本發明涉及腫瘤基因領域，具體涉及一種用于檢測腎癌的引物組及檢測方法。
背景技術：
：腎癌是起源于腎實質泌尿小管上皮系統的惡性腫瘤，學術名詞全稱為腎細胞癌，又稱腎腺癌，簡稱為腎癌，是最常見的腎臟實質惡性腫瘤，由于平均壽命延長和醫學影像學的進步，腎癌的發病率比前增加，腎癌患者的主訴和臨床表現多變，容易誤診為其他疾病。腎位置隱蔽，與外界主要的聯系是尿，因此血尿是發現腎癌最常見的病狀，但血尿的出現必須在腫瘤侵入腎盂后方才有可能，因此已不是早期病狀。因此對腎癌的早期診斷十分必要。目前腎癌的診斷方法包括影像學檢查，細胞病理學和組織病理學診斷。影像學檢查包括X射線、CT掃描、超聲掃描、核磁共振檢查等，但是其效率較低并且檢測準確度不高。通常的細胞和組織病理學檢測包括細胞活檢，需要通過外科手術或者穿刺的方法從患者上獲取腫瘤組織的檢材。不但不方便，而且會對患者造成人體傷害，甚至可能造成穿刺道腫瘤轉移。近來，循環腫瘤細胞(CirculatingTumorCells，CTCs)檢測的出現給患者的檢測帶來了新的希望。CTCs是從腫瘤病灶脫離并移位至血液中的腫瘤細胞，是惡性腫瘤患者術后復發和遠處轉移的重要原因，也是導致腫瘤患者死亡的重要因素。與其他組織學標本如骨髓等相比，外周血標本容易獲取，且對患者創傷小，是臨床上常規檢測較為理想的標本來源。CTCs檢測有助于腫瘤的早期診斷、判斷患者預后、評估抗腫瘤藥物的療效及制定個體化治療方案。與傳統的診斷方法相比，CTCs檢測可更加敏感地發現疾病的變化，且對患者沒有副作用。CTC的檢測通常通過抽取一定體積的血液進行。檢測分為兩類，包括不捕獲(富集)直接檢測和先捕獲(富集)后檢測，其中后者為主流的檢測方法。先捕獲(富集)后檢測的方法也分為兩類，即正選和負選。正選主要是通過CTC表面標志物或細胞的物理性質(大小、密度)進行捕獲；前者是基于免疫磁球技術和微流控芯片技術，后者是基于過濾、離心的原理。負選則是通過白細胞表面標志物間接捕獲CTC。然而基于先捕獲(富集)后檢測的方法有著明顯的缺陷。它嚴重依賴于腫瘤細胞表面標記物的表達，因此無法捕獲未表達表面腫瘤標記物的CTC細胞。采用RT-PCR的方法檢測CTC細胞的特異性基因是CTC細胞檢測的另外一種方式。首先抽取一定體積的血液，通過密度梯度離心的方式富集CTCs，然后通過RT-PCR的方式檢測特定基因的mRNA，以此判斷CTCs是否存在，并通過檢測CT值的變化給CTCs定量。這種方法檢測CTCs費用低，敏感度高，而且容易自動化。目前RT-PCR方法檢測腎癌CTCs檢測的標準還沒有建立。我們通過檢測腎癌患者的CTCs特征基因，確定腎癌CTCs的檢測方法和檢測標準。這些檢測方法和標準的建立有助于腫瘤患者的早期診斷、判斷患者預后、評估抗腫瘤藥物，包括NK和CAR-T免疫治療的療效及制定個體化治療方案。針對上述問題，本發明開發一種高靈敏的多基因聯合檢測的試劑盒，通過聯合檢測MN/CA9，TS，CYP3A4，PD-L1，VEGFR2，cadherin-6，CK19，CD24和EPCAM9個基因實現腫瘤的早期篩查或診斷。本發明設計運用靶向特異性引物組，大幅度提高檢測的靈敏度。該檢測方法的檢出率可達到96％，同時具備了靈敏度高，特異性好，快速準確等優點。技術實現要素：本發明的目的在于針對現有技術的不足，提供一種用于檢測腎癌的引物組及檢測方法。本發明的目的是通過以下技術方案實現的：一種用于檢測腎癌的引物組，包含：本發明的引物組可通過以下兩種方法實現腎癌的檢測。方法1：PCR方法。(1)將權利要求1所述的9對引物分別加入到單個PCR反應管中，并均加入核酸提取物、反轉錄酶、RNA酶抑制劑、DNA聚合酶、dNTP；其中，PCR反應的每個循環的條件為94攝氏度、30s；55攝氏度、30s；72攝氏度、10s；(2)進行反轉錄和PCR反應，用瓊脂糖凝膠電泳法進行檢測。方法2：熒光定量PCR方法(1)將權利要求1所述的9對引物分別加入到單個PCR反應管中，并均加入核酸提取物、反轉錄酶、RNA酶抑制劑、DNA聚合酶、dNTP；分別加入2×ChamQSYBRqPCRMasterMix，其中，PCR反應的每個循環的條件為95攝氏度、10s和60攝氏度、30s；40個循環；每管設立三個復孔；(2)進行反轉錄和PCR反應，并實時檢測熒光；(3)根據熒光檢測結果計算出的Ct值，判斷是否有標志物靶基因表達于樣品中。本發明的有益效果在于：本發明通過設計特異性PCR引物，開發出用于腎癌早期檢測的多基因聯合檢測方法。此方法：(1)建立的PCR體系可對MN/CA9，TS，CYP3A4，PD-L1，VEGFR2，cadherin-6，CK19，CD24和EPCAM基因進行聯合檢測；(2)通過同時對多個基因進行檢測腎癌檢出率可達到96％；(3)靈敏度高，低至1-5拷貝的基因表達水平均可檢出；(4)特異性強，正常人或非腎癌病人樣本很少會產生特異性信號；(5)檢測速度快，操作簡單，費用低廉。附圖說明圖1為實施例中健康人外周血樣本檢測陰性PCR圖。圖2為實施例中非腎癌患者外周血樣本檢測陰性PCR圖。圖3為實施例中非腎癌患者腫瘤組織檢測陰性PCR圖。圖4為實施例中腎癌患者外周血檢測陽性PCR圖。圖5為實施例中腎癌患者腫瘤組織檢測陽性PCR圖。圖中，M.100bpmarker；1.B2M，2.MN/CA9，3.TS，4.CYP3A4，5.PD-L1，6.VEGFR2，7.cadherin-6，8.CK19，9.CD24，10.EPCAM。具體實施方式本發明針對目前腫瘤中主要的驅動性突變基因，聯合檢測MN/CA9，TS，CYP3A4，PD-L1，VEGFR2，cadherin-6，CK19，CD24和EPCAM9個基因實現腎癌的早期篩查或診斷。針對目前檢測方法靈敏度低，檢測過程復雜繁瑣，檢測所需時間長，無法滿足臨床檢測的實際需求。針對上述問題，設計出用于檢測上述9個基因的一整套特異性引物組。根據上述9個基因的參考序列設計特異性擴增引物，其PCR產物長度最優是在180-200bp之間，退火溫度不高于60度，GC含量在40-60％之間，符合一般引物設計軟件的要求。通過采用實時熒光PCR反應檢測體系，實現多個基因聯合的高靈敏檢測，其檢測方法如下所述。本發明結合附圖和實施例作進一步的說明。如未特別指明之處，可根據本領域技術人員所熟悉的《分子可隆實驗指南》第三版(ColdSpringHarborlaboratoryPress)、《細胞實驗指南》(科學出版社，北京，中國，2001年)、《RNA實驗技術手冊》(科學出版社，北京，中國，2004年)、《免疫檢測技術》(科學出版社，北京，中國，1991)等實驗手冊以及本文所引用的參考文獻中所列方法來實施。其中，所用的(帶標記的)探針、引物可以委托上海生工生物工程技術服務有限公司合成。下面結合實施例對本發明作進一步說明。實施例1:基因選擇多項研究表明，單基因篩查敏感度約為20-60％，大部分用于腫瘤早期篩查的單個基因檢測，其檢測敏感度或特異度偏低，不能滿足臨床需要。采用多基因聯合檢測可以有效解決敏感度低的問題，提高腫瘤早期篩查和診斷的準確度。為了提高早期腫瘤的檢出率，提高腫瘤患者的治愈率，改善病人預后，我們對腎癌和正常組織的差異表達基因進行了篩選。我們通過大量比對實驗發現MN/CA9，TS，CYP3A4，PD-L1，VEGFR2，cadherin-6，CK19，CD24和EPCAM組成的基因組對腎癌具有較高的檢出率，達到96％，相對于現有的檢測技術，產生了意想不到的技術效果，具有顯著的進步。實施例2:引物篩選(1)設計引物a1～a3、b1～b3、c1～c3、d1～d3、e1～e3、f1～f3、g1～g3、h1～h3、i1～i3，具體為：利用生物信息學軟件對靶基因A-I序列進行分析，利用序列分析軟件設計特異性引物組，利用NCBI引物搜索軟件檢測各配對引物在人基因組中的特異性，分別設計出3對特異性擴增引物a1～a3、b1～b3、c1～c3、d1～d3、e1～e3、f1～f3、g1～g3、h1～h3、i1～i3；表1：PCR檢測引物(2)外周血樣品的處理收集某醫院收治并經病理證實的腎癌患者外周血，清晨7點，空腹，經肘靜脈采集新鮮血液，存放于抗凝管中，搖勻，常溫下保存≤4h。2.1將抗凝管中的全血樣本加入等體積PBS(pH7.0)，于室溫3000rpm離心5min，去除上層血漿；2.2加入等體積氯化銨紅細胞裂解液(可購自碧云天)，于室溫200rpm離心8min混勻后，以3000rpm室溫離心5min，棄去上清；2.3將下層血細胞和生理鹽水按照體積比1:2～2:1混合后，加入Ficoll分離液，混合液與Ficoll分離液的體積比為1:2～2:1，離心力為700g，離心20～40min；2.4吸棄上清，取細胞沉淀，洗滌，即得到PBMC；2.5取PBMC用于核酸提取，多余的PBMC用RNA保護劑重懸，保存于-20度。(3)核酸的提取3.1取不多于5×105的PBMC，加入250μLBufferRLTPlus，吹打混勻；3.2將裂解液轉移至gDNA清除離心型柱中，8000×g(10,000rpm)離心30s。收集流穿液，棄離心柱；3.3加入1倍體積的70％乙醇(350μL)至流穿液中，吹打混勻；3.4將樣品轉移至RNeasyMinElute離心柱，蓋緊蓋子，8000×g(10,000rpm)離心15s，棄流穿液；3.5在RNeasyMinElute離心柱中加入700μLBufferRW1，蓋緊蓋子，8000×g(10,000rpm)離心15s，棄流穿液；3.6在RNeasyMinElute離心柱中加入500μLBufferRPE，蓋緊蓋子，8000×g(10,000rpm)離心15s，棄流穿液；3.7將RNeasyMinElute離心柱置于新的2mL收集管中，打開蓋子，全速離心5min，使乙醇揮發；3.8將RNeasyMinElute離心柱置于新的1.5mL收集管中，加入20μLRNase-freeH2O，蓋緊蓋子，全速離心1min洗脫RNA。(4)模板cDNA的獲得4.1準確測得樣品RNA濃度；4.2嚴格按照cDNA反轉錄試劑盒說明書在冰上制備反轉錄體系；成分體積5×Mix8μLRNA500ngRNase-freeH2O至40μL4.3輕柔混勻以上反應體系，并利用離心機短暫離心，55度20min，85度2min，獲得模板cDNA；(5)普通PCR擴增用TaqDNA聚合酶配置反應體系，用引物為a-i和人內參基因(B2M)進行PCR擴增各樣品，產物用1％凝膠檢測；擴增體系成分體積2×Mix10μLcDNA1μL引物-F0.8μL引物-R0.8μLRNase-freeH2O7.4μLPCR反應條件是95℃預變性3分鐘，1個循環；95℃變性20秒，55℃退火20秒，72℃延伸10秒，35個循環；72℃延伸7分鐘。(6)熒光實時定量PCR擴增根據設計的特異引組a-i，通過熒光定量PCR進行擴增，體系如下：95℃預變性20s，1個循環；95℃10s，60℃30s，40個循環；每管設立三個復孔；根據步驟5和6的pcr結果，篩選出以下引物組，作為本發明用于檢測腎癌的引物組。實施例3：效果驗證根據實施例2的篩選結果，采用下表所述的引物組對100個腫瘤樣本進行檢測。其中，CD10的正向引物為TGATGATAAGAATTCTGTGA，反向引物為GCAAGCTGGTTTTCATCGAT，N-cadherin的正向引物為CCTTAACTGAGGAGTCAGTG，反向引物為CAGACCTGATCCTGACAAGC，Vimentin的正向引物為CGTGACGTACGTCAGCAATA，反向引物為AAGGGCATCCACTTCACAGG。1～8號引物組的檢出率如上表所示，從表中可以看出，引物組中，隨著引物數量的增加，在一定程度上可以提高其檢出率。進一步地，通過比較5～8號引物組可以發現，引物組內的組合對于檢出率的高低有重要影響。同時在相同的檢測基因數量情況下，5號引物組的檢出率高于6～8號引物組。因此，我們優選5號引物組的基因組合用于腎癌的檢測。進一步通過研究發現，5號引物組中，CK19的表達可提示上皮細胞來源的腫瘤,被認為有腫瘤轉移診斷價值；EPCAM的表達可提示上皮源性惡性腫瘤細胞,MN/CA9是碳酸酐酶家族成員，在正常人組織中極少表達，在腎惡性腫瘤中呈現高表達；TS是DNA生物合成的關鍵酶，與腫瘤的惡性生物學行為密切相關；CYP3A4是CYP3A亞家族的主要成員，也是成人肝微粒體CYP450中最重要的成分，現已發現CYP3A4參與了大約38個類別共150多種藥物(約占全部藥物50％)的代謝，對腫瘤治療用藥有指導作用；活化的T細胞與腫瘤相關蛋白PD-L1之間的相互作用導致細胞程序性死亡，臨床研究表明，PD-L1表達與不良預后和/或疾病進展相關；VEGFR-1與血管內皮生長因子(VEGF)相互作用影響腫瘤血管和淋巴管；cadherin-6在組織的生長發育中發揮重要作用，與腫瘤細胞的浸潤和轉移相關；CD24在促進腫瘤細胞增殖、黏附及轉移過程中發揮著重要作用，同時CD24過表達與腫瘤患者的不良預后相關。由上可知，本發明并不是將9對引物進行簡單疊加組合，9對引物相鋪相成，在功能上彼此支持，使得檢出率得到大幅度提升，取得了意想不到的技術效果。綜上所述，本專利中選擇的基因涉及腫瘤的代謝、增殖、侵襲等方面，可較為全面的檢測出腎癌的細胞生物學特征。實施例4：特異性分析根據實施例2的篩選結果，采用下表所述的引物組對正常人外周血樣本(圖1)、非腎癌病人的外周血(圖2)和組織樣本(圖3)、腎癌病人的外周血(圖4)和組織樣本(圖5)進行檢測。結果如圖1-5所示，從圖中可見所述的引物組在正常人外周血(圖1)、非腎癌病人的外周血(圖2)和組織樣本(圖3)中均未檢測到較強的基因的表達。在腎癌病人的外周血(圖4)和組織樣本(圖5)中可檢測到多個基因的強表達，分別為6/9和9/9，說明本發明中所述引物組具有相當高度的特異性。當前第1頁1 2 3