-WD融合基因進行凝膠電泳檢測，結果如圖1所示， 其中泳道Μ為Marker，CRD結構域片段大小為724bp，WD結構域片段大小為523bp，CRD-WD 融合基因為1213bp，與預期設計相符合。
[0039] 2、CRD-WD融合基因表達載體的構建
[0040] 分別采用限制性內切酶XbaI、PmeI對CRD-WD融合基因和慢病毒表達載 體pLVX-puro進行酶切，回收酶切片段之后，通過T4連接酶將CRD-WD融合基因片段與 pLVX-puro空載體片段相連接。連接反應完成后，連接產物轉化大腸桿菌DH5a感受態細 胞，培養過夜后，挑取單克隆，37°C培養，提取質粒并進行XbaI/PmeI酶切鑒定，最后進行 測序驗證；將所構建成功的重組子命名為pLVX-puro-CRD-WD，此即為重組靶向Wnt拮抗劑 融合基因表達載體。
[0041] 該融合基因pLVX-puro-CRD-WD酶切鑒定的電泳結果如圖2所示，其中泳道Μ為 標準分子量Marker。與對照相比，在pLVX-puro-CRD-WD經酶切的兩個片段中，一個與 pLVX-puro載體片段大小一致，另一個大小約1. 2kb。測序結果表明該重組慢病毒表達載體 pLVX-puro-CRD-WD構建成功。
[0042] 3、CRD_WD融合基因慢病毒的制備
[0043] 本發明采用慢病毒表達體系，而慢病毒在基因遞送、基因治療和轉基因動物研究 中已展示出優異的應用前景。重組慢病毒表達載體pLVX-puro-CRD-WD在脂質體介導下與 包裝質粒（PSPAX2)、包膜質粒（pMD2G)共轉染293T細胞，培養48-72小時后收集上清培養 液，經濃縮獲得重組的慢病毒并測定其滴度（7. 0X10nv.p. /mL)，隨后該重組慢病毒可進行 宿主細胞的感染或荷瘤鼠的局部注射。
[0044] 4、CRD-WD融合蛋白穩定表達細胞株的構建
[0045] 所用肝癌細胞株來自美國菌種保藏中心（ATCC)，相關細胞生物學實驗技術按常規 方法進行，細胞培養條件為37°C以及5%C02。將上述制備的重組慢病毒感染肝癌！fepG2 細胞，48h后加入濃度為2μg/mL的嘌呤霉素篩選，經過兩周的持續篩選，獲得陽性克隆 HepG2-CRD-WD細胞，提取細胞總蛋白，通過Westernblot檢測Flag融合蛋白的表達，結果 如圖3所示，與空載體對照相比，！fepG2-CRD-WD細胞大量表達CRD-WD融合蛋白，表明已成 功地構建了穩定表達CRD-WD融合蛋白的細胞株。
[0046] 5、CRD-WD融合蛋白抑制Wnt信號的活化
[0047] 采用T0PFLASH分析技術檢測Wnt信號的活性。T0PFLASH質粒含有3個LEF1/TCF 結合位點從而啟動螢火蟲熒光素酶基因的表達，經熒光素底物結合后發出可檢測的熒光， 其對照為F0PFLASH，除LEF1/TCF結合位點突變外其余與F0PFLASH相同。pGL4. 74的海腎 熒光素酶活性用于表征轉染效率。將人肝癌細胞ifepG2及Η印G2-CRD-WD細胞接種到24孔 板中，然后共同轉染SuperTOPflash質粒、SuperFOPflash質粒以及pGL4. 74質粒，24小 時后，裂解細胞，提取上清，通過Promega公司的雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒分別檢測 螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的活性，結果如圖4所示，CRD-WD融合基因表達能夠明顯 下調TCF-4的轉錄活性，表明CRD-WD融合蛋白能顯著抑制Wnt信號的活化，抑制率為84% (Ρ〈0· 01) 〇
[0048] 6、CCRD-WD融合蛋白穩定表達細胞株的細胞致瘤性，抑制率為80% (Ρ〈0. 01)
[0049] 6. 1CRD-WD融合蛋白穩定表達細胞的大規模制備
[0050] 將Η印G2-CRD-WD細胞接種到ρ100培養皿中。當細胞在培養皿中匯合度達到 80% -90%時，0. 25%胰酶消化細胞，加入含10%FBS的DMEM培養基終止消化。部分細胞用 于Westernblot檢測蛋白量，收集剩余大部分細胞，1500rpm離心5min，棄上清。用無FBS 的DMEM培養基重懸細胞，1500rpm離心5min，棄上清。用已滅菌的1XPBS以同樣方式清 洗細胞三次，洗掉殘留的血清和抗生素。收集細胞，用1XPBS制備細胞懸液。血球計數板 計數。將細胞濃度調整為5X107cells/mL。
[0051] 6· 2腫瘤皮下異種移植模型的構建
[0052] 選取雌性BALB/C裸鼠，待其生長到6周進行腫瘤生成實驗。實驗分為兩組，每 組十只。取lmL注射器（褐色針頭，0.45X16RWLB)在無菌條件下吸取制備好的細胞懸 液（5X107cells/mL)，每只裸鼠右頸部注射100yL細胞懸液（5X106cells/mouse)。標記 每只裸鼠，在無菌條件下飼養。每隔兩天測量裸鼠腫瘤長軸及短軸的長度，根據公式V= 0. 5236XQXL2計算腫瘤體積，其中h為腫瘤長軸，L2為腫瘤短軸。30天后安樂處死裸鼠， 剝離腫瘤，稱取腫瘤重量。腫瘤經PBS清洗后，4%甲醛固定過夜，石蠟包埋，切片和制備可 以供顯微鏡觀察的載玻片。組織切片進行蘇木精伊紅（H&E)染色和免疫組化，結果如圖5 所示，與對照相比，HepG2-CRD-WD細胞的致瘤性顯著下降，抑瘤率為80%。上述結果清楚表 明，靶向Wnt信號通路的CRD-WD融合蛋白具有顯著的體內抗癌活性，可作為腫瘤基因治療 的藥物或用于制備抗癌藥物。
[0053] 7、His-CRD-WD重組蛋白的表達、純化及抗腫瘤應用
[0054] 首先，通過上述的分子生物學手段將CRD-WD融合基因亞克隆到原核表達載體 pET28a上并轉化至大腸桿菌BL21 (DE3)中，當轉化子生長至0D600值為0. 5時，加入終濃 度為0. 4mM的IPTG于16°C條件下誘導目的蛋白Frzb的表達，4°C，2000Xg離心15min收 集細胞，采用冰浴裂解緩沖液（lXPBS，300mmol/LNaCl，pH7. 4)重懸細胞，經超聲裂解后 于4°C，10000Xg離心30min收集上清可溶部分。其次，采用固定化金屬親和層析（IMAC) 方法純化Frzb重組蛋白。取lmL鎳-NTA瓊脂糖凝膠FF預裝柱，用10mL平衡緩沖液平衡， 破碎上清10mL樣品以0. 5mL/min上樣，2mL/管分管收集，用含500mM咪唑的緩沖液洗脫目 的蛋白，隨后目的蛋白通過SephadexG15凝膠層析去除咪唑，并將緩沖體系更換為20mM Tris-HCl，pH8. 0。最后，將獲得的重組蛋白應用于小鼠抗腫瘤作用。
[0055] 通過人肝癌細胞Η印G2皮下注射4-6周齡的雌性裸鼠構建移植瘤模型，具體為每 只裸鼠皮下接種5X106個Η印G2細胞，7天后，待腫瘤長至直徑6-7mm時，將裸鼠隨機分為三 組，分別為對照組（PBS陰性對照），小劑量組（5mg/kg)，大劑量組（20mg/kg)，然后將純化后 的融合蛋白通過皮下注射的方式處理分組后的裸鼠，間隔一天給藥，給藥10次，每天監測 腫瘤的生長情況，待對照組的腫瘤體積達到2000mm3時，將所有老鼠處死，解剖，測定腫瘤體 積和重量。最終實驗結果顯示，與對照組相比，高低劑量組移植瘤的生長均受到明顯抑制， 其抑制率分別為75%和60%，在實驗治療期間，動物體重有所增加，一般狀況良好，表明動 物可耐受所給劑量。因此，融合蛋白CRD-WD可以明顯抑制并殺傷腫瘤細胞。
[0056]

【主權項】
1. 一種重組靶向Wnt拮抗劑CRD-WD融合基因，其特征在于：將sFRP家族蛋白的CRD區 域與WIF-1的WD區域通過柔性氨基酸接頭連接，柔性氨基酸序列為：GSGSGS。2. -種重組靶向Wnt信號通路融合蛋白CRD-WD，其特征在于：所述蛋白由權利要求1 所述的重組靶向Wnt拮抗劑CRD-WD融合基因編碼，其氨基酸序列如SEQIDNO. 1所示。3. 如權利要求2所述的重組靶向Wnt信號通路融合蛋白CRD-WD在制備治療Wnt信號 異常的病癥的藥物中的應用。
【專利摘要】本發明涉及一種重組靶向的Wnt信號通路融合蛋白及其在制備抗癌藥物中的應用，屬于生物醫藥技術領域。本發明構建了基于sFRP家族蛋白的CRD結構域和WIF-1的WD結構域，所構建的融合蛋白具有抑制Wnt信號并顯著抑制裸鼠皮下移植瘤的生長，通過裸鼠皮下異種移植模型，該融合蛋白能顯著抑制裸鼠皮下移植瘤的生長，其抑制率為80％(P<0.01)。可應用于抗腫瘤藥物的制備或作為基因治療的藥物。
【IPC分類】C07K19/00, A61K38/17, C12N15/62, A61P35/00
【公開號】CN105420260
【申請號】CN201511026493
【發明人】唐亞雄, 曾中秋
【申請人】中國科學院成都生物研究所
【公開日】2016年3月23日
【申請日】2015年12月31日