靶向治療性溶酶體酶融合蛋白及其用圖
【技術領域】
[0001] 本發明主張2012年11月27日申請的美國臨時發明第61/730, 378號及2013年3 月15日申請的美國臨時發明第61/788, 968號的優先權益，所述臨時發明以全文引用的方 式并入本文中。
[0002] 本發明一般是關于適用于治療溶酶體儲積疾病的治療性融合蛋白及治療此等疾 病的方法。示范性治療性融合蛋白包含溶酶體酶、溶酶體靶向部分（例如IGF-II肽）及 間隔肽。意欲溶酶體酶為a -N-乙酰氨基葡萄糖苷酶（Naglu)且疾病為IIIB型黏多糖病 (Mucopolysaccharidosis Type IIIB) (Β 型山菲立普綜合征）。 技術背景
[0003] 通常，哺乳動物溶酶體酶在胞質液中合成且橫越ER，在ER中，其經N-連接的高甘 露糖型碳水化合物糖基化。在高爾基體（golgi)中，藉由添加使此等蛋白質靶向溶酶體的 甘露糖-6-磷酸（M6P)來修飾溶酶體酶上的高甘露糖碳水化合物。經由與兩種M6P受體的 任一者相互作用來使M6P修飾的蛋白質傳遞至溶酶體。最有利的修飾形式為當添加兩個 M6P至高甘露糖碳水化合物中時。
[0004] 超過40種溶酶體儲積疾病（LSD)是因在溶酶體中不存在一或多種溶酶體酶而直 接或間接引起。正積極推行用于LSD的酶補充療法。療法通常需要LSD蛋白質以M6P依賴 性方式被攝取且傳遞至多種細胞類型的溶酶體。一種可能的方法涉及純化LSD蛋白質且用 M6P對其進行修飾以并入碳水化合物部分。歸因于與細胞表面上的M6P受體的相互作用，此 經修飾物質可比未修飾LSD蛋白質更高效地由細胞攝取。
[0005] 本發明的發明人先前已開發一種允許將治療性酶更高效傳遞至溶酶體的肽基靶 向技術。此專有技術稱為糖基化非依賴性溶酶體靶向（GILT)，因為肽標簽替代M6P作為 靶向溶酶體的部分。GILT技術的詳情描述于美國申請公開文本第號、第 號、第 號、第 號、第 號、及國際公 開文本 WO 03/032913、WO 03/032727、WO 02/087510、WO 03/102583、WO 2005/078077 中， 所述所有公開文本的揭露內容據此以引用的方式并入本文中。

【發明內容】

[0006] 本發明提供用于基于GILT技術達成高效溶酶體靶向的進一步改良組合物及方 法。本發明尤其提供用于使用溶酶體靶向肽使溶酶體酶靶向溶酶體的方法及組合物。本發 明也提供用于使用對IGF-I受體的結合親和力降低或減弱及/或對胰島素受體的結合親和 力降低或減弱及/或對弗林蛋白酶（furin)裂解具有抗性的溶酶體靶向肽使溶酶體酶靶向 溶酶體的方法及組合物。本發明也提供包含溶酶體酶以及提供溶酶體酶融合蛋白的產生及 向溶酶體中的攝取改良的IGF-II及間隔肽的溶酶體酶融合蛋白。在某些實施例中，溶酶體 酶為a -N-乙酰氨基葡萄糖苷酶（Naglu)。
[0007] 在一態樣中，本發明提供一種靶向治療性融合蛋白，其包含溶酶體酶、氨基酸序列 與成熟人類IGF-II的氨基酸8-67至少70%-致的肽標簽、及在該溶酶體酶與該IGF-II 肽標簽之間的間隔肽。在各種實施例中，間隔肽包含一個或多個GGGPS(SEQ ID N0:14) 或GGGSP(SEQ ID NO:15)氨基酸序列，且任選地還包含以下一個或多個：（i)GAP(SEQ ID NO:9),(ii)GGGGS(SEQ ID NO:12),(iii)GGGS(SEQ ID NO:16),(iv)AAAAS(SEQ ID NO:17), (V)AAAS(SEQ ID NO:18)、（vi)PAPA(SEQ ID NO:19)、（vii)TPAPA(SEQ ID NO:20)、（viii) AAAKE(SEQ ID N0:21)或（ix)GGGGA(SEQ ID N0:60)。
[0008] 本文涵蓋的示范性溶酶體酶包括表1中所述者。
[0009] 在各種實施例中，靶向治療性融合蛋白包含與人類a-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶 (Naglu)蛋白質（圖1，SEQ ID NO: 1)至少85%-致的氨基酸序列、氨基酸序列與成熟人類 IGF-II的氨基酸8-67至少70%-致的肽標簽、及位于該Naglu氨基酸序列與該IGF-II肽 標簽之間的間隔肽。在各種實施例中，間隔子包含氨基酸序列GAP (SEQ ID NO: 9)、GPS(SEQ ID N0:10)或GGS(SEQ ID N0:11)。在各種實施例中，間隔子序列包含在成熟人類IGF-II 的氨基酸與人類Naglu的氨基酸之間的氨基酸Gly-Pro-Ser (GPS) (SEQ ID NO: 10)。
[0010] 在各種實施例中，間隔肽包含一個或多個GGGGS (SEQ ID NO: 12)或GGGS (SEQ ID N0:16)氨基酸序列。在各種實施例中，間隔肽包含一個或多個GGGPS(SEQ ID N0:14)或 GGGSP(SEQ ID N0:15)氨基酸序列。在各種實施例中，間隔肽包含一個或多個AAAAS(SEQ ID NO: 17)或AAAS (SEQ ID NO: 18)氨基酸序列。在各種實施例中，間隔肽包含一個或多個 PAPA (SEQ ID NO: 19)或TPAPA (SEQ ID NO: 20)氨基酸序列。在各種實施例中，間隔肽包含 一個或多個AAAKE(SEQ ID N0:21)氨基酸序列。在各種實施例中，間隔肽包含一個或多個 GGGGA(SEQ ID NO:60)氨基酸序列。
[0011] 在各種實施例中，間隔肽包含選自下組的氨基酸序列：(GGGGS)n(SEQ ID N0:12、 56,58,91-94), (GGGGS) n-GGGPS (SEQ ID NO: 36,95-100) , GAP-(GGGGS) n-GGGPS (SEQ ID NO:101-107)、GAP-(GGGGS)n-GGGPS-GAP (SEQ ID NO: 37、108-113)、GAP-(GGGGS) n-GGGPS-(GGGGS)n-GAP (SEQ ID NO :114-162)、GAP-GGGPS-(GGGGS)n-GAP (SEQ ID NO: 163-169)、GAP-(GGGGS)n-AAAAS-GGGPS-(GGGGS)n-AAAA-GAP(SEQ ID NO: 170-218)、 GAP- (GGGGS) n-PAPAP- (Xaa) n-GAP (SEQ ID NO: 219-267)、GAP- (GGGGS) n-PAPAPT- (Xaa) n-GAP (SEQ ID NO :268-316)、GAP-(GGGGS)n-(Xaa) n-PAPAP-(Xaa) n-(AAAKE) n-(Xaa) n-(GGGGS)n-GAP (SEQ ID NO: 544-551) , (GGGGA)n(SEQ ID NO: 60,79,81,317-320), (GGGGA)n-GGGPS (SEQ ID NO:321-326)、GAP-(GGGGA)n-GGGPS (SEQ ID NO: 327-333)、 GAP- (GGGGA) n-GGGPS-GAP (SEQ ID NO: 334-340)、GAP- (GGGGA) n-GGGPS- (GGGGA) n-GAP (SEQ ID NO: 341-389)、GAP-GGGPS-(GGGGA)n-GAP (SEQ ID NO: 390-396)、GAP-(GGGGA) n-AAAAS-GGGPS- (GGGGA) n-AAAA-GAP (SEQ ID NO: 397-445)、GAP- (GGGGA) n-PAPAP- (Xaa) n-GAP (SEQ ID NO: 446-494)、GAP-(GGGGA)n-PAPAPT-(Xaa)n-GAP (SEQ ID NO: 495-543)、 GAP- (GGGGA) n- (Xaa) n-PAPAP- (Xaa) n- (AAAKE) n- (Xaa) n- (GGGGA) n-GAP (SEQ ID NO:552-559);其中n為I至7。在各種實施例中，n為I至4。
[0012] 在各種實施例中，本發明提供一種用作使肽或包含肽的融合蛋白靶向哺乳動物溶 酶體的肽標簽的IGF-II肽。在各種實施例中，本發明提供一種IGF-II突變蛋白質。在各 種實施例中，本發明提供一種具有與成熟人類IGF-II (AYRPSETLCGGELVDTLQFVCGDRGFYFSRP ASRVSRRSRGIVEECCFRSCDLALLETYCATPAKSE)(SEQ ID N0:5)至少 70%-致的氨基酸序列及 消除至少一個弗林蛋白酶蛋白酶裂解位點的突變的弗林蛋白酶抗性IGF-II突變蛋白質。
[0013] 在一些實施例中，本發明提供一種包含與成熟人類IGF-II至少70%-致的氨基 酸序列的IGF-II突變蛋白質。在各種實施例中，IGF-II突變蛋白質肽標簽包含成熟人 類IGF-II的氨基酸8-67。在各種實施例中，IGF-II突變蛋白質包含相較于野生型人類 IGF-II，降低或減弱對胰島素受體的結合親和力的突變。
[0014] 在一些實施例中，相對于天然存在的人類IGF-II對IGF-I受體的親和力，IGF-II 突變蛋白質對IGF-I受體的結合親和力減弱。
[0015] 在各種實施例中，本發明提供一種含有溶酶體酶；及氨基酸序列與成熟人類 IGF-II至少70%-致的IGF-II突變蛋白質的靶向治療性融合蛋白，其中該IGF-II突變蛋 白質對弗林蛋白酶裂解具有抗性且以甘露糖-6-磷酸非依賴性方式結合人類陽離子非依 賴性甘露糖-6-磷酸受體。
[0016] 在一些實施例中，本發明提供一種含有溶酶體酶；及氨基酸序列與成熟人類 IGF-II至少70%-致，且相對于天然存在的人類IGF-II對胰島素受體的親和力，對胰島素 受體的結合親和力減弱的IGF-II突變蛋白質的靶向治療性融合蛋白。在一相關實施例中， IGF-II突變蛋白質對弗林蛋白酶裂解具有抗性且以甘露糖-6-磷酸非依賴性方式結合人 類陽離子非依賴性甘露糖-6-磷酸受體。
[0017] 在各種實施例中，適于本發明的IGF-II突變蛋白質在對應于成熟人類IGF-II的 氨基酸30-40的區域內包括突變。在一些實施例中，適于本發明的IGF-II突變蛋白質在對 應于成熟人類IGF-II的氨基酸34-40的區域內包括突變以使該突變消除至少一個弗林蛋 白酶蛋白酶裂解位點。在一些實施例中，適合突變為氨基酸取代、缺失及/或插入。在一些 實施例中，突變為在對應于成熟人類IGF-II的Arg37或Arg40的位置處的氨基酸取代。在 一些實施例中，氨基酸取代為Lys或Ala取代。
[0018] 在一些實施例中，適合突變為缺失或置換對應于選自下組的位置的氨基酸殘基： 成熟人類 IGF-II 的 30-40、31-40、32-40、33-40、34-40、30-39、31-39、32-39、34-37、33-39、 34-39、35-39、36-39、37-40 及其組合。
[0019] 在各種實施例中，本發明的IGF-II突變蛋白質進一步含有對應于成熟人類 IGF-II的位置2-7的氨基酸的缺失或置換。在各種實施例中，本發明的IGF-II突變蛋白 質進一步包括對應于成熟人類IGF-II的位置1-7的氨基酸的缺失或置換。在各種實施例 中，本發明的IGF-II突變蛋白質進一步含有對應于成熟人類IGF-II的位置62-67的氨基 酸的缺失或置換。在各種實施例中，本發明的IGF-II突變蛋白質進一步在對應于成熟人 類IGF-II的Tyr27、Leu43或Ser26的位置處含有氨基酸取代。在各種實施例中，本發明的 IGF-II突變蛋白質含有至少一個選自下組的氨基酸取代：Tyr27Leu、Leu43Val、Ser26Phe 及其組合。在各種實施例中，本發明的IGF-II突變蛋白質含有對應于成熟人類IGF-II的 位置48-55的氨基酸。在各種實施例中，本發明的IGF-II突變蛋白質含有至少三個選自下 組的氨基酸：對應于成熟人類IGF-II的位置8、48、49、50、54及55的氨基酸。在各種實施 例中，本發明的IGF-II突變蛋白質在對應于成熟人類IGF-II的位置54及55的位置處含 有各自在pH 7.4下不帶電荷或帶負電荷的氨基酸。在各種實施例中，相對于天然存在的人 類IGF-II對IGF-I受體的親和力，IGF-II突變蛋白質對IGF-I受體的結合親和力減弱。在 各種實施例中，IGF-II突變蛋白質為IGF2 Λ 8-67R37A(也即成熟人類IGF-II的在成熟人 類IGF-II的位置37處的Arg經Ala取代的氨基酸8-67)。
[0020] 在各種實施例中，肽標簽連接于溶酶體酶的N末端或C末端，因此其分別為N末端 標簽或C末端標簽。在各種實施例中，肽標簽為C末端標簽。
[0021] 在一些實施例中，適于本發明的溶酶體酶為人類a-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶 (Naglu)(圖1)或其功能性片段或變異體。在一些實施例中，適于本發明的溶酶體酶包括人 類a -N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的氨基酸1-743或人類a -N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的缺乏信 號序列的氨基酸24-743。
[0022] 在各種實施例中，本發明的靶向治療性融合蛋白進一步在溶酶體酶與IGF-II突 變蛋白質之間包括間隔子。
[0023] 在各種實施例中，間隔子包含α螺旋結構或剛性結構。
[0024] 在各種實施例中，間隔子包含一個或多個Gly-Ala-Pro(GAP) (SEQ ID Ν0:9)、 Gly-Pro-Ser(GPS) (SEQ ID NO: 10)或 Gly-Gly-Ser(GGS) (SEQ ID NO: 11)氨基酸序列。
[0025] 在一些實施例中，間隔子是選自下組：EFGGGGSTR (SEQ ID NO: 22)、GAP (SEQ ID NO:9)、GGGGS(SEQ ID NO: 12)、GPSGSPG(SEQ ID NO:23)、GPSGSPGT(SEQ ID N0:24)、GPSGSPGH(SEQ ID N0:25)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPST(SEQ ID N0:26)、 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSH(SEQ ID NO :27), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGP S (SEQ ID N0:28), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGPSGAP(SEQ ID NO :29), GGG GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS(SEQ ID NO :30), GAPGGGGSGGGGSG GGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGAP(SEQ ID NO:31), GGGGSGGGGSGGGGSGGGP SGGGGSGGGGSGGGPS(SEQ ID NO :32), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGAP(SEQ ID N0:33)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPS(SEQ ID N0:34)、 GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGAP(SEQ ID NO :35), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS(SEQ ID NO :36), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGAP(S EQ ID N0:37), GGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGPS(SEQ ID NO: 38), GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGG SGGGPSGAP (SEQ ID NO:39), GGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGPS(S EQ ID N0:40)、GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGPSGAP(SEQ ID NO :41), GGGGSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPS(SEQ ID NO :42), GAPG GGGSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGAP(SEQ ID NO :43), GGSPAGSPTS TEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPS(SEQ ID NO :44), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPE SGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPSGAP(SEQ ID NO :45), GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEG SAPGSPAGSPTSTGPS(SEQ ID NO :46), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAG SPTSTGPSGAP (SEQ ID NO: 47), GGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPS (SEQ ID NO: 48), GAPGGGSPAP TPTPAPTPAPTPAGGGPSGAP(SEQ ID NO: 49), GGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPS(SEQ ID NO :50), GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP(SEQ ID NO: 51)、GGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPS(SEQ ID N0:52)、GAPGGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPSGAP(SEQ ID N0:53)、GGGSPAEAAAKEAAAKEA AAKEAAAKEAAAKAPSGGG(SEQ ID NO :54), GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGG GAP (SEQ ID N0:55), GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO: 56), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGAP (SEQ ID N0:57)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID N0:58)、GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGAP(SEQ ID NO: 59), GGGGA(SEQ ID NO:60), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPST (SEQ ID N0:61), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH(SEQ ID NO :62), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGG PS(SEQ ID NO:63)、GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGPSGAP(SEQ ID N0:64)、 GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS(SEQ ID NO :65), GAPGGGGAG GGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGAP(SEQ ID NO :66), GGGGAGGGGAGG GGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPS(SEQ ID NO:67), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGG GPSGAP (SEQ ID NO: 68)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPS(S EQ ID NO:69)、GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGAP(SEQ ID NO: 70)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS (SEQ ID NO: 71)、GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGP SGAP (SEQ ID NO: 72), GGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGPS (SEQ ID NO: 73), GAPGGGGAGGGGAAA AASGGGGAGGGPSGAP (SEQ ID NO :74), GGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAA ASGGGPS(SEQ ID NO :75)、GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGP SGAP(SEQ ID NO: 76), GGGGAGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGP S (SEQ ID NO :77), GAPG