一種新城疫病毒耐熱改造方法及應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于病毒反向遺傳操作領域，尤其涉及一種新城疫病毒耐熱改造方法及應 用，更具體地，本發明涉及一種對非耐熱新城疫病毒進行耐熱改造的方法和耐熱改造后的 重組病毒在疫苗制備方面的應用。
【背景技術】
[0002] 新城疫（NewcastleDisease，ND)是由新城疫病毒（NewcastleDiseaseVirus， NDV)引起的極易傳染的毀滅性疾病，有較高的發病死亡率，被國際獸疫局規定為僅有的兩 種A類禽病之一，另一種為禽流感。新城疫病毒屬副粘病毒科（Paramyxoviridae)腮腺炎 病毒屬（Avulavirus)。新城疫病毒的基因組為單股、負鏈、不分階段的RNA，全長為15186 個堿基，遵循六堿基原則，包含55堿基的3'前導序列和5'后隨序列，兩者之間存在6個 結構基因，按順序排列分別為3'-NP(核衣殼蛋白）-P(磷酸化蛋白）-M(基質蛋白）-F(融 合蛋白）-HN(血凝素神經氨酸酶蛋白）-L(大聚合酶蛋白）-5 '，基因組編碼至少7個蛋白。 在各個結構基因開放閱讀框的起始和終止端都存在轉錄控制序列，分別為起始序列（Gene start，GS)和終止序列（Geneend，GE)，各個基因間存在1-47個數量不等的核苷酸間隔區 (IGS)。
[0003] 雞新城疫首次于1926年爆發于印尼的爪哇和英國的新城，一直在除大洋洲以外 的全世界范圍內發生流行，給全球造成了巨大的經濟損失。在我國，新城疫也是危害最為嚴 重的禽病之一，許多地區一直都有該病流行，典型的新城疫以呼吸困難、下痢、神經紊亂、消 化道粘膜廣泛出血等為特征。新城疫的控制以免疫預防為主，屬國家強制性免疫疫病。近 年來隨著疫苗的廣泛應用，新城疫的大規模暴發流行已受到明顯控制，但該病出現了新的 流行特點，如非典型新城疫不斷發生、混合感染普遍和宿主范圍不斷擴大等。
[0004] 目前，國際上生產和使用的新城疫疫苗有兩大類，即活疫苗和滅活疫苗。活疫苗 包括低毒力株疫苗和中等毒力株疫苗，低毒力株疫苗包括Π系苗（Bl)、III系苗（LaSota 株）、Clone-30、V4等；中等毒力疫苗包括I系苗、Roskin株、Komorov株、Hert33株和 Mukteswar株等。有些低毒力活疫苗具有獨特的耐熱特性，稱之為耐熱活疫苗，代表株有 V4、HB92和TS09-C株等。此類疫苗具有耐熱、低毒、免疫效果好、可同群感染、多途徑免 疫（拌料、噴霧等）等優點，適用于雞、鴿、鵪鶉等多種禽類的新城疫防控。與其他非耐熱 疫苗相比，該疫苗在氣溫普遍較高的南方地區和冷鏈條件較差的農村推廣應用更有優勢， 在新城疫的防控中發揮了重要作用。但目前應用最為廣泛的低毒力疫苗株LaSota株以及 中等毒力株均為非耐熱型新城疫病毒株。因此，探討新城疫病毒的耐熱機理以及如何提高 LaSota株等其他新城疫病毒株的耐熱特性顯得極具意義。
[0005] 現有關于新城疫反向遺傳技術的文獻較多，但均未見涉及到對新城疫病毒進行耐 熱改造的方法的報道。例如：專利號為200510097997. 8的文獻"新城疫LaSota疫苗株反向 遺傳操作系統及其應用"公開了以新城疫病毒LaSota疫苗株為基礎的非耐熱活疫苗載體， 但未涉及對新城疫病毒耐熱改造的方法；專利號為200610075781. 6的文獻"表達禽流感病 毒H5亞型HA蛋白的重組新城疫LaSota弱毒疫苗株"公開了以新城疫LaSota疫苗株載體 構建的禽流感、新城疫二聯基因工程活疫苗，也未涉及到對新城疫病毒耐熱改造的方法；申 請號為CN201310090099. 4的文獻"新城疫病毒耐熱活疫苗載體系統及其應用"公開了新城 疫病毒耐熱活疫苗載體系統，但未涉及到對非耐熱新城疫病毒的耐熱改造方法。

【發明內容】

[0006] 本發明所要解決的技術問題是克服現有技術的不足，提供一種新城疫病毒耐熱改 造的方法及應用。
[0007] 為實現上述發明目的，本發明的技術方案如下：
[0008] -種新城疫病毒耐熱改造方法，該方法包括如下步驟：a.構建非耐熱新城疫病毒 的轉錄質粒；b.將非耐熱新城疫病毒的轉錄質粒中的HN基因替換為耐熱新城疫病毒的HN 基因，獲得改造的轉錄質粒；c.將改造的轉錄質粒與三個輔助質粒共同轉染宿主細胞，獲 得耐熱改造的重組新城疫病毒。
[0009] 按上述方案，所述的非耐熱新城疫病毒的轉錄質粒能表達非耐熱新城疫病毒的全 基因組cDNA。
[0010] 按上述方案，所述的非耐熱新城疫病毒為LaSota株。
[0011] 按上述方案，所述的耐熱新城疫病毒為TS09-C株，其HN基因序列為SEQIDN0:1。
[0012] 按上述方案，所述的三個輔助質粒能夠分別表達新城疫病毒的核蛋白、磷蛋白和 大聚合酶蛋白。
[0013] 按上述方案，所述的耐熱改造的重組新城疫病毒為rT-HN株，已于2015年8月3 號保藏于中國典型培養物保藏中心（CCTCC)，保藏地址是中國，武漢，武漢大學，其微生物保 藏號為：CCTCC NO:V201529。
[0014] 按上述方案，所述的重組新城疫病毒rT-HN株在制備防制新城疫的耐熱活疫苗方 面的應用。
[0015] 本發明的技術原理在于：
[0016] 1)利用反向遺傳操作技術，將耐熱TS09-C株和非耐熱LaSota株進行NP、P、M、F、 HN和L基因的逐個互換，通過研究基因互換后的重組病毒的耐熱特性的改變，最終確認HN 基因是決定新城疫病毒耐熱的關鍵因子，為新城疫病毒耐熱改造方法的建立提供了理論支 撐和實踐經驗；
[0017] 2)將非耐熱新城疫病毒的全基因組RNA通過RT-PCR擴增、克隆連接的方式，連接 入低拷貝質粒中，獲得非耐熱新城疫病毒的轉錄質粒；
[0018] 3)通過RT-PCR方式擴增獲得耐熱新城疫病毒的HN基因，通過基因克隆的方法，將 非耐熱新城疫病毒的轉錄質粒中的HN基因替換為耐熱新城疫病毒的HN基因，獲得改造后 的轉錄質粒；
[0019] 4)將能夠表達T7 RNA聚合酶的痘苗病毒預感染宿主細胞，再將改造后的轉錄質 粒和三個輔助質粒（分別表達NP、P和L蛋白）進行細胞共轉染。首先，痘苗病毒能夠在宿 主細胞內表達T7 RNA聚合酶；然后，T7 RNA聚合酶識別轉錄質粒上的T7啟動子序列，并啟 動RNA的復制過程，在T7終止子處終止復制，復制出的RNA序列即為嵌合有耐熱新城疫病 毒HN基因的非耐熱新城疫病毒基因組；嵌合基因組RNA與三個輔助質粒表達出的NP、P和 L蛋白一起構成核蛋白復合體，啟動病毒RNA的首輪轉錄及病毒蛋白的翻譯合成，病毒的各 個組份通過自包裝產生具有感染性的重組病毒粒子。該病毒粒子除HN蛋白來源于耐熱病 毒外，其余蛋白均來源于非耐熱病毒。由于HN基因是新城疫病毒的關鍵耐熱因子，所以以 非耐熱新城疫病毒為骨架，嵌合有耐熱新城疫病毒HN基因的重組病毒具有了較好的耐熱 特性，從而實現了對新城疫病毒的耐熱改造；
[0020] 5)由于新城疫病毒不同毒株在基因組結構和生物學特性等方面具有高度相似性， 所以很多研究方法或技術在新城疫病毒不同毒株之間是通用的，如：新城疫病毒的PCR檢 測方法可以檢測所有新城疫病毒株；新城疫病毒強毒株的反向遺傳操作方法同樣適用于新 城疫病毒弱毒株；通過修改新城疫病毒LaSota弱毒株的F裂解位點，可將其改造為強毒株， 該方法同樣可被用于改造其他新城疫弱毒株。因此，本發明建立的新城疫病毒耐熱改造方 法不僅僅適用于LaSota株，也適用于其他所有新城疫病毒株。
[0021] 本發明的有益效果為：
[0022] 1)本研究以新城疫病毒非耐熱LaSota株的轉錄質粒為基礎，將LaSota株的轉 錄質粒中的HN基因替換為耐熱新城疫病毒TS09-C株的HN基因，構建出了改造的轉錄質 粒，并成功獲得了新的重組病毒。耐熱試驗結果表明，新的重組病毒的耐熱特性明顯高于 LaSota親本株，證實了用該方法對新城疫病毒進行耐熱改造的能力。利用本發明建立的新 城疫病毒耐熱改造方法，可構建出一系列新的重組耐熱新城疫病毒株，并應用于耐熱新城 疫疫苗的制備；
[0023] 2)相對于傳統的新城疫疫苗，耐熱新城疫疫苗具有如下優點：a)可在4度甚至常 溫保存，相比于常規疫苗的冷凍保存，將極大地降低運輸、保存成本；b)提高疫苗產品的熱 穩定性，延長疫苗的保質期，確保疫苗的使用效果；c)使用方便，可通過拌料、氣霧、點眼、 滴鼻等方式免疫。
【附圖說明】
[0024] 圖1是耐熱改造的新城疫病毒rT-HN株的構建示意圖。
[0025] 圖2是耐熱改造的新城疫病毒rT-HN株的生長曲線。
[0026] 圖3是耐熱改造的新城疫病毒rT-HN株的耐熱特性測定結果。
【具體實施方式】
[0027] 以下結合附圖和實施例進一步對本發明進行說明，但本發明的內容不僅僅局限于 下面的實施例。
[0028] 實施例1
[0029] 新城疫病毒非耐熱LaSota株的轉錄質粒的構建
[0030] 新城疫病毒非耐熱LaSota株的轉錄質粒包含了LaSota株的全基因組序列、T7 RNA聚合酶啟動子序列、T7RNA聚合酶終止子序列、丁型肝炎病毒核酶序列和低拷貝質粒 序列等，其主要功能是轉錄表達并準確切割出LaSota株的全基因組RNA序列。其構建策略 為：首先分片段擴增全基因組序列，共分為A-D4個片段。其中在A片段的上游加入了T7 啟動子，D片段的下游加入了丁型肝炎病毒核酶序列和T7終止子。通過普通PCR、融合PCR 和引物自延伸的方法擴增獲得4個片段后，通過In-fusionPCR克隆的方式，將4個片段依 次連入低拷貝質粒中，獲得轉錄質粒。
[0031] 1.病毒RNA的提取及RT反應
[0032] 以新城疫病毒LaSota株雞胚尿囊液為對象，參照試劑盒說明書進行病毒基因組 RNA的提取。將總RNA溶解于17μ1 DEPC 7K，加入1μ1隨機引物，75°C 5min，立即冰浴，然 后加入逆轉錄反應液：5XRT Buffer 5μ1，dNTPs (10mM) 1μ1和M-MLV 1μ 1。42°C 60min， 95°C 5min，獲得病毒的基因組cDNA，于-20°C保存，待PCR擴增。
[0033] 2.四個片段的PCR擴增及克隆
[0034] 設計并合成了四對覆蓋病毒全基因組的PCR引物。為方便In-fusion克隆，片段 之間留有重疊區域。以病毒cDNA為模板，進行病毒全基因組DNA的PCR擴增。PCR反應體 系由10父81^€6廠]\%(：12(251111)、(1犯1^、上、下游引物（1(^]\1)、了39酶、〇0嫩和水組成。其中 上、下游引物由于擴增片段的不同而不