用交叉β結構靶向誘導蛋白質聚集的制作方法
【專利說明】用交叉β結構靶向誘導蛋白質聚集
[0001] 本申請為2008年6月3日提交的、發明名稱為"用交叉β結構靶向誘導蛋白質聚 集"的PCT申請PCT/EP2008/056825的分案申請，所述PCT申請進入中國國家階段的日期為 2010年2月3日，申請號為20088010184L 4。 發明領域
[0002] 本發明屬于蛋白質聚集領域。本發明揭示了干擾靶蛋白質功能的方法以及使用被 稱作聚集劑（aggregator)的非天然的、使用者設計的分子，其對靶蛋白質具有特異性且在 與所述靶蛋白質接觸時誘導聚集。本發明還揭示了這種聚集劑分子及其在治療和診斷中的 應用。
[0003] 發明背景
[0004] 蛋白質聚集已經成為生物技術和醫學領域的主要議題。其是蛋白質生產中的主 要瓶頸，縮小了通過重組技術獲得的相關多肽的范圍；其降低存放期且可以增加多肽藥物 的免疫原性；以及其與人類關鍵疾病的數目增加相關，所述疾病包括阿爾茨海默氏病、海綿 狀腦病、II型糖尿病以及帕金森氏病。最近十年數據已經開始不斷提示多肽的組成和一級 結構在很大程度上決定其聚集傾向，且較小的改變對于溶解性可能具有巨大影響。如通過 能預測蛋白質中β-聚集序列的很多算法證實，根據其序列預測蛋白質聚集傾向的能力非 常具有價值。這些算法可用于通過特異性序列靶向治療劑控制不希望的蛋白質沉積事件 或者揭示生物技術感興趣蛋白的更可溶的變體。通常假定不是多肽的所有區域在決定其 聚集傾向中均是相同重要的。在這方面，最近已經證實極短的一段特殊氨基酸序列可作為 淀粉樣原纖維形成的促進劑或抑制劑。在功能蛋白質組學領域需要開發創新技術以促進 發明及使功能蛋白質組學中通過互補方法賦予的潛力最大化。需要具有一種可靈活應用 的技術，其可以直接革巴向特定胞外或胞內蛋白質的生物學功能，而不是革巴向翻譯其的mRNA 或者操作編碼其的基因。在本發明中我們嘗試開發基于聚集而靶向特定蛋白質的技術。 迄今為止，蛋白質聚集主要作為不希望的導致疾病的現象而被研宄，且普遍認為交叉-β 介導的聚集是最經常發生的且是聚集的生物學相關機制2。交叉聚集（Cross-beta aggregation)是用于表示聚集是通過分子間β-折疊形成而成核（nucleated)的術 語，聚集物中的每個分子均提供典型包含至少三個連續氨基酸的相同的鏈。專利申請 W003102187(Scegen, Pty Ltd)揭不了通過將分子與膜易位序列（membrane translocating sequence)融合而增強所述分子活性的方法，從而所得嵌合分子自主裝配成較高分子量的 聚集物。US20050026165(Aret6 Associates)揭示了能與不溶蛋白質如朊病毒的β-折疊 構象相互作用的構象肽作為朊病毒疾病診斷工具的應用。專利申請W02007010110描述了 通過使用多環化合物誘導蛋白質聚集。
[0005] 發明概述
[0006] 本發明涉及特定靶蛋白質的受控且可誘導的蛋白質聚集的技術。本發明還提供了 重新設計的分子，在本文稱作聚集劑分子，其包含與對于靶蛋白質具有親和性的結合區偶 聯的至少一個β -聚集區。在一個優選的實施方案中，所述聚集劑分子包含至少一個β -聚 集區，其與能結合靶蛋白質（或者與之相互作用）的區域融合。在選擇的靶蛋白質與特殊 設計的聚集劑分子接觸時，在所述靶蛋白質與聚集劑之間出現特異性共聚集，導致所述靶 蛋白質的生物學功能的功能性敲除或者下調。這種蛋白質敲低（knock-down)是取決于聚 集劑的存在的，其由存在聚集劑分子而被誘導。另一額外的優勢是蛋白質干擾的強度可以 通過改變聚集劑分子中β-聚集區的數目而實驗性地控制。本發明不僅提供了下調特定胞 外或胞內蛋白質生物學功能的有效研宄工具，而且也具有重要的治療、農業和診斷應用。
【附圖說明】
[0007] 圖1:該圖示出通過離心除去共聚集物之后上清中殘余HRP活性百分比（見實施 例1)。所述聚集劑（生物素酰化肽）的存在顯然從可溶級分中除去了所述酶。
[0008] 發明目的和詳細描述
[0009] 在本發明中，我們開發了通過使用非天然發生的分子下調蛋白質的生物學功能的 方法，所述分子包含能結合所述蛋白質的區域及至少一個聚集序列。在與靶蛋白質接 觸時，所述非天然發生的分子與所述靶蛋白質之間發生共聚集。所述聚集使得靶從其可溶 環境中退出，導致所述可溶靶蛋白質的功能性敲低。"聚集"應理解為可以是指無定形或者 纖維狀（淀粉樣或者交叉纖維狀是相同含義術語）聚集。事實上，聚集區的種類 決定靶蛋白質的無定形或纖維狀聚集的誘導。
[0010] 因此，本發明的一個實施方案提供了下調蛋白質生物學功能的方法，包括將所述 蛋白質與非天然發生的分子接觸，所述分子包含能結合所述蛋白質的區域以及至少一個 β-聚集序列。文中用語"能結合靶蛋白質"是指"能與靶蛋白質相互作用"或者換言之是 "對于靶蛋白質具有親和性"。應理解所述親和性是在微摩爾至皮摩爾親和性的范圍內，優 選在納摩爾至皮摩爾親和性的范圍內。因此聚集劑（或者其能結合靶蛋白質的結合結構 域）對于靶蛋白質的親和性為至少IO 4Hior1 (例如至少105、106、107、108、10 9、10'IO11或者 IO12moΓ1)。應理解這種非天然發生的分子是嵌合分子，其包含兩個元件的融合：結合區與 至少一個β-聚集序列，所述兩個元件彼此無親和性和/或所述元件彼此不結合。無親和 性是指該親和性低于高于IO 4Hi0I'在一個優選的實施方案中，所述元件與靶蛋白質不同， 其目的在于下調（或者等價而言：其目的在于聚集）。在另一優選的實施方案中，所述結合 區可以調節靶蛋白質的功能。在再一優選的實施方案中，所述結合區不調節靶蛋白質的功 能，意味著所述結合區（當單獨結合時）僅結合靶蛋白質而不干擾所述靶蛋白質的生物學 功能。在一特殊的實施方案中，靶蛋白質是融合蛋白，如組氨酸融合蛋白、鏈霉抗生物素蛋 白融合蛋白、GFP融合蛋白等。
[0011] 術語"結合區"或者"結合結構域"典型是指與靶蛋白質相互作用的分子。在某 些情況中，結合結構域是化學化合物（例如對至少一種靶蛋白質具有親和性的小化合物）； 在其他某些情況中，結合結構域是多肽；在其他某些情況中，結合結構域是蛋白質結構域。 蛋白質結合結構域是整個蛋白質結構的元件，其是自穩定的且通常不依賴于其余蛋白質 鏈而折疊。結合結構域的長度可以在大約25個氨基酸直至500及更多個氨基酸的范圍 內變化。許多結合結構域可以分類為折疊及可識別的、可鑒別的3-D結構。一些折疊在 許多不同蛋白質中很常見，以致于給其特定名稱。非限制性的例子是羅斯曼折疊、TIM桶、 執餘（armadillo)重復、亮氨酸拉鏈、1?粘蛋白結構域、死亡效應結構域（death effector domain)、免疫球蛋白樣結構域、磷酸酪氨酸-結合結構域、血小板-白細胞C激酶底物同系 結構域、src同源2結構域、BRCAl的BRCT結構域、G-蛋白結合結構域、Eps 15同源（EH) 結構域以及P53的蛋白質結合結構域。抗體是具有通過稱作互補決定區（CDR)的超變環區 介導的特異性的特異結合蛋白的天然原型。盡管通常抗體樣支架已證明作為特異結合劑工 作良好，但是已經清楚其不必須與展示CDR樣環的剛性支架范例（paradigm)嚴格粘合。除 了抗體之外，許多其它天然蛋白質介導結構域之間的特異性高親和性相互作用。或者免疫 球蛋白提供了設計新的結合（識別）分子的有吸引力的起始點。如本發明所用，術語"支 架"是指蛋白質構架，其可以攜帶改變的氨基酸或者序列插入，賦予與特定靶蛋白質結合的 能力。工程化支架和設計文庫是相互依賴的程序。為了獲得特定結合劑，需要產生支架的 組合文庫。這通常是通過使用簡并密碼子或者三核苷酸在DNA水平通過隨機化在適當氨基 酸位置的密碼子進行。具有廣泛不同來源和特性的眾多不同的非免疫球蛋白支架通常用于 組合文庫展示。其中一些大小與抗體的scFv相似（大約30kDa)，而大多數更小。基于重復 蛋白質的模塊支架的大小根據重復單位的數目而不同。非限制性的實例包括：基于人IO th 纖連蛋白III型結構域的結合劑、基于脂籠蛋白的結合劑、基于SH3結構域的結合劑、基于 knottin家族成員的結合劑、基于CTLA-4的結合劑、T-細胞受體、新制癌菌素、碳水化合物 結合模塊4-2、tendamistat、kunitz結構域抑制劑、PDZ結構域、Src同源結構域（SH2)、蝎 毒素、昆蟲防衛素 A、植物同源結構域指蛋白、細菌酶TEM-I β -內酰胺酶、金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)蛋白A的Ig-結合結構域、大腸桿菌（E.coli)大腸桿菌素 Ε7免 疫性蛋白、大腸桿菌細胞色素 b562、錨蛋白重復結構域。本發明還包括這樣的結合結構域， 其是對指定靶蛋白質具有特異性的化合物、環形或線性肽結合劑、肽適配體、多價avimer 蛋白質或者小模塊免疫藥物學藥物、對于受體或者共同受體具有特異性的配體、在雙雜交 分析中鑒別的蛋白質結合配偶體、基于生物素-抗生物素蛋白高親和性相互作用的特異性 的結合結構域、基于親環蛋白-FK506結合蛋白的特異性的結合結構域。本發明也包括對于 特殊碳水化合物結構具有親和性的凝集素。
[0012] 在另一實施方案中，本發明提供了下調蛋白質生物學功能的方法，包括將所述蛋 白質與非天然發生的分子（或者與嵌合分子）接觸，所述分子包含A部分和B部分，其中i) A部分是能結合所述蛋白質的結合區，以及ii)B部分包含至少一個β-聚集區。在特殊的 實施方案中，所述至少一個β-聚集區由至少3個連續氨基酸組成。在一個特異實施方案 中，所述聚集區衍生自靶蛋白質。在另一個特異實施方案中，所述聚集區與靶蛋白 質不同（即其衍生自不同的蛋白質）。在再一個實施方案中，所述β-聚集區是人工多肽序 列（即其非衍生自現有蛋白質序列，也就是不是在自然界中發現的）。在另一特異實施方案 中，在A部分與B部分之間存在接頭。一個特殊類型的β-聚集區是淀粉樣區域。
[0013] 在另一個實施方案中，非天然發生的分子（或者嵌合分子）的B部分包含至少2 個β -聚集區。
[0014] 術語"非天然發生的分子"或者"嵌合分子"或者"嵌合融合分子"是指這種分子是 人工制造的。例如，當分子是多肽時（即A部分和B部分均是肽時），這種多肽B部分在計 算機上（in Silico)設計或者分離自天然蛋白質（即β-聚集區）并且融合（或者偶聯） 所述B部分與A部分（是能結合蛋白質的區域），其中應了解A和B彼此無親和性（即彼此 不結合或者彼此不相互作用）。換句話說，與結合區融合的β -聚集區（或序列）與A部分 與B部分之間通過至少一個天然氨基酸天然發生的融合不同。典型地，這種嵌合分子不作 為連續多肽存在于由非重組基因組中基因編碼的蛋白質中。
[0015] 應明了所述聚集劑分子可以模塊方式通過導入重復及改變A部分和B部分的順序 而設計。非限制性的組合如下：具有A-B結構的聚集劑、具有B-A結構的聚集劑、具有A-B-A 結構的聚集劑、具有B-A-B結構的聚集劑、具有A' -B-A"結構的聚集劑，以及具有B ' -A-B " 結構的聚集劑，其中接頭（間隔序列）任選位于A，A'，A"和B，B'，B"之間。A、A'和A"是 不同的相似部分（例如不同的肽序列或者不同的化學部分）。B、B'和B"是不同或相似的 自締合序列（例如B是衍生自靶蛋白質的β -聚集序列，B'是合成的β -聚集序列）。
[0016] 文中用語"下調蛋白質功能"是指蛋白質的正常生物學活性被降低（在此抑制、下 調、降低和破壞是等價詞）或者蛋白質通過誘導的聚集（即聚集劑與靶蛋白質之間的共聚 集）而脫離其正常生物學環境（例如是內質網的正常居住者的蛋白質由于其功能下調而不 存在）。因此，通過應用本發明方法，所述蛋白質與本發明的非天然分子通過接觸而發生蛋 白質聚集，破壞所述蛋白質的功能。所述非天然分子在此被稱作"聚集劑"或者"聚集劑分 子"。聚集是指通常可溶的蛋白質在其正常生物學環境中通過與所述聚集劑直接接觸或者 結合而被改變為不溶蛋白質或者聚集的蛋白質的事實。文中用語"下調蛋白質的功能"也 可以與用語"敲低蛋白質的功能"或者"負面干擾蛋白質的功能"互換使用。蛋白質功能的 下調也可以意味著蛋白質不再以可溶形式存在于細胞中或者蛋白質不再以可溶形式存在 于其正常生物學環境中（例如（亞）細胞或者細胞外定位）。此外，其也可以意味著聚集 的蛋白質通過細胞的天然清除機制被降解且不再以可溶或不可溶形式被檢測到。此外，其 也可以意味著跨膜受體蛋白通過聚集劑誘導的所述跨膜蛋白的聚集而不再能結合其正常 配體（例如通過正常結合所述生長因子受體的配體與至少一個β-聚集結構域之間形成融 合體）。因此，蛋白質功能的下調也可以意味著是例如線粒體正常居住者的蛋白質通過誘導 蛋白質聚集的方法而不再存在于其中。在一個特異實施方案中，"蛋白質功能的下調"或者 "蛋白質功能的負面干擾"或者"敲低蛋白質功能"是與所述蛋白質的正常功能（100% )相 比其功能喪失至少20 %、至少30 %、至少40 %、至少50 %、至少60 %、至少70 %、至少80 %、 至少90%、至少95 %或者甚至100%。
[0017] 蛋白質的功能或者蛋白質不在其正常生物學環境中存在（定位）可以便利地通過 本領域已知方法確定。例如，根據感興趣的靶蛋白質，通過測量降低的酶活性而可以確定功 能。蛋白質在其正常生物學環境中的存在減少可例如通過測量復合物形成減少、靶蛋白質 在亞細胞區室中出現減少、以可溶形式存在的靶蛋白質、以聚集（在此與不溶是等價詞）形 式存在的靶蛋白質等進行測量。或者，下調靶蛋白質的作用可以在細胞測定中測量（例如 生長的喪失或獲得，侵潤的喪失或獲得，蛋白酶解活性的喪失或獲得）。
[0018] 在一個特異實施方案中，蛋白質的