β1-α1及其基因和應用
【技術領域】
[0001] 本發明設及醫學生物技術領域，具體地指一種重組蛋白M0G35-55-I-Abβ1- α 1及 其基因和應用。
【背景技術】
[0002] 主要組織相容性分子（MajorHistocompatibilityComplex,MHC)對于機體 免疫應答的發生與強度具有十分重要的作用。在天然情況下，抗原提呈細胞（Antigen presentingcell,APC)將抗原膚提呈給T細胞，CD4叮細胞識別抗原膚/MHC-II類分子復 合物；而CD8叮細胞識別抗原膚/Mffi：-I類分子復合物。在此過程中，T細胞的充分活化需 要雙信號： 陽00引①TCR與共受體CD4/CD8與pM肥特異性結合，提供T細胞活化的第一信號；
[0004] ②APC和T細胞表面的多種共刺激分子相互作用，提供T細胞激活所必須的共刺 激信號。
[0005] 如果只有提供的第一信號，缺乏共刺激信號，則該特異性T細胞會發生克隆 無能（clonalanergy)，表現為特異性免疫耐受。基于運個原理，近二十年來，國內、外實驗 室研究開發出多種形式的可溶性pMHC分子，它們能夠有效地結合、封閉抗原特異性T細胞， 但是由于缺乏共刺激分子所提供的第二信號，導致相應的T細胞發生克隆無能及免疫耐 受，在同種移植排斥、自身免疫性疾病、超敏反應等多個疾病領域表現出重要的治療潛力。
[0006] 實驗性自身免疫性腦脊髓炎（experimentalautoimmune encephalomyelitis,EAE)是人類自身免疫性疾病多發性硬化癥（multiple sclerosis,IVB)的動物模型，髓銷憐脂少突膠質細胞糖蛋白（myelinoligoden化oc^e glycoprotein，M0G)的優勢表位M0G35-55能夠在巧7BL/6小鼠中誘生自身反應性Τ細胞 從而導致疾病的發生。研制一種可溶性pMHC分子對小鼠ΕΑΕ模型進行治療，可為人類多發 性硬化的治療提供依據。
[0007] 目前，還沒有一種用于治療人類自身免疫性疾病多發性硬化癥的藥品。

【發明內容】

[0008] 本發明所要解決的技術問題就是提供一種重組蛋白M0G35-55-I-Abβ1- α 1及其 基因和應用。該重組蛋白可W用于治療人類自身免疫性疾病多發性硬化癥的藥品的研發。
[0009] 為實現上述目的，本發明提供的一種重組蛋白Μ0635-55-Ι-Α"β1-α1，其氨基酸 序列如SEQIDNo. 1所示。
[0010] 本發明還提供了一種編碼重組蛋白M0G35-55-I-Abp1-α1的基因 MOG35-55-I-Ab0 1-α1，其核巧酸序列如沈QIDNo. 2。
[0011] 本發明還提供了一種重組表達載體，它含有權利要求2所述基因的原核表達載 體；其中，所述的原核表達載體為祀T30a表達載體。
[0012] 本發明還提供了一種含有上述重組表達載體的大腸桿菌化21表達菌株。
[0013] 下述各項之一在合成用于治療人類自身免疫性疾病多發性硬化癥的藥品中應用。
[0014] 1)含有編碼重組蛋白MOG35-55-I-Ab0 1-α1 的基因MOG35-55-I-Ab0 1-α1 的重 組表達載體，
[0015] 2)含有上述的重組表達載體的大腸桿菌化21表達菌株。
[0016] 本發明還提供了一種重組蛋白在治療人類自身免疫性疾病多發性硬化癥的藥品 中應用。
[0017] 本發明的有益效果在于：
[001引本發明根據原核表達系統的密碼子偏好性設計了一段融合基 因MOG35-55-I-Ab0 1-α1，并在大腸桿菌化2UDE3)中表達此可溶性蛋白 MOG35-55-I-Ab0 1-α1。該可溶性蛋白有望通過封閉M0G35-55特異性Τ細胞緩解ΕΑΕ，為 后續進一步誘導巧7BL/6小鼠Τ細胞產生免疫耐受的研究奠定物質基礎。
【附圖說明】
[0019] 圖1為融合蛋白MOG35-55-I-Ab0 1-α1的蛋白表達圖。
【具體實施方式】
[0020] 為了更好地解釋本發明，W下結合具體實施例進一步闡明本發明的主要內容，但 本發明的內容不僅僅局限于W下實施例。
[0021] 實驗材料
[0022] 祀T30a質粒、BL21 (DE3)菌株為我室保存；ProteinMarker購自化rmentas，貨號 26610 ;Ac;r、Bis、T;ris等購自Sigma公司；SDS購自Amresco公司；Ty巧tone、"'ieastExtract 購自OXOID公司。 陽〇2引實施例1
[0024] 1、重組融合基因M0G35-55-I-Abβ1-α1的密碼子優化及全基因合成 陽02引在Genebank分別查出M0G35-55、I-Abβ1和I-Abα1的核巧酸序列，進行拼接，得 到一段融合蛋白的氨基酸序列MOG35-55-I-Ab0 1-α1如SEQIDNo. 1所示。
[00%] 按照原核表達系統使用密碼子的偏性對表達上述融合蛋白的基因序列進行優化， 加入起始密碼子與終止密碼子，得到優化后的融合重組MOG35-55-I-Ab01-α1，其核巧酸 序列如SEQIDNo. 2。
[0027] 并將上述序列亞克隆到祀T30a載體中構建重組質粒 pET30a[M0G35-55-I-Abβ1-α1]。基因測序結果與目的序列進行分析比對。 陽0測 實施例2
[0029] 1、蛋白表達
[0030] 1)將祀T[M0G35-55-I-Abβ1-α1]質粒轉化化21 (DE3)感受態細胞。
[0031] 2)挑取陽性克隆接種到5ml含有卡那霉素的LB培養基。
[0032] 3)37°C振蕩培養過夜，第二天按1:100接種到5ml含有卡那霉素的LB培養基，共 4組。37°C振蕩培養到0D550 = 0. 5,按照下面條件進行表達誘導：
[0033] (l)IPTGOmM37°C培養化
[0034] 0)IPTG0. 5mM37°C誘導 3h
[0035] 做IPTG 0. 5mM 30°C誘導12h
[0036] (4) IPTG0.5mM 37°C誘導24h
[0037] 4)收集誘導完畢的細胞，超聲裂解，離屯、收集上清和沉淀分別進行SDS-PAGE電泳 檢測目的蛋白分布。 W測2結果
[0039] 2. 1融合基因M0G35-55-I-Ab β 1-α1的鑒定
[0040] 將密碼子優化后的融合基因進行全基因合成，對合成好的基因進行基因測序。測 序結果與目的基因比對的結果證明合成基因正確無誤，附比對結果。
[0041] 2. 2融合基因MOG35-55-I-Ab0 1-α 1的表達 陽0創全基因合成M0G35-55-I-Ab 0 1- α 1融合基因，亞克隆到祀T30a載體，轉化 大腸桿菌化2UDE3)感受態，挑取克隆在含有卡那霉素的LB培養基中培養并用IPTG 誘導表達。采用37°C，30°C，13°C^個誘導條件進行誘導小試。實驗表明，融合蛋白 MOG35-55-I-Ab0 1-α 1在原核表達系統中獲得了成功表達，并且，30°C誘導1化的表達量最 高，多數蛋白分布在沉淀中，少量蛋白分布在上清中，圖1。
[0043] 其它未詳細說明的部分均為現有技術。盡管上述實施例對本發明做出了詳盡的 描述，但它僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部實施例，人們還可W根據本實施例在不 經創造性前提下獲得其他實施例，運些實施例都屬于本發明保護范圍。
【主權項】
1. 一種重組蛋白MOG35-55-I-Ab0 1-α1，其氨基酸序列如SEQIDNo. 1所示。2. 編碼權利要求1所述蛋白的基因MOG35-55-I-Abf3 1-α1，其核苷酸序列如SEQID No. 2 〇3. -種重組表達載體，其特征在于：它含有權利要求2所述基因的原核表達載體。4. 根據權利要求3所述的重組表達載體，其特征在于：所述的原核表達載體為pET30a 表達載體。5. 含有權利要求3和4所述重組表達載體的大腸桿菌BL21表達菌株。6. 下述各項之一在合成用于治療人類自身免疫性疾病多發性硬化癥的藥品中應用。 1) 權利要求3或4所述的重組表達載體， 2) 含有權利要求3或4所述重組表達載體的大腸桿菌BL21表達菌株。7. -種權利要求1所述的重組蛋白在治療人類自身免疫性疾病多發性硬化癥的藥品 中應用。
【專利摘要】本發明公開了一種重組蛋白MOG35-55-I-Abβ1-α1及其基因和應用。該重組蛋白MOG35-55-I-Abβ1-α1，其氨基酸序列如SEQ？ID？No.1所示。本發明根據原核表達系統的密碼子偏好性設計了一段融合基因MOG35-55-I-Abβ1-α1，并在大腸桿菌BL21(DE3)中表達此可溶性蛋白MOG35-55-I-Abβ1-α1。該可溶性蛋白有望通過封閉MOG35-55特異性T細胞緩解EAE，為后續進一步誘導C57BL/6小鼠T細胞產生免疫耐受的研究奠定物質基礎。
【IPC分類】A61K48/00, C12N15/62, A61K38/36, A61K35/74, C07K19/00, C12N15/70, A61P25/00, A61P37/02
【公開號】CN105254765
【申請號】CN201510653952
【發明人】龔業莉
【申請人】江漢大學
【公開日】2016年1月20日
【申請日】2015年10月10日