白色。
[0016]結果如圖1所示:圖1中A組:腦組織未見梗死灶，全腦均為紅色；B組:腦梗死體積最大；C -D各給藥組與模型組相比梗死面積均有顯著降低。
[0017]3.2腦梗死體積比:腦切片經TTC染色后，于10 %甲醛中固定。對每片腦片正反兩面進行拍照，利用Image Pro-Plus photoshop 6.0軟件計算出梗死體積,并計算腦梗死體積比。計算公式如下:梗死體積比=[(各片正反面梗死體積之和/2) X片厚/ (各片正反面總面積之和/2) X片厚]X 100%。結果如圖2所示:C、D和E、F組對腦梗死體積的影響與模型組比較均顯著降低(P〈0.05)，而且高劑量(100 μ g.kg—1) rLj-RGD3的作用與陽性藥依達拉奉1.5 mg.kg-1作用相當(p>0.05)，低劑量組(50 μ g.kg-1) rLj-RGD3的作用與同類藥依非巴特100 μ g.kg—1作用相當(p>0.05)，表明rLj-RGD3比上述兩種陽性藥物作用均強。
[0018]3.3組織形態學改變:HE染色后經光學顯微鏡下觀察腦組織病理形態學變化并拍照，結果如圖3所示:A組腦組織無水腫、充血等其他病理形態學損傷現象，細胞結構致密、邊界清晰，神經元形態結構完整、排列整齊，細胞核無固縮現象；B組大鼠腦組織大腦皮層有充血現象，細胞間質水腫，細胞周圍結構松散，神經元排列紊亂，部分神經元腫脹；c組、D組、E組、F組與模型組相比組織水腫減輕，細胞結構較致密，少量神經元腫脹，神經元損傷減輕，說明rLj-RGD3對缺血再灌注所引起的腦損傷有很好的保護作用，且其保護作用好于E組和F組。
[0019]通過實驗，可以得出如下結論:
神經功能評分和梗死面積比:缺血/再灌注后(2 h、24 h)，與假手術組相比，模型組大鼠有明顯的神經功能缺陷(神經功能學評分8.88,7.50);與模型組相比，rLj-RGD3呈劑量依賴性降低神經功能損傷(P〈0.01，高、低劑量神經功能學評分分別為4.50,3.25和5.88、4.62)。缺血/再灌注24 h后模型組梗死面積比較假手術組明顯升高(40.56 %);與模型組相比，rLj-RGD3呈劑量依賴性降低梗死面積比(p〈0.01)。
[0020]腦組織形態學改變:大鼠MCA0/RF缺血/再灌注后(2 h、24 h)，模型組大鼠腦組織水腫明顯，錐體細胞排列紊亂，細胞邊界不清楚，而rLj-RGD3可改善腦組織病理性形態學改變。`
【權利要求】
1.一種日本七鰓鰻基因重組蛋`白rLj-RGD3在制備腦缺血再灌保護藥物中的應用。
【文檔編號】A61P9/10GK103520704SQ201310407898
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年9月10日 優先權日:2013年9月10日
【發明者】李慶偉, 王繼紅, 呂莉, 陸倩, 于鳳, 張艷 申請人:遼寧師范大學