用于生產重組興趣蛋白的方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及通過使用攝病毒技術的自我蛋白酶NP"來重組生產所需的興趣異源多 膚的方法。
【背景技術】
[0002] 大腸桿菌巧.coli)被廣泛用于大量表達治療性蛋白。對于醫療應用，同源 (homogeneous)N端是重要的，但是通過甲硫氨酸氨膚酶對N-甲酯甲硫氨酸去除不全的話 可能導致不希望的微觀不均一'性（microheterogeneity)。此外，基因融合技術通常用于重 組蛋白的表達。一些常用的融合標簽（例如谷脫甘膚-S-轉移酶（GST)、麥芽糖結合蛋白 (MB巧或者硫氧還蛋白）介導溶解度，而其它的（例如聚-His、FLAG、Str巧II或者巧調蛋 白結合膚（CB巧）則作為親和標簽使得易于純化。基因融合技術需要通過具有不同切割效 率和特異性的酶或者化學切割，將標簽從最終蛋白產物中去除。自我切割標簽（如內含膚、 分選酶A(SdA)、化pC蛋白或者半脫氨酸蛋白酶結構域（CPD)化及NPm自我蛋白酶）為制 藥相關蛋白的表達提供了一種有用的替代方案。Li,Biotech.Let. 33(2011) :869-881中公 開了用于重組蛋白生產的自我切割融合標簽；Xing等人，Microb.CellFact. 10(2011) :42 報道了使用可切割的自聚集標簽進行的流線型（streamlined)蛋白表達和純化。
[0003] 異源蛋白在大腸桿菌中的過度表達經常導致致密的聚集和沉積、不溶性的顆粒， 也被稱為包涵體。在包涵體中表達的優點是所需產物為高純度，W及在細胞破碎后容易通 過離屯、進行純化。然而，關鍵的步驟是溶解蛋白并將其再折疊成其天然結構。溶解通常在 高濃度的離液序列高的試劑（如尿素或者鹽酸脈）中進行，W達到完全的展開。加入還原 劑（如2-琉基乙醇（P-ME)、二硫蘇糖醇值TT)或者1-硫代甘油（MTG))W減少非天然的 分子間和分子內二硫鍵，并使得半脫氨酸保持其還原狀態。再折疊時啟動自我蛋白酶解的 切割和隨后融合配偶體（partner)的釋放，其遵循單分子反應，且反應速率只依賴于離液 劑濃度扣eberbacher等人，ProcessBiochem. 44(2009), 1217-1224)。
[0004] 瓶頸步驟是蛋白的復性。在再折疊的第一步，消除疏水分子間的相互作用 對于在高蛋白濃度中成功復性是關鍵的，并防止聚集（Vallejo等人，Microb.Cell Fact. 3(2004)，11)。多種復性技術是已知的。通過稀釋進行再折疊，由于其簡單性，而優于 壓力處理或者色譜技術，尤其是在規模生產時。在單一步驟中減少蛋白濃度W及離液劑濃 度，防止通過分子間的相互作用而聚集。然而，大體積和低蛋白濃度給下游加工步驟帶來負 擔（Jungbauer等人，J.Biotech. 128 (2007), 587-596)。

【發明內容】

[0005] 因此，本發明的一個目的是提供包涵體的復性改善，包涵體必須是復性的，尤其是 對于方法下游的自我蛋白酶解切割和重組蛋白的制備。優選地，本發明應當實現小體積和 高的蛋白濃度W獲得興趣蛋白，并提供一種適于在工業生產規模建立的方法，特別是對于 醫藥用途的蛋白。此外，將自我蛋白酶的復性步驟和興趣蛋白的復性步驟分開也是有益的， 將有助于實現高度特異性的復性條件。
[0006] 因此，本發明提供一種用于生產重組興趣蛋白的方法，特征在于如下步驟：
[0007] (a)提供包涵體中的包含NPm自我蛋白酶部分（moiety)和興趣蛋白部分的融合蛋 白，
[000引 化）溶解所述包涵體，
[0009] (C)允許所述NP"自我蛋白酶部分在離液序列高的條件下切割所述融合蛋白，其 中所述重組興趣蛋白從所述融合蛋白中切割下來，W及其中所述重組興趣蛋白尚未復性或 同時復性，W及
[0010] (d)回收所述興趣蛋白，任選地包括所述興趣蛋白的復性步驟。
[0011] 本發明是通過使用攝病毒技術的自我蛋白酶NP"在所需興趣異源多膚的重組生產 中的改進。運種技術通常提供在宿主細胞（通常是原核宿主細胞，例如大腸桿菌）中融合 多膚的重組表達，其中融合多膚包含直接或者間接源自攝病毒自我蛋白酶NPm的自我蛋白 酶解部分W及異源興趣多膚。異源多膚或者興趣蛋白通過膚鍵與NP"分子共價偶聯。通過 水解化roC端切S168和融合多膚169位置之間的膚鍵，將興趣蛋白從融合蛋白中釋放，其 中融合多膚169位置代表根據本發明待生產的興趣蛋白的真實N端氨基酸。在宿主細胞中 W細胞質包涵體（IB)的形式生產異源興趣多膚，然后按照運樣的方式分離并處理包涵體， 即通過NPm的自我蛋白酶解活性將所需的異源多膚從融合多膚中切割下來。
[0012] 因此，包含攝病毒的自我蛋白酶NP"的融合多膚，對于生產異源重組多膚而言特別 有用。NP"是長度為168個氨基酸的自我蛋白酶，并且體內表觀Mf約20kD。它是攝病毒多 聚蛋白（polyprotein)中的第一蛋白，并且進行自我蛋白酶解切割從其后的核衣殼蛋白C 上切割下來。在NP"序列中的最后一個氨基酸切S168后發生運種切割。攝病毒自我蛋白 酶NPm的活性總是在運一明確的位點上切除融合配偶體，釋放具有同源N端的興趣多膚。此 夕F，通過應用特殊的緩沖液可W在體外誘導NPm的自我蛋白酶解活性，從而通過切割IB中 表達的融合多膚而獲得興趣多膚。
[0013] 此技術中使用的來自傳統豬攝病毒（CSFV)的N端自我蛋白酶NP"用作尤其是在大 腸桿菌中大量表達治療性蛋白的有吸引力的工具。醫藥應用需要重組蛋白的真實N端，運 可W通過N端融合的NP"自我蛋白酶的自我切割來實現。此外，NP"融合技術也允許表達小 的或者毒性的膚，在其合成之后宿主細胞蛋白酶將立即降解小的或者毒性的膚（Achmilller 等人，化t.Methods4(2007), 1037-1043)。由于N。"融合蛋白在大腸桿菌中的表達導致不 溶性聚集物（被稱為包涵體）的形成，需要適當的溶解和復性操作W便獲得生物活性的蛋 白。
[0014] 如已經提到的，在大多數情況下，溶解是在高濃度離液序列高的試劑（如尿素或 者鹽酸脈）中進行的，同時組合使用還原劑來消除錯誤形成的二硫鍵。通過稀釋進行再折 疊由于其簡單性而廣泛用于起始復性。因此，加入大量的緩沖液W提供允許形成正確生物 活性結構的條件。因此，根據本發明，應用了在高尿素濃度時顯示出切割活性的自我蛋白 酶。運使得能夠顯著降低溶解步驟后所需緩沖液的量，從而降低成本。此外，如果祀標蛋白 和自我蛋白酶需要不同的復性條件，運兩個步驟可W分開，運給運種優選實施方式增加了 另一優點。在高離液序列高的條件下自我蛋白酶的活性將自我蛋白酶的復性步驟和祀標蛋 白的復性步驟分開，從而能夠實現高度特異性的復性條件。實際上，興趣蛋白的復性可W和 自我蛋白酶的切割步驟分開，使得更好地控制興趣蛋白的回收。在運種情況下，然后可w在 隨后的任何階段和不同的地方，使興趣蛋白獲得充分的活性。在現有技術中，自我蛋白酶部 分（其導致融合蛋白的切割）的活性恢復總是和包含興趣蛋白部分的整個融合蛋白的復性 直接相關。本發明優選的實施方式允許將自我蛋白酶和祀標蛋白的再折疊分開。
[0015] 因此，在一個優選的方法中，在重組生產系統中，優選在原核宿主細胞中，尤其是 在大腸桿菌宿主細胞中產生包涵體。
[0016] 步驟化）的優選條件對應著大于5M，優選大于6M，尤其是大于7. 5M的尿素濃度。 "對應著"表示尿素按照指定的量存在，或者存在某一濃度的另一種離液序列高的物質（如 下醇、乙醇、鹽酸脈、高氯酸裡、氯化儀、苯酪、丙醇、十二烷基硫酸鋼、硫脈等，或者不同離液 劑的組合，如尿素和鹽酸脈的混合物），使得產生了相同的離液序列高的效果（測量為系統 賭的增加）。例如，優選的鹽酸脈濃度大于2. 5M，優選大于3M，尤其是大于3. 75或者甚至大 于4M。優選地，在步驟化）中，通過讓包涵體經歷變性條件進行包涵體的溶解。
[0017] 步驟（C)中優選的離液序列高的條件對應著1. 4至5M，優選2至5M，尤其是2至 4M的尿素濃度。步驟（C)中優選的鹽酸脈濃度是0. 7至2. 5M，優選1至2. 5M，尤其是1至 2M。同樣，也可應用不同離液劑的組合，如尿素和鹽酸脈的混合物。
[0018] 術語"穩液劑化osmotrope)"(有序的制造者）W及"離液劑（chaotrope)"(無序 的制造者）原初分別表示使蛋白和膜穩定或者不穩定的溶質。而后，它們分別設及增加或 減少水結構化的明顯相關性質。運種性質隨環境、確定的方法或所研究的溶劑化殼的不同 而不同。穩液劑的替代術語是"補償性溶質"，因為發現它們在滲透脅迫的細胞中補償高鹽 含量（其破壞水的天然氨鍵合網絡）的不利影響。氨鍵的程度和強度兩者都可W獨立地被 溶質所改變，但是二者可能并且已經用作制造秩序（ordermaking)的量度。然而，對質量氨 鍵程度的影響是非常重要的。穩液劑的擴散轉動（difTusionalrotation)可能擾亂穩液 劑的秩序效果，和水合程度更小的離液劑相比，擴散轉動產生與周圍主體水化ulkwater) 之間更廣泛更加無序的無組織連接區（disorganized化nctionzones)。大多穩液劑不會 引起水中大規模的網狀結構。
[0019] 離子穩液劑（或："抗離液劑（antichaotropes)"，用于和非離子穩液劑區分開） 應該和非離子穩液劑區別處理，主要是因為周圍水分子的定向和極化（polarized)排列。 一般來說，離子行為和霍夫梅斯特序列化ofmeisterseries)相符合（parallel)。具 有低電荷密度的大單電荷離子（如SCN、H2PO4、服〇4、肥〇3、I、Cl、n〇3、饑V、cs\r、 (NH2)3(T(脈）和（CH3)4妒（四甲基錠）離子；和水與自身的相互作用相比，呈現與水更弱的 相互作用，因此較少干擾周圍水的氨鍵）是離液劑，而具有高電荷密度的小或多電荷的離 子是穩液劑（如S〇42、冊〇42、Mg2\Ca2\Li\化\H\ 0H和HP042，和水與自身的相互作用 相比，呈現出與水分子更強的相互作用，因此能夠破壞水-水氨鍵）。單電荷離液序列高的 離子的半徑對于陽離子而言大于;1.06AL義及對于陰離子而言大于1.78A。因此，在離子穩液 劑附近的水分子之間的氨鍵比在離子離液劑附近的破壞更嚴重。增強運一結論，圍繞面化 物離子F、C1、化和I的水的氨鍵結構拉曼光譜研究表明，水氨鍵的總程度隨著離子大 小的增加而增加，W及皿〇:〇2〇的IR研究顯示在運些面化物離子周圍緩慢的氨鍵重新定 位（reorientation)，相對于不斷增加的大小變得更緩慢。溶質可能加強周圍的一些氨鍵 (構建結構；如穩液性的陽離子將加強內殼水分子所貢獻的氨鍵）而同時破壞一些其它氨 鍵（破壞結構；如穩液性的陽離子會削弱由內殼水分子所接納的氨鍵），運并非不合理。其 它等同的因素，具有凈電荷的分子比沒有凈電荷的分子更加強烈地結合化old)水分子；正 如兩性離子氨基酸和陽離子氨基酸之間的差異所示。
[0020] 強烈的水-水相互作用可能將弱水合的離子（離液劑，K\^\Cs\Br、1 '脈+)"推" 向弱水合的表面，當離子-水的水合強度大致等于主體溶液中水-水相互作用的強度時 (化+位于強的一側的邊緣而C1位于弱的一側的邊緣），發生強離子水合向弱離子水合的過 渡。對兩個重要離液劑（脈和硫氯酸根離子）的中子衍射研究表明它們的水合非常差，運 支持了運樣的見解，即它們優先與蛋白而不是與水相互作用。不同于穩液劑，離子和非離子 離液劑屬性之間有很小的顯著差異，是因為前者的電荷密度低。
[0021] 鹽對生物大分子的最佳穩定化需要穩液性陰離子與離液序列高的陽離子的混合 物。
[0022] 離液劑破壞水的氨鍵合網絡，從而使大分子結構上更自由，并有助于蛋白延伸和 變性。穩液劑是穩定化溶質，其增加水的秩序（如多徑基醇、海藻糖、S甲胺N-氧化物、甜 菜堿、四氨喀晚（ectoine)、脯氨酸和各種其它兩性離子），而離液劑產生更弱的氨鍵，降低 水的秩序，增加其表面張力和使大分子結構不穩定（如高濃度的鹽酸脈和尿素）。最近的工 作表明，尿素削弱氨鍵和疏水性相互作用，而葡萄糖用作穩液劑，提高運些特性。因此，當尿 素分子小于最佳水合時（每摩爾尿素約6-8摩爾水），在沒有足夠水的情況下尿素的氨結合 其自身和蛋白（顯著參與膚的鏈接），從而變得更疏水，因此更加能夠與蛋白上的其它位點 相互作用，導致局部脫水引起變性。脈是平面離子，圍繞其邊緣可形成弱的氨鍵，但可W和 蛋白的簇酸建立起強烈結合的氨鍵離子對，運類似于常見的季錠結構的精氨酸-簇酸"鹽" 鏈接。此外，脈具有相當疏水的表面，可與相似的蛋白表面相互作用使蛋白變性。通過疏水 位點之間的滑動，運兩種變性劑可引起蛋白膨脹并解構，W及最終拖到氨結合的水當中從 而使變性完全。
[0023] -般來說，通常在必要的高濃度下，根據水的物理主體性質確定溶質的穩液/離 液序列高的性質。例如使用NMR或者振動光譜，可能會發現結構化程度的變化。穩定蛋白 的溶質（穩液劑）增加氨鍵的程度（降低質子和"0自旋-晶格弛豫時間），而NMR化學位 移可能增加（顯示更弱的鍵合，如兩性離子穩液劑，S甲胺N-氧化物）或者降低（顯示更 強的鍵合，如多徑基穩液劑，海藻糖）。海藻糖顯示出化學位移和弛豫時間的降低，蛋白穩定 劑（NH4)2S04程度更小，而化C1僅顯示出化學位移的降低，W及蛋白去穩定劑KSCN顯示出 弛豫時間的增加和化學位移的降低。振動光譜可W利用5200cm1附近的近紅外波長（V2+V3 的組合），當氨鍵更強時向更長的波長（更小的波數）遷移。
[0024] 最重要的穩液劑之一是非還原糖a，a-海藻糖。或許應當指出的是，海藻糖由于 沒有變旋作用，它比還原糖具有更靜態的結構，或者其它常見的非還原二糖薦糖，因為它缺 失巧喃環。
[0025] 因此，術語"離液序列高的條件"應單獨地根據液體起始制劑（例如可W是溶液、 懸液、乳液、雙或=相液體系統等）的性質進行考慮，尤其是在制劑水相上包含不止一相 的制劑中。根據本發明的方法步驟（C)中優選的離液序列高的條件是對應著1.4至5M 尿素濃度的條件（尤其是在緩沖鹽溶液中，如8.0g化C1、0. 2gKCl、1.44gNa2HP〇4、0. 24g KH2PO4用A.dest補充至1000ml，用肥1調節至抑7. 4)。通過上述提及的方法W及通過 采用霍夫梅斯特序列的教導，能夠輕易地確定離液序列高的條件的對應關系（w及離液性 (chaotropicity)的降低（"更低"或"更少""離液序列高的條件"））。在各個情況下，應 當核實起始液體中各種物質的添加，W便為結合提供最佳的結合/非聚集條件。例如，應優 化對還原試劑的使用，W對應著0. 05至50mM二硫蘇糖醇值TT)的量，尤其是0. 1至lOmM 的DTT。此外，如上所述添加去污劑可能影響起始制劑的離液性。
[0026] 在本發明的含義中術語"變性的形式"（或"非再折疊的形式"）是指作為重組生 產過程的產物而獲得的，通常是在溶解包涵體之后獲得的表達的融合蛋白的生物非活性形 式（在運樣一種條件下，在此條件下融合蛋白的天然=維結構被破壞）。
[0027] 術語"再折疊"（或"復性"）是指運樣一種機制，在其中溶解的蛋白或者部分蛋 白（如果復性的話，所述部分與該部分的特定活性有關）恢