一種新的短小芽孢桿菌漆酶基因及其表達與應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種漆酶基因，尤其是一種短小芽孢桿菌L-9的漆酶基因及其表達與 應用，屬于生物工程技術領域。
【背景技術】
[0002] 漆酶〇^(：(^%3.(：.1.10.3.2)是一種含銅多酚氧化酶，能催化酚類物質的氧化還 原反應，在木質素及其前體類似物的生物降解中發揮重要作用。漆酶的氧化底物極為廣泛， 包括酚類及其衍生物、芳胺及其衍生物、芳香羧酸及其衍生物等，因此漆酶應用潛力巨大。 在木材加工領域，漆酶能代替化學膠合劑，不但能提高產品質量，而且能減輕對人體健康的 傷害及對環境的污染;在造紙工業中，漆酶用于紙張生物漂白和制漿，可減少制漿造紙廠的 污染，有助于造紙業最終實現清潔生產;在食品加工領域，漆酶可用于除去果汁中酚類化合 物引起的混濁，從而提高果汁的質量。此外，漆酶還可氧化氯酚及其衍生物，降低其毒性，減 少以氯酚類為工業原料生產染料、防腐劑、除草劑、殺蟲劑等化工產品而造成的環境污染。
[0003]漆酶按來源不同可分為三大類:植物漆酶、真菌漆酶和細菌漆酶。植物漆酶主要由 漆樹漆液分離而得。真菌漆酶來源更為廣泛(存在于多種擔子菌中），具單電子氧化還原電 位高、催化活性強等優點，既能催化底物的氧化聚合又能對木質素進行催化降解，是一直以 來人們重點研究的漆酶種類。細菌漆酶則發現相對較晚，最初是1993年由Givaudan等人首 先在一種生脂固氮螺菌中鑒定出來的。隨后，科研人員又陸續在交替單胞菌、大腸桿菌、假 單胞菌、粘質沙雷氏菌、球形芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、極端耐堿芽孢桿菌、灰色鏈霉菌等細 菌中發現了不同種類的具漆酶活性的功能蛋白，如枯草/地衣/短小芽孢桿菌的CotA蛋白、 海單胞菌的PpoA蛋白、大腸桿菌的CueO蛋白、灰色鏈霉菌的EpoA蛋白等，這些細菌漆酶與真 菌漆酶蛋白結構相似，都具有4個銅離子結合位點。
[0004]由于真菌來源漆酶在工作環境pH偏堿性時活性非常低或幾乎沒有，熱穩定性也較 差，且絲狀真菌生長周期長，培養基要求高，菌絲在發酵罐中易受到高剪切力的損傷，這大 大限制了真菌漆酶在工業上的應用。研究揭示，細菌來源漆酶雖氧化活性普遍略低于真菌 來源漆酶，然而它們往往具有一些自身獨特的優點：如無需糖基化修飾、熱穩定性好、酶活 性的最適pH范圍廣等，這些性質正是目前漆酶工業應用所急需的。
[0005]據最新資料統計，我國每年印染廢水排放量占總工業廢水排放量的35%，己成為 危害最大的重要污染源，大部分合成染料都難以被微生物降解。這些染料化合物通常被用 于紡織、食品、塑膠和生物醫學的著色劑，每年全世界商用染料使用達7X105噸，種類達IX 1 〇4種，其中5~10 %的染料都以工業污水形式排放出來。有色污水直接釋放到環境中，許多 染料在厭氧環境下可能轉化為有毒物質或致癌物質，眾多國家相繼都頒布了嚴厲的法規來 限制工業染料污水的排放。由于染料自身特殊的化學結構，使用物理或化學法(凝結、臭氧、 活性炭)處理往往效果不佳，且還易造成二次污染。研究表明，生物法(使用漆酶、錳過氧化 物酶等)具有脫色率高、運行成本低、綠色環保的優勢，是處理印染廢水的潛在有效手段，是 當前印染廢水脫色研究的熱點。絕大多數排放的工業印染污水往往溫度很高且pH值偏堿。 在各類來源的漆酶中，真菌漆酶由于只在pH偏酸環境下具有較好的脫色效果，在偏堿性條 件下難以發揮作用，且耐熱溫度低于細菌漆酶，所以細菌漆酶憑借其獨特優勢在工業印染 廢水處理中更具應用潛力。
[0006]因此，挖掘能耐受高溫和高pH值(耐堿)條件的細菌漆酶基因并實現規模化生產具 有重要研究意義和應用價值。
[0007] 本研究組在先專利申請201310261242.1中，公開了一種漆酶基因，來源于短小芽 孢桿菌，以SGZ為底物時，最適作用pH為7.2;以2，6-DMP為底物時，最適作用pH為7.8，最適作 用pH值均高于(耐堿性能力)其他已報道過的微生物來源漆酶;該漆酶以SGZ為底物時，最適 作用溫度為80°C，核苷酸序列如SEQIDNO. 1所示。如何進一步提高生物酶的高溫穩定性需 要進一步做出研究。

【發明內容】

[0008]本發明的第一個目的在于提供一種新的漆酶基因cotA，其核苷酸序列為在核苷酸 序列為SEQIDNO. 1所示核苷酸序列基礎上經堿基的缺失、取代、插入或突變而成的高溫穩 定的漆酶。
[0009] 所述突變位點為第57位Lys突變為Thr、第120位Lys突變為Thr。
[0010] 所述基因編碼的蛋白質及含有所述基因的轉基因細胞系、基因工程菌、表達載體 或克隆載體均屬于本發明保護的范圍。
[0011] 本發明的第三個目的在于提供上述重組漆酶在印染廢水脫色中的應用，尤其是對 偶氮類和蒽醌類染料脫色的應用。
[0012] 本發明分析了純化的重組漆酶對2種代表性偶氮類和2種代表性蒽醌類染料的脫 色作用，偶氮類染料和蒽醌類染料是目前印染工業上使用量最大的兩種染料類型。實驗結 果顯不在堿性環境pH9.0,90°C溫度作用10h后，該漆酶對2種偶氮類染料reactivered11 和reactiveblue171的脫色率分別達到98%以上，對2種蒽醌類染料reactiveblue4和 reactivebri11iantblue的脫色率分別達到96%以上。控制溫度在90°C，2小時后，酶的剩 余活力為85%，10小時后，酶的剩余活力為75%，具有優異的高溫穩定性。
[0013]本名提供的漆酶具有良好的脫色效果，同時具有優秀的高溫穩定性，具有很廣的 應用前景。
【具體實施方式】
[0014]在本發明中所使用的術語，除非有另外說明，一般具有本領域普通技術人員通常 理解的含義。
[0015]下面結合具體的制備實施例和應用實施例，并參照數據進一步詳細地描述本發 明。應理解，這些實施例只是為了舉例說明本發明，而非以任何方式限制本發明的范圍。
[0016]在以下的實施例中，未詳細描述的各種過程和方法是本領域中公知的常規方法。
[0017]實施例1CotA基因的獲得
[0018] 通過化學全合成或定向突變基因克隆方法獲得在核苷酸序列為SEQIDNO. 1所示 核苷酸序列基礎上經堿基的缺失、取代、插入或突變而成的高溫穩定的漆酶。
[0019] 所述突變位點為第57位Lys突變為Thr、第120位Lys突變為Thr。
[0020]實施例2漆酶的大腸桿菌重組表達、純化、活性染色及免疫印跡鑒定[0021] 將獲得的CotA基因序列克隆到商業化表達質粒pColdII(TaKaRa公司），構建重組 質粒pColdll-cotA。隨后將pColdll-cotA轉化大腸桿菌表達菌株BL21(DE3)，通過氨芐抗生 素平板篩選陽性轉化子，隨后利用IPTG進行漆酶的誘導表達。
[0022]培養基成分為:胰蛋白胨(Tryptone) 10g/L，酵母提取物(Yeastextract)5g/L，氯 化鈉(NaCl)lOg/L，pH7.4。誘導表達條件為:將重組表達質粒pColdll-cotA轉化大腸桿菌 BL21(DE3)，含重組質粒的工程菌在37°C條件下培養至0D6Q() = 0.5,隨后轉入15°C培養并加 入終濃度為O.lmM的IPTG，誘導表達24h，轉速160rpm。誘導表達后，超聲破碎菌體，利用Ni+ 柱親和層析法純化得到可溶性漆酶，咪唑洗脫濃度為500mM。
[0023]實施例3純化的B.pumilus L-9重組漆酶高溫穩定性分析
[0024]采用常規測定方法，使用SGZ作為底物，反應pH為6.9。1個酶活單位定義為1分鐘內 氧化1以1底物362所需的酶量。控制溫度在90°(3,2小時后，酶的剩余活力為85%，10小時后， 酶的剩余活力為75%，體現出了優異的高溫穩定性。
[0025]實施例4漆酶在堿性條件下對偶氮類和蒽醌類染料的脫色率測定。
[0026]本發明分析了純化的重組漆酶對2種代表性偶氮類和2種代表性蒽醌類染料的脫 色作用，偶氮類染料和蒽醌類染料是目前印染工業上使用量最大的兩種染料類型。實驗結 果顯不在堿性環境pH9.0,90°C溫度作用10h后，該漆酶對2種偶氮類染料reactivered11 和reactiveblue171的脫色率分別達到98%以上，對2種蒽醌類染料reactiveblue4和 reactivebrilliantblue的脫色率分別達到98%以上。以上數據表明該漆酶良好的脫色 效果與堿性穩定性。
[0027]雖然本發明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發明，任何熟悉此技 術的人，在不脫離本發明的精神和范圍內，都可做各種的改動與修飾，因此本發明的保護范 圍應該以權利要求書所界定的為準。
【主權項】
1. 一種新的短小芽孢桿菌漆酶基因cotA，其特征在于其核苷酸序列為在核苷酸序列為 SEQIDNO. 1所示核苷酸序列基礎上經堿基的缺失、取代、插入或突變而成的高溫穩定的漆 酶。2. 權利要求1所述的短小芽孢桿菌漆酶基因cotA，其特征在于所述突變位點為第57位 Lys突變為Thr、第120位Lys突變為Thr。3. 權利要求1所述基因編碼的蛋白質。4. 含有權利要求1所述基因的轉基因細胞系。5. 含有權利要求1所述基因的基因工程菌。6. 含有權利要求1所述基因的表達載體或克隆載體。7. 根據權利要求5所述的基因工程菌，其特征在于，優選重組大腸桿菌E.coliBL21 (DE3)〇8. -種權利要求7所述生產漆酶的重組大腸桿菌的構建方法，其特征在于，選取大腸桿 菌冷休克表達載體pColdll，構建重組表達載體pColdll-cotA，以大腸桿菌E.coliBL21 (DE3)為宿主進行表達。9. 一種權利要求7所述生產漆酶的重組大腸桿菌生產漆酶的方法，其特征在于，利用 IPTG對重組菌產漆酶進行誘導表達;所述誘導表達條件為IPTG誘導終濃度為O.lmM，誘導溫 度15°C，誘導時間24h，轉速160rpm;培養基成分為:胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化 鈉10g/L，pH7.4。10. 權利要求1所述基因在印染廢水脫色中的應用。
【專利摘要】本發明公開了一種新的短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)漆酶基因突變體及其重組表達與應用，屬于生物工程領域。本發明公開的漆酶突變體具有良好的耐堿性和耐高溫能力佳的優點，耐高溫可高達90℃對偶氮類染料和蒽醌類染料均具有很好的脫色效果，具有重大應用潛力。
【IPC分類】C02F101/16, C12N9/02, C12N15/53, C12N15/63, C12N1/21, C02F3/00
【公開號】CN105420253
【申請號】CN201510918392
【發明人】管政兵, 廖祥儒, 張寧, 宋晨萌
【申請人】江南大學
【公開日】2016年3月23日
【申請日】2015年12月11日