玉米分泌型磷脂酶A2基因ZmsPLA2-2在改變植物抗旱性中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬植物生物工程育種領域，具體說，涉及一種玉米分泌型磷脂酶A2基因 ZmsPLA2-2在改變植物抗旱性中的應用。
【背景技術】
[0002] 磷脂作為細胞膜的骨架成分，在細胞膜感受刺激并傳遞信息進入細胞的過程中發 揮十分重要的作用。當細胞膜上的受體接受外界信號后，受體激活相關酶將磷脂轉變為信 號分子，如磷酸肌醇（phosphoinositides，PIs)、三磷酸肌醇（IP3)、二酯酰甘油 (diacylglycerol，DAG)、磷脂酸（phosphatidicacid，PA)、游離脂肪酸（freefattyacid， FFA)等，進而引發細胞內的一系列反應。磷脂信號參與光合作用、激素信號等調控，影響植 物生長發育過程及抗逆性。
[0003] 磷脂酶A(phospholipaseA，PLA)家族由磷脂酶A1 (PLA1)和磷脂酶A2(PLA2)兩類 組成。二者分別在sn-Ι和sn-2位上催化磷脂的水解。其中PLA2催化磷脂生成sn-Ι位帶酰基 鏈的溶血磷脂和自由脂肪酸(FFA)，廣泛存在于細菌、植物、哺乳動物組織的細胞和分泌物 中。在植物中，PLA2參與了多種生命活動，如衰老、損傷、脅迫應答、病原體防御和誘導次級 代謝物積累等。PLA2可分為五種類型:分泌型PLA2(sPLA2s)，胞質Ca2+依賴型PLA2(cPLA2s)， Ca2+不依賴型PLA2(iPLA2s)，PAF酰基水解酶(PAF-AH)和溶酶體PLA2s。植物中未發現胞質 Ca2+依賴型cPLA2,其PLA2主要是sPLA2和與動物iPLA2同源的類patatinPLA2(PAT-PLA2)。 PAT-PLA2是PLA2和PLA1活性兼有的脂酰水解酶。植物特異性的PLA2是sPLA2。不同種類的 PLA2結構、功能各有不同，但其生理生化特性卻有許多相似之處。
[0004]sPLA2基因的序列已經從多種植物中克隆得到。1999年，Kim等和S彳ahl等分別從康 乃馨和水稻中克隆到可能的sPLA2基因全序列（序列號分別為AF064732，AJ238116和 AJ238117)。2003年，Lee等和Bahn等對擬南芥數據庫搜索發現與動物sPLA2同源的同工酶有 4個，分別為AtPLA2-a(At2g06925)、AtPLA2-0(At2gl969O)、AtPLA2-γ(At4g29460)和 AtPLA24(At4g29470)。其中，AtPLA2-a和AtPLA2-y有了較詳細的研究。2010年，Liao和 Burns從甜橙中克隆到兩個sPLA2基因CssPLA2-a和CsPLA2-0，并發現光調控這兩個基因的 表達。
[0005] 植物SPLA2在氨基酸水平與動物SPLA2的相似性較低(約15% )，它們之間的Ca2+結 合環和活性位點元件相似性為50%。植物sPLA2可分為兩個亞型：第一亞型有AtPLA2-a、榆 樹的sPLA2、水稻的SPLA2-II和SPLA2-III、番茄和康乃馨sPLA2s，亞型內的氨基酸序列相似 性為47% ;第二亞型有AtsPLA2-i3、_γ、-δ和水稻的SPLA2-I，亞型內的氨基酸序列相似性為 54%。亞型之間的氨基酸序列相似性為29%。植物sPLA2包含PLA2的特征性結構域PA2C。該 結構域由Ca2+結合環(YGKYCGXXXXGC)和催化位點元件(DACCXXHDXC)組成。催化位點元件有 極保守的His/Asp二價體。在植物的Ca2+結合環上發現動物sPLA2中兩個保守氨基酸殘基， Tyr和Gly，它們參與氫鍵形成。在植物的SPLA2上也發現了介導蛋白分泌的N-端信號肽。洋 蔥表皮細胞的瞬時表達分析發現AtPLA2-i3和AtPLA2- γ的確分泌到細胞間隙中。另外，AtPLA2-0、水稻SPLA2-I、甜橙CsPLA2-0分別在C-端有KTEL、KLEL和KFEL，這與內質網滯留序 列KDEL和HDEL極為相似。所有已鑒定的植物sPLA2s中都包含12個極為保守的半胱氨酸殘 基，后者可能形成六對二硫鍵。動物sPLA2s的研究已表明這些半胱氨酸殘基對酶的結構和 活性極為重要。sPLA2在內質網中切除信號肽后，以成熟形式分泌到細胞間隙。AtPLA2-i3和 AtPLA2-y的成熟形式的酶活性分別比加工前提高了2倍和1.3倍。這種變化歸因于加工過 程中酶分子的結構重排。植物sPLA2最早從榆樹種子胚乳中純化得到(Stihl et al.，1998)。 它是一種15kD左右低分子量的水溶性蛋白，對熱、酸、有機溶劑極不敏感，但對二硫鍵還原 劑極為敏感，活性需堿性pH和Cah^tPIJ^-a和AtPLA2_i3在沸水處理5分鐘后仍然保持80-95%的活性，而在還原劑-511^〇1'1'存在時，活性僅為原來的35-65%(^七?1^2-€[^七?1^2-0、 AtPLA2-y和AtPLA2-S酶活的最適pH范圍分別為pH6~11、ρΗ6~7、pH 7~9和pH 8~9,而 細胞間隙的pH為pH5~6，這表明AtPLA2- γ和AtPLA2-S可能在亞細胞定位處是失活的，其激 活需要升高pH<Xa2+濃度影響sPLA2s的酶活，隨著Ca2+濃度升高到10mM，AtPLA2_a的特異活 性持續升高，而4丨?1^2-|3)丨?1^2-丫^丨?1^2-6在微摩濃度的0 &2+下酶活性已達到平臺值。 榆樹的sPLA2酶活性與Ca2+的關系與AtPLA2-a相似。AtsPLA2s酶活性需要的Ca2+濃度及pH值 不同，暗示在植物受外界刺激時sPLA2s的活性可能受Ca2+水平和pH值變化的調節。
[0006]關于PLA2的上游信號人們知之甚少，對哪種PLA2參與了某一特定的應答反應也了 解很少。有工作表明PLA2在植物對藍光、生長素、非生物脅迫和病原體刺激的應答中被激 活。對于PLA2下游靶基因的研究，較多地依賴于從sPLA2的生化和分子特征分析推測。（1) PLA2可能在細胞內外的信號傳導中發揮作用。PLA2的產物之一溶血磷脂酰膽堿在細胞中可 快速移動，可能是胞質內和細胞間信號傳導的信使。有證據表明動物細胞中溶血磷脂酰膽 堿激活蛋白激酶，植物中也有多不飽和脂肪酸和溶血磷脂可激活蛋白激酶的報道。（2)PLA2 調控氣孔開放。藍光和紅光可通過激活H+-栗誘導氣孔開放，而這種效應可被sPLA2的抑制 劑抑制，說明sPLA2可能參與保衛細胞的光信號轉導。與該設想一致的是在擬南芥中通過改 變AtsPLA2-i3基因的表達水平觀察到氣孔開放的變化，也證明AtsPLA2-i3調控光誘導的氣孔 開放。（3)PLA2可能參與介導生長素誘導的細胞伸長。AtsPLA2-i3在幼苗和生長活躍組織中 表達強度較高，且受生長素誘導。Gilnther等(2007)指出PLA2在生長素調節的基因表達中發 揮重要作用。生長素激活PLA2,從而提高溶血磷脂和FFA的水平，激活H+栗。后者誘導質外體 酸化，促進細胞伸長。在幼苗和生長活躍組織中AtsPLA2-i3表達強度較高，且被生長素誘導。 AtsPLA2-邱勺過表達的確可以促進細胞伸長，產生伸長的葉柄和花序莖，而對該基因的RNAi 導致細胞伸長延滯。AtsPLA2-i3通過介導生長素誘導的細胞伸長在根的向地性反應中起著 重要作用。與之相一致的是，某些生長素依賴型的基因表達，其誘導可被PLA2抑制劑抑制， 說明PLA2在生長素調控的基因表達中發揮重要作用。在擬南芥根的研究中發現PLA2是生長 素流入載體PIN-FORMED蛋白運輸到質膜所必需的。（4)PLA2在植物衰老中的作用。植物中 PLA2的產物溶血磷脂如溶血磷脂酰膽乙醇胺和溶血磷脂酰肌醇可特異抑制PLDa活性。已知 PLDa引起細胞膜損害而促進植物衰老。這表明溶血磷脂可能影響植物的衰老。外源施用LPE 的確可延遲不同植物器官的衰老。（5)PLA2在植物防御中有重要作用。PLA2作用于膜脂后可 產生游離的亞麻酸和亞油酸。它們可作為十八碳烯酸途徑中脂氧合酶的底物，產生脂質過 氧化物，并進一步產生茉莉酸（」& 8!11〇11化，從）。從是植物防御反應中的重要調節子，作為系 統脅迫信號分子可以激活多種植物防御反應相關基因的表達，促進植保菌素積累和病原相 關蛋白的合成等，并可啟動苯丙氨酸裂解酶基因的轉錄，調控查爾酮合成酶、營養貯藏蛋 白、富含羥脯氨酸的細胞壁蛋白等相關傷害防御基因的表達。盡管已知植物PLA2有如此重 要的生理功能，但是對于低分子量的分泌型PLA2(sPLA2)及其編碼基因的性質了解很少。目 前已從擬南芥（Leeetal. ,2003)、康乃馨（carnation) (_S.tMi.letal·，1999)、水稻（Kimet al. ,1999)、甜澄(Citrussinensis)(LiaoandBurn,2010)中克隆到sPLA2基因序列。
[0007] 由sPLA2產物調控的下游信號可能包括蛋白激酶，H+-ATPase和PLDa，這些信號途 徑介導如細胞伸長、重力反應、衰老、種子成熟、氣孔開放和防御及脅迫應答等過程。PLA2的 水解產物脂肪酸和溶血磷脂已被證明可激發質膜上的一些酶如H+-ATPase、NADH氧化酶和 蛋白激酶，從而引發許多生理反應，如：活化膜上的H+、K+、Ca2+流動、產生活性氧，調節抗逆 基因的表達，調節胞內的pH值等。
[0008] 栽培植物的抗旱性提高無疑具有重要的經濟價值和生態意義，是農業領域中的關 注課題。采用生物技術提高植物抗旱性已有眾多工作，但仍是植物生物技術和農業領域的 研究熱點，開發具有能顯著提高植物抗旱性的基因有重要意義。

【發明內容】

[0009] 針對目前的研究現狀，本發明的目的是提供一種玉米分泌型磷脂酶A2基因 ZmsPLA2-2在改變植物抗旱性中的應用。
[0010]本發明所述的玉米分泌型磷脂酶A2基因ZmsPLA2-2在改變植物抗旱性中的應用： [0011] 其