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序列表

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發明領域

本發明涉(she)及通過(guo)在(zai)發酵期間分離不同種類的vWF多(duo)聚(ju)體來在(zai)生物反應器(qi)中(zhong)改進von Willebrand因子(zi)(vWF)的重組生產的方(fang)法(fa)。

背景

生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)(wu)技術有望生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)產低成(cheng)本的(de)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)(wu)制藥產品(pin)，包括重(zhong)組(zu)(zu)(zu)蛋白。許多治(zhi)療性(xing)(xing)(xing)(xing)蛋白質(zhi)諸(zhu)如(ru)凝血(xue)(xue)因(yin)子具有治(zhi)療潛力(li)，如(ru)果它(ta)們可(ke)以(yi)以(yi)保留其生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)(wu)活性(xing)(xing)(xing)(xing)的(de)方(fang)式重(zhong)組(zu)(zu)(zu)產生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)，并產生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)足(zu)夠(gou)的(de)產量(liang)以(yi)商(shang)業(ye)上可(ke)行(xing)。例如(ru)，重(zhong)組(zu)(zu)(zu)產生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)的(de)凝血(xue)(xue)因(yin)子諸(zhu)如(ru)von Willebrand因(yin)子(vWF)具有廣泛治(zhi)療各(ge)種出血(xue)(xue)性(xing)(xing)(xing)(xing)疾(ji)病(bing)的(de)潛力(li)。然而，部分地由于(yu)天(tian)然存在(zai)的(de)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)(wu)分子的(de)固(gu)有復雜性(xing)(xing)(xing)(xing)以(yi)及(ji)與其在(zai)基(ji)因(yin)工程化細胞(bao)中的(de)重(zhong)組(zu)(zu)(zu)蛋白質(zhi)對應(ying)物(wu)(wu)的(de)合成(cheng)相(xiang)關的(de)限(xian)制的(de)多樣性(xing)(xing)(xing)(xing)，這種潛力(li)未得到充分滿足(zu)。因(yin)此，本領(ling)域強(qiang)烈需要改(gai)進生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)產重(zhong)組(zu)(zu)(zu)的(de)、高生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)(wu)活性(xing)(xing)(xing)(xing)的(de)治(zhi)療性(xing)(xing)(xing)(xing)蛋白質(zhi)諸(zhu)如(ru)vWF的(de)方(fang)法。

重組治(zhi)療性(xing)蛋(dan)白質通常在真核細胞(bao)中(zhong)表達，所(suo)述真核細胞(bao)在不同大小的生物反(fan)應器(qi)中(zhong)培養。操作這樣的生物反(fan)應器(qi)的幾種模式(shi)在本領域(yu)中(zhong)是已知的，如補料分批方法和灌注方法。在這樣的發酵方法中(zhong)，期望(wang)維持高細胞(bao)活力和細胞(bao)密度，以(yi)便獲得(de)便于后(hou)續(xu)純化的濃縮(suo)形(xing)式(shi)的所(suo)需重組蛋(dan)白。

WO 2008/006494公開了一種灌注(zhu)方法，其中通過將培(pei)養基組分(fen)供給到在(zai)生物(wu)(wu)(wu)反(fan)應器(qi)里的(de)細胞(bao)培(pei)養物(wu)(wu)(wu)中，實(shi)現(xian)將所需治(zhi)療(liao)性蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)質在(zai)細胞(bao)培(pei)養上清液中累積達到高(gao)濃度(du)，并(bing)且(qie)包含(han)細胞(bao)、治(zhi)療(liao)性蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)質和細胞(bao)培(pei)養基的(de)細胞(bao)培(pei)養物(wu)(wu)(wu)在(zai)分(fen)離(li)(li)(li)系統上循環(huan)，其中分(fen)離(li)(li)(li)系統將治(zhi)療(liao)性蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)質與分(fen)子(zi)量(liang)低于(yu)治(zhi)療(liao)性蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)質的(de)物(wu)(wu)(wu)質(如代謝物(wu)(wu)(wu))分(fen)離(li)(li)(li)。在(zai)WO 2008/006494中待與目(mu)標治(zhi)療(liao)性蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)質分(fen)離(li)(li)(li)的(de)物(wu)(wu)(wu)質的(de)截留分(fen)子(zi)量(liang)(MWCO)為(wei)5,000Da至(zhi)500,000Da，優選(xuan)至(zhi)多(duo)100,000Da。

EP2171034公開(kai)了在連(lian)續發酵(jiao)方法中(zhong)生(sheng)(sheng)產生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)聚合(he)(he)物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)的(de)(de)(de)方法，其(qi)中(zhong)使用雜質(zhi)過(guo)(guo)(guo)濾器(qi)(qi)，其(qi)允許從(cong)生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)反應器(qi)(qi)中(zhong)將(jiang)分子(zi)(zi)量低于目(mu)(mu)(mu)標生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)聚合(he)(he)物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)的(de)(de)(de)分子(zi)(zi)量的(de)(de)(de)雜質(zhi)從(cong)目(mu)(mu)(mu)標生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)聚合(he)(he)物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)去除。該專(zhuan)利(li)還(huan)公開(kai)了連(lian)續發酵(jiao)方法，其(qi)中(zhong)將(jiang)裝備有雜質(zhi)過(guo)(guo)(guo)濾器(qi)(qi)的(de)(de)(de)過(guo)(guo)(guo)濾器(qi)(qi)單(dan)(dan)元的(de)(de)(de)組(zu)合(he)(he)與(yu)裝備有產品過(guo)(guo)(guo)濾器(qi)(qi)的(de)(de)(de)過(guo)(guo)(guo)濾器(qi)(qi)單(dan)(dan)元組(zu)合(he)(he)，它們將(jiang)使目(mu)(mu)(mu)標生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)聚合(he)(he)物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)通過(guo)(guo)(guo)以收獲目(mu)(mu)(mu)標生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)多(duo)肽(tai)。描述了孔(kong)徑高(gao)達(da)80,000Da的(de)(de)(de)雜質(zhi)過(guo)(guo)(guo)濾器(qi)(qi)，其(qi)中(zhong)優選范圍為2,000Da至15,000Da。作(zuo)為目(mu)(mu)(mu)標生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)聚合(he)(he)物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)，僅描述了具有給定分子(zi)(zi)量的(de)(de)(de)多(duo)肽(tai)。所公開(kai)的(de)(de)(de)最(zui)大目(mu)(mu)(mu)標生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)聚合(he)(he)物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)是具有分子(zi)(zi)量約280,000Da的(de)(de)(de)因子(zi)(zi)VIII。

附圖簡述

圖1顯示在分批方法(fa)過程中生(sheng)物反(fan)應(ying)器里vWF利托菌素輔因子活性與vWF抗原的(de)比率(vWF:RCoF/vWF:Ag)。

圖(tu)2顯示在實施例2的方法過程中滲余物(wu)(wu)(生(sheng)物(wu)(wu)反應(ying)器)中和滲透物(wu)(wu)中vWF利托菌素輔因子活性與vWF抗原的比率(vWF:RCoF/vWF:Ag)。

圖3顯示(shi)實施(shi)例2中第4天在(zai)滲余(yu)物(生(sheng)物反應器)中HMW vWF的(de)積累(lei)和(he)在(zai)滲透物中HMW vWF的(de)耗盡。條帶1-5、6-10和(he)≥11的(de)相對(dui)于(yu)標準人血漿的(de)累(lei)積像素強度如實施(shi)例2所述測定。

圖4顯(xian)示實施例3的方法過程中在(zai)滲余物(wu)(生物(wu)反應器)中和在(zai)滲透物(wu)中vWF利(li)托菌素輔因(yin)子活性對vWF抗原的比率(lv)(vWF:RCoF/vWF:Ag)。

圖(tu)5顯(xian)示實施(shi)例3中(zhong)第(di)9天在滲余物中(zhong)(生物反應器)中(zhong)HMW vWF的(de)累(lei)(lei)積(ji)(ji)和(he)在滲透物中(zhong)HMW vWF的(de)耗盡。條帶(dai)1-5、6-10和(he)≥11的(de)相對于標準人血漿的(de)累(lei)(lei)積(ji)(ji)像(xiang)素強度如實施(shi)例2所述(shu)測定。

圖6顯示實施例(li)4的(de)假設方法(fa)設置的(de)示意圖。

圖(tu)7顯示(shi)實施例5的(de)假設方法(fa)設置的(de)示(shi)意圖(tu)。

圖8顯示在(zai)實施例6的(de)第7天(tian)在(zai)滲余物(生物反(fan)應器)中(zhong)HMW vWF的(de)積(ji)累和在(zai)滲透物中(zhong)HMW vWF的(de)耗(hao)盡。條帶1-5、6-10和≥11的(de)相(xiang)對于(yu)標準人血漿(jiang)的(de)累積(ji)像素強度(du)如實施例2所述測定。

圖9顯示如實施例(li)2中所述的在(zai)(zai)實施例(li)6的方法過程中在(zai)(zai)滲余物(wu)(生物(wu)反應器)和在(zai)(zai)滲透(tou)物(wu)中vWF利(li)托菌素輔因子活性(xing)與(yu)vWF抗原的比率(vWF:RCoF/vWF:Ag)。

發明概述

本發明(ming)涉及(ji)令人驚訝(ya)的(de)(de)(de)(de)發現：分(fen)(fen)離(li)(li)系(xi)統(tong)可以(yi)在(zai)發酵方法過程中用于生物反應器(qi)中以(yi)將某些多聚體形式的(de)(de)(de)(de)vWF與其(qi)它多聚體形式的(de)(de)(de)(de)vWF分(fen)(fen)離(li)(li)。具有(you)不(bu)同分(fen)(fen)子(zi)量的(de)(de)(de)(de)此類不(bu)同多聚體形式的(de)(de)(de)(de)vWF確實具有(you)不(bu)同的(de)(de)(de)(de)性質和(he)/或不(bu)同的(de)(de)(de)(de)生物活性。在(zai)生產的(de)(de)(de)(de)上(shang)游發酵步驟步驟中已經發生的(de)(de)(de)(de)此種(zhong)分(fen)(fen)離(li)(li)大大降(jiang)低了下游加工中所需的(de)(de)(de)(de)純化(hua)努力。

因此，本發明的(de)實施方(fang)案(an)包括用于(yu)產生重組von Willebrand因子(vWF)的(de)方(fang)法。

本發明(ming)的(de)(de)一個實施方案是通過在(zai)生(sheng)物反應器中(zhong)(zhong)在(zai)細胞(bao)(bao)培養(yang)基(ji)中(zhong)(zhong)培養(yang)宿主細胞(bao)(bao)來制備重(zhong)組von Willebrand因子(zi)(vWF)的(de)(de)方法，其(qi)中(zhong)(zhong)宿主細胞(bao)(bao)產生(sheng)分泌到細胞(bao)(bao)培養(yang)基(ji)中(zhong)(zhong)的(de)(de)重(zhong)組vWF，并(bing)且其(qi)中(zhong)(zhong)在(zai)細胞(bao)(bao)培養(yang)基(ji)中(zhong)(zhong)的(de)(de)vWF包含不(bu)同大小的(de)(de)vWF多聚體，

其(qi)中(zhong)將至(zhi)少(shao)一種細(xi)胞(bao)(bao)培(pei)養(yang)基組分(fen)(fen)進料至(zhi)所(suo)(suo)(suo)述細(xi)胞(bao)(bao)培(pei)養(yang)基中(zhong)，并(bing)且其(qi)中(zhong)將包含細(xi)胞(bao)(bao)、重組vWF和細(xi)胞(bao)(bao)培(pei)養(yang)基的細(xi)胞(bao)(bao)培(pei)養(yang)物泵送通過分(fen)(fen)離(li)(li)系(xi)統，并(bing)且其(qi)中(zhong)所(suo)(suo)(suo)述分(fen)(fen)離(li)(li)系(xi)統將所(suo)(suo)(suo)述vWF多聚(ju)體分(fen)(fen)離(li)(li)成至(zhi)少(shao)：

滲透物級分(fen)，與分(fen)離前的(de)(de)細胞(bao)培(pei)養(yang)上清液(ye)中的(de)(de)vWF多聚體(ti)相比，所述滲透物級分(fen)富含vWF的(de)(de)低分(fen)子量(liang)(LMW)多聚體(ti)而(er)vWF的(de)(de)高(gao)分(fen)子量(liang)(HMW)多聚體(ti)減少，和

滲余(yu)物級分，與分離前(qian)的(de)細胞培養(yang)上清液(ye)中的(de)vWF多聚(ju)體相比(bi)，所述(shu)滲余(yu)物級分的(de)vWF的(de)低(di)分子(zi)(zi)量(LMW)多聚(ju)體減少而富含(han)vWF的(de)高分子(zi)(zi)量(HMW)多聚(ju)體。

在本(ben)發明的一個實施方案中(zhong)，vWF的兩個級分(fen)確實具有不同的生物活性。

在本發明(ming)的另一個實施方案中，意欲進一步純化的重(zhong)組vWF的所(suo)需級分(fen)是滲透物。

在(zai)另一個實施方案中，滲透物(wu)中的重組(zu)VWF富含低(di)分子(zi)量(LMW)vWF多聚(ju)體(ti)(ti)，而(er)(er)高分子(zi)量(HMW)vWF多聚(ju)體(ti)(ti)減少，其(qi)中LMW vWF多聚(ju)體(ti)(ti)對應于條帶1至5，而(er)(er)HMW vWF多聚(ju)體(ti)(ti)對應于條帶11和更高，所(suo)述(shu)條帶是根(gen)據Ott等人的密度計(ji)vWF分析(Am J Clin Pathol 2010；133：322-330)。

在(zai)(zai)本發明的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)另一個(ge)實施(shi)方(fang)案中(zhong)(zhong)，滲(shen)透(tou)物中(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)LMW vWF多聚(ju)體的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)比率等于(yu)(yu)或(huo)低于(yu)(yu)0.9，或(huo)換句話說，在(zai)(zai)滲(shen)余物中(zhong)(zhong)vWF多聚(ju)體條(tiao)帶(dai)1至5的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)“相(xiang)對于(yu)(yu)標(biao)(biao)(biao)準(zhun)(zhun)(zhun)人(ren)血漿(jiang)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)累(lei)積像素(su)強(qiang)(qiang)度(du)”除以在(zai)(zai)滲(shen)透(tou)物中(zhong)(zhong)vWF多聚(ju)體條(tiao)帶(dai)1至5的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)“相(xiang)對于(yu)(yu)標(biao)(biao)(biao)準(zhun)(zhun)(zhun)人(ren)血漿(jiang)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)累(lei)積像素(su)強(qiang)(qiang)度(du)”的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)比率低于(yu)(yu)0.9，其中(zhong)(zhong)vWF多聚(ju)體條(tiao)帶(dai)1至5的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)“相(xiang)對于(yu)(yu)標(biao)(biao)(biao)準(zhun)(zhun)(zhun)人(ren)血漿(jiang)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)累(lei)積像素(su)強(qiang)(qiang)度(du)”是指當根(gen)據Ott等人(ren)(Am J Clin Pathol 2010；133：322-330)在(zai)(zai)密度(du)計vWF分(fen)析中(zhong)(zhong)確(que)定的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)條(tiao)帶(dai)1至5的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)量除以根(gen)據Ott等人(ren)(Am J Clin Pathol 2010；133：322-330)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)密度(du)計vWF分(fen)析中(zhong)(zhong)所確(que)定的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)標(biao)(biao)(biao)準(zhun)(zhun)(zhun)人(ren)血漿(jiang)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)條(tiao)帶(dai)1至5的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)量時所獲得的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)數值(zhi)。優(you)選使(shi)用標(biao)(biao)(biao)準(zhun)(zhun)(zhun)人(ren)血漿(jiang)(SHP)(Siemens，標(biao)(biao)(biao)準(zhun)(zhun)(zhun)人(ren)血漿(jiang)，ORKL17)。

在本發明的另一個實施(shi)方(fang)案中，意欲(yu)被進(jin)一步純(chun)化(hua)的重組vWF的所需級分是滲余物。

在本發明的(de)(de)(de)(de)另一個實施方(fang)案中(zhong)(zhong)，滲余物中(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)HMW vWF多(duo)聚體的(de)(de)(de)(de)比率等(deng)于(yu)或(huo)(huo)大(da)于(yu)1.1，或(huo)(huo)換句話說，在滲余物中(zhong)(zhong)vWF多(duo)聚體條(tiao)帶(dai)(dai)11和(he)更高的(de)(de)(de)(de)“相(xiang)對于(yu)標(biao)(biao)(biao)準(zhun)(zhun)人(ren)(ren)血(xue)(xue)(xue)漿(jiang)(jiang)累(lei)(lei)(lei)積(ji)像素(su)強(qiang)(qiang)度(du)”除(chu)以滲透(tou)物中(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)vWF多(duo)聚體條(tiao)帶(dai)(dai)11和(he)更高的(de)(de)(de)(de)“相(xiang)對于(yu)標(biao)(biao)(biao)準(zhun)(zhun)人(ren)(ren)血(xue)(xue)(xue)漿(jiang)(jiang)的(de)(de)(de)(de)累(lei)(lei)(lei)積(ji)像素(su)強(qiang)(qiang)度(du)”的(de)(de)(de)(de)比率等(deng)于(yu)或(huo)(huo)大(da)于(yu)1.1，其中(zhong)(zhong)vWF多(duo)聚體條(tiao)帶(dai)(dai)11和(he)更高的(de)(de)(de)(de)“相(xiang)對于(yu)標(biao)(biao)(biao)準(zhun)(zhun)人(ren)(ren)血(xue)(xue)(xue)漿(jiang)(jiang)的(de)(de)(de)(de)累(lei)(lei)(lei)積(ji)像素(su)強(qiang)(qiang)度(du)”是(shi)指當(dang)根據Ott等(deng)人(ren)(ren)(Am J Clin Pathol 2010；133：322-330)在密度(du)計vWF分析中(zhong)(zhong)確定的(de)(de)(de)(de)條(tiao)帶(dai)(dai)11和(he)更高的(de)(de)(de)(de)量(liang)(liang)除(chu)以根據Ott等(deng)人(ren)(ren)(Am J Clin Pathol 2010；133：322-330)的(de)(de)(de)(de)密度(du)計vWF分析中(zhong)(zhong)所(suo)確定的(de)(de)(de)(de)標(biao)(biao)(biao)準(zhun)(zhun)人(ren)(ren)血(xue)(xue)(xue)漿(jiang)(jiang)的(de)(de)(de)(de)條(tiao)帶(dai)(dai)11和(he)更高的(de)(de)(de)(de)量(liang)(liang)時所(suo)獲得的(de)(de)(de)(de)數值。優選(xuan)使用標(biao)(biao)(biao)準(zhun)(zhun)人(ren)(ren)血(xue)(xue)(xue)漿(jiang)(jiang)(SHP)(Siemens，標(biao)(biao)(biao)準(zhun)(zhun)人(ren)(ren)血(xue)(xue)(xue)漿(jiang)(jiang)，ORKL17)。

在某些實施方案(an)中，分離系統的截(jie)留分子量大(da)小(xiao)為約(yue)0.05μm至1μm。

在本發明的(de)其(qi)它實施方案中，分離系(xi)統(tong)的(de)截(jie)留分子量大小為約(yue)550,000至1,000,000Da。

在本發明的(de)另(ling)一個實施方案中，分(fen)離系統的(de)截留分(fen)子(zi)量大小為(wei)約750,000Da。

在本(ben)發(fa)明(ming)的(de)(de)另一(yi)個實施方案中(zhong)(zhong)(zhong)，發(fa)生第(di)二(er)次分離(li)，其中(zhong)(zhong)(zhong)在任何上述(shu)方法中(zhong)(zhong)(zhong)獲得的(de)(de)滲(shen)(shen)余物進行第(di)二(er)次分離(li)，其中(zhong)(zhong)(zhong)超(chao)大vWF多(duo)聚體(ti)在所述(shu)滲(shen)(shen)余物中(zhong)(zhong)(zhong)富集，提供第(di)二(er)滲(shen)(shen)透物，所述(shu)第(di)二(er)滲(shen)(shen)透物中(zhong)(zhong)(zhong)總(zong)vWF多(duo)聚體(ti)量中(zhong)(zhong)(zhong)超(chao)大vWF多(duo)聚體(ti)的(de)(de)比例與在所述(shu)第(di)二(er)次分離(li)之前所述(shu)滲(shen)(shen)余物中(zhong)(zhong)(zhong)總(zong)vWF多(duo)聚體(ti)量中(zhong)(zhong)(zhong)超(chao)大vWF多(duo)聚體(ti)的(de)(de)比例相(xiang)比降低。

在一個(ge)實施方案中，第(di)二次(ci)(ci)分(fen)離(li)(li)與第(di)一次(ci)(ci)分(fen)離(li)(li)平行進(jin)行，而在另(ling)一個(ge)實施方案中，第(di)二次(ci)(ci)分(fen)離(li)(li)在第(di)一次(ci)(ci)分(fen)離(li)(li)之后進(jin)行。

發明詳述

定義

除(chu)非另有定義(yi)，否則(ze)本文使用的所有技術(shu)(shu)和科學(xue)術(shu)(shu)語具有與(yu)(yu)本發明所屬領(ling)域的普(pu)通技術(shu)(shu)人員通常理解的相(xiang)同的含義(yi)。但(dan)是描述了與(yu)(yu)優選的方法(fa)和材料相(xiang)似或等同的任(ren)何(he)方法(fa)和材料。為了本發明的目的，以(yi)下術(shu)(shu)語定義(yi)如下。

冠(guan)(guan)詞(ci)(ci)“a”和“an”在本(ben)文中用于(yu)指(zhi)(zhi)該冠(guan)(guan)詞(ci)(ci)的一(yi)(yi)個(ge)(ge)(ge)(ge)或多于(yu)一(yi)(yi)個(ge)(ge)(ge)(ge)(即至少一(yi)(yi)個(ge)(ge)(ge)(ge))語法(fa)對象。作為(wei)示例，“一(yi)(yi)個(ge)(ge)(ge)(ge)元件(jian)”是指(zhi)(zhi)一(yi)(yi)個(ge)(ge)(ge)(ge)元件(jian)或多于(yu)一(yi)(yi)個(ge)(ge)(ge)(ge)元件(jian)。

“約”是指(zhi)對于參考的數(shu)(shu)量(liang)、水平、值、數(shu)(shu)字、頻率、百分數(shu)(shu)、尺(chi)寸(cun)、大(da)(da)小、量(liang)、重量(liang)、長度(du)或本文(wen)所述的其它單位變化多達30％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的數(shu)(shu)量(liang)、水平、值、數(shu)(shu)量(liang)、頻率、百分數(shu)(shu)、尺(chi)寸(cun)、大(da)(da)小、量(liang)、重量(liang)或長度(du)。

在本發明整(zheng)個說明書中(zhong)，除非上下文另有要求，否則詞(ci)語“包(bao)括(comprise、comprises和comprsing)”將被理解為暗示包(bao)括所述步(bu)驟或元(yuan)(yuan)件或者步(bu)驟或元(yuan)(yuan)件的組，但不排除任何其它(ta)步(bu)驟或元(yuan)(yuan)件或者步(bu)驟或元(yuan)(yuan)件的組。

“由(you)...組(zu)(zu)成(cheng)”表(biao)示包括(kuo)并(bing)且限于(yu)短語(yu)(yu)(yu)“由(you)...組(zu)(zu)成(cheng)”之(zhi)后的(de)任(ren)何(he)內容。因此，短語(yu)(yu)(yu)“由(you)...組(zu)(zu)成(cheng)”表(biao)示所(suo)(suo)列(lie)(lie)元(yuan)(yuan)素是(shi)必需的(de)或(huo)(huo)強制性(xing)的(de)，并(bing)且不(bu)可以(yi)存(cun)在其它(ta)元(yuan)(yuan)素。“基(ji)本上由(you)...組(zu)(zu)成(cheng)”意指包括(kuo)在短語(yu)(yu)(yu)之(zhi)后列(lie)(lie)出的(de)任(ren)何(he)元(yuan)(yuan)件(jian)，并(bing)且限于(yu)不(bu)干擾或(huo)(huo)有助于(yu)本公開中針(zhen)對所(suo)(suo)列(lie)(lie)元(yuan)(yuan)件(jian)指定的(de)活動或(huo)(huo)動作的(de)其他元(yuan)(yuan)件(jian)。因此，短語(yu)(yu)(yu)“基(ji)本上由(you)...組(zu)(zu)成(cheng)”表(biao)示所(suo)(suo)列(lie)(lie)元(yuan)(yuan)素是(shi)必需的(de)或(huo)(huo)強制性(xing)的(de)，但是(shi)其它(ta)元(yuan)(yuan)素是(shi)任(ren)選的(de)，并(bing)且可以(yi)存(cun)在或(huo)(huo)不(bu)存(cun)在，這取決于(yu)它(ta)們是(shi)否(fou)實質(zhi)影響所(suo)(suo)列(lie)(lie)元(yuan)(yuan)件(jian)的(de)活性(xing)或(huo)(huo)作用(yong)。

“生物活性”是(shi)指(zhi)vWF的可測量的功(gong)能，該(gai)功(gong)能在(zai)(zai)vWF施(shi)用于(yu)人(ren)(ren)時也(ye)在(zai)(zai)體內發揮(hui)。如本文(wen)所用，術語“功(gong)能(function和functional等)”是(shi)指(zhi)vWF的生物學(xue)、酶學(xue)或治療功(gong)能。vWF的生物活性可以例如由本領域技術人(ren)(ren)員使(shi)用測定(ding)利托菌(jun)素輔因(yin)子活性(vWF:RCoF)的方法(fa)(Federici AB等人(ren)(ren)2004.Haematologica 89：77-85)，vWF與血小板(ban)糖蛋白復合(he)物Ib-V-IX的GP Ib的結(jie)合(he)(Sucker等人(ren)(ren)2006.Clin Appl Thromb Hemost.12：305-310)，膠原(yuan)結(jie)合(he)測定(ding)(Kallas&Talpsep.2001.Analals of Hematology 80：466-471)或FVIII結(jie)合(he)測定(ding)來測定(ding)。FVIII結(jie)合(he)可以例如通過(guo)Biacore分析來測定(ding)。

“生(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)反(fan)應(ying)器”是指提供和(he)支持用(yong)于細胞培養的生(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)活性環(huan)境(jing)的任(ren)何(he)生(sheng)(sheng)(sheng)產(chan)或(huo)工程化的裝(zhuang)置(zhi)或(huo)系統，其允(yun)許細胞生(sheng)(sheng)(sheng)長并產(chan)生(sheng)(sheng)(sheng)目標產(chan)物(wu)。生(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)反(fan)應(ying)器一般(ban)測(ce)量并調節(jie)生(sheng)(sheng)(sheng)成這(zhe)種生(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)活性環(huan)境(jing)所需(xu)的物(wu)理(li)和(he)化學參數。生(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)反(fan)應(ying)器可(ke)以以不同的模式操(cao)作，如(ru)分(fen)批、補料分(fen)批或(huo)連續(xu)(xu)。以連續(xu)(xu)模式操(cao)作的生(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)反(fan)應(ying)器另外裝(zhuang)備有(you)培養基入口和(he)用(yong)于將上(shang)清液與細胞分(fen)離的裝(zhuang)置(zhi)。通常生(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)反(fan)應(ying)器是圓柱形或(huo)立方體，大小范圍從毫升到(dao)立方米，并且(qie)通常由不銹鋼或(huo)塑料制成。

術語“宿(su)(su)主(zhu)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)”包(bao)括可以是(shi)(shi)或(huo)已經是(shi)(shi)引(yin)入的(de)(de)重(zhong)組(zu)載體(ti)(ti)、分(fen)離的(de)(de)多核(he)苷酸或(huo)多肽(tai)的(de)(de)受體(ti)(ti)的(de)(de)個體(ti)(ti)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)或(huo)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)培養物。宿(su)(su)主(zhu)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)包(bao)括單個宿(su)(su)主(zhu)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)的(de)(de)后(hou)代(dai)，并且由于天然(ran)、偶然(ran)或(huo)故(gu)意(yi)的(de)(de)突變和/或(huo)改變，后(hou)代(dai)可能不必與(yu)原始親本(ben)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)完全相同(在(zai)(zai)形態學或(huo)在(zai)(zai)總(zong)DNA互補中)。宿(su)(su)主(zhu)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)包(bao)括在(zai)(zai)體(ti)(ti)內或(huo)體(ti)(ti)外(wai)用重(zhong)組(zu)載體(ti)(ti)或(huo)多核(he)苷酸轉染或(huo)感(gan)染的(de)(de)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)。包(bao)含(han)重(zhong)組(zu)載體(ti)(ti)的(de)(de)宿(su)(su)主(zhu)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)是(shi)(shi)重(zhong)組(zu)宿(su)(su)主(zhu)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)。具體(ti)(ti)宿(su)(su)主(zhu)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)在(zai)(zai)下面定(ding)義。

根(gen)據本(ben)發明的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)“分(fen)(fen)(fen)(fen)離(li)(li)系(xi)(xi)統(tong)”是指可(ke)(ke)(ke)以(yi)(yi)用于(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)在發酵方法(fa)過(guo)程中(zhong)將宿(su)主(zhu)細(xi)胞保(bao)持在生物反應器(qi)內(nei)(nei)(nei)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)裝置，其中(zhong)借助于(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)分(fen)(fen)(fen)(fen)離(li)(li)系(xi)(xi)統(tong)將至少部(bu)(bu)(bu)分(fen)(fen)(fen)(fen)細(xi)胞培(pei)(pei)養(yang)物上(shang)清液與宿(su)主(zhu)細(xi)胞分(fen)(fen)(fen)(fen)離(li)(li)，所(suo)述分(fen)(fen)(fen)(fen)離(li)(li)系(xi)(xi)統(tong)包含具(ju)(ju)有(you)一定的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)截(jie)(jie)(jie)留(liu)(liu)(liu)分(fen)(fen)(fen)(fen)子(zi)(zi)量(liang)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)過(guo)濾(lv)器(qi)。高(gao)于(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)一定的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)分(fen)(fen)(fen)(fen)子(zi)(zi)量(liang)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)宿(su)主(zhu)細(xi)胞和vWF多聚體被具(ju)(ju)有(you)一定的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)截(jie)(jie)(jie)留(liu)(liu)(liu)分(fen)(fen)(fen)(fen)子(zi)(zi)量(liang)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)所(suo)述過(guo)濾(lv)器(qi)保(bao)留(liu)(liu)(liu)。小(xiao)(xiao)分(fen)(fen)(fen)(fen)子(zi)(zi)、營養(yang)物和代謝物以(yi)(yi)及低于(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)一定的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)截(jie)(jie)(jie)留(liu)(liu)(liu)分(fen)(fen)(fen)(fen)子(zi)(zi)量(liang)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)vWF多聚體可(ke)(ke)(ke)以(yi)(yi)通(tong)過(guo)具(ju)(ju)有(you)一定的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)截(jie)(jie)(jie)留(liu)(liu)(liu)分(fen)(fen)(fen)(fen)子(zi)(zi)量(liang)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)所(suo)述過(guo)濾(lv)器(qi)。可(ke)(ke)(ke)以(yi)(yi)使用多個細(xi)胞保(bao)持裝置實現培(pei)(pei)養(yang)容器(qi)內(nei)(nei)(nei)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)細(xi)胞保(bao)留(liu)(liu)(liu)。不同的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)分(fen)(fen)(fen)(fen)離(li)(li)原理可(ke)(ke)(ke)用于(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)該方法(fa)。這(zhe)些(xie)方法(fa)可(ke)(ke)(ke)以(yi)(yi)基于(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)重力(li)沉降(jiang)、聲學沉降(jiang)、離(li)(li)心(xin)沉降(jiang)或(huo)(huo)過(guo)濾(lv)。以(yi)(yi)下設備組(zu)均可(ke)(ke)(ke)用于(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)該方法(fa)：內(nei)(nei)(nei)部(bu)(bu)(bu)或(huo)(huo)外(wai)部(bu)(bu)(bu)過(guo)濾(lv)器(qi)如(ru)內(nei)(nei)(nei)部(bu)(bu)(bu)或(huo)(huo)外(wai)部(bu)(bu)(bu)旋(xuan)轉過(guo)濾(lv)器(qi)(例(li)如(ru)來自Sartorius的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)Spinfilter P)、外(wai)部(bu)(bu)(bu)錯(cuo)流過(guo)濾(lv)器(qi)、外(wai)部(bu)(bu)(bu)或(huo)(huo)內(nei)(nei)(nei)部(bu)(bu)(bu)中(zhong)空纖維筒(tong)式(shi)過(guo)濾(lv)器(qi)(例(li)如(ru)來自Refine的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)交變(bian)切向流(ATF))。具(ju)(ju)有(you)一定的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)截(jie)(jie)(jie)留(liu)(liu)(liu)分(fen)(fen)(fen)(fen)子(zi)(zi)量(liang)(MWCO)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)過(guo)濾(lv)器(qi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)孔徑優選在0.05μm和1.0μm之間。MWCO優選等(deng)于(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)或(huo)(huo)大(da)(da)于(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)500,000Da，或(huo)(huo)等(deng)于(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)或(huo)(huo)大(da)(da)于(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)550,000Da，或(huo)(huo)等(deng)于(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)或(huo)(huo)大(da)(da)于(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)600,000Da，或(huo)(huo)等(deng)于(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)或(huo)(huo)大(da)(da)于(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)650,000Da，或(huo)(huo)等(deng)于(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)或(huo)(huo)大(da)(da)于(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)700,000Da，或(huo)(huo)大(da)(da)約750,000Da，或(huo)(huo)等(deng)于(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)或(huo)(huo)小(xiao)(xiao)于(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)1,000,000Da，或(huo)(huo)等(deng)于(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)或(huo)(huo)小(xiao)(xiao)于(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)950,000Da，或(huo)(huo)等(deng)于(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)或(huo)(huo)小(xiao)(xiao)于(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)900,000Da，或(huo)(huo)等(deng)于(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)或(huo)(huo)小(xiao)(xiao)于(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)850,000Da，或(huo)(huo)等(deng)于(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)或(huo)(huo)小(xiao)(xiao)于(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)800,000Da。應當理解(jie)，上(shang)述較低截(jie)(jie)(jie)留(liu)(liu)(liu)分(fen)(fen)(fen)(fen)子(zi)(zi)量(liang)值可(ke)(ke)(ke)以(yi)(yi)與上(shang)述較高(gao)截(jie)(jie)(jie)留(liu)(liu)(liu)分(fen)(fen)(fen)(fen)子(zi)(zi)量(liang)值組(zu)合，以(yi)(yi)限定具(ju)(ju)有(you)一定的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)截(jie)(jie)(jie)留(liu)(liu)(liu)分(fen)(fen)(fen)(fen)子(zi)(zi)量(liang)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)優選部(bu)(bu)(bu)分(fen)(fen)(fen)(fen)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)范圍(wei)，例(li)如(ru)在等(deng)于(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)或(huo)(huo)大(da)(da)于(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)500,000Da至1,000,000Da之間或(huo)(huo)在550,000Da至1,000,000Da之間的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)范圍(wei)等(deng)等(deng)。

已經通(tong)過分離裝(zhuang)(zhuang)置的(de)(de)細胞培(pei)(pei)養(yang)物(wu)(wu)的(de)(de)部分稱為“滲透物(wu)(wu)(permeate)”，而由分離裝(zhuang)(zhuang)置保留的(de)(de)細胞培(pei)(pei)養(yang)物(wu)(wu)的(de)(de)部分稱為“滲余物(wu)(wu)(retentate)”。

在分離系統(tong)中(zhong)使用的(de)500,000的(de)MWCO是指小(xiao)于(yu)500,000Da的(de)蛋白質通過(guo)分離系統(tong)并(bing)富集于(yu)滲(shen)透物中(zhong)，而(er)大于(yu)500,000Da的(de)蛋白質被過(guo)濾器保留并(bing)因此富集于(yu)滲(shen)余物中(zhong)。

該分(fen)離系統可用于富集(ji)確(que)實具有(you)不同生(sheng)物活性的具有(you)不同分(fen)子大小的vWF多聚體(ti)的某些級分(fen)。

“實質上(shang)(substantially)”或(huo)“基本上(shang)(essentially)”是指幾乎完全(quan)或(huo)完全(quan)是某一給定量，例如(ru)，95％、96％、97％、98％、99％或(huo)更(geng)大。

本(ben)(ben)文(wen)(wen)所用(yong)(yong)的(de)(de)術語(yu)“von Willebrand因子”或“vWF”是指具(ju)有野(ye)生(sheng)型vWF的(de)(de)生(sheng)物(wu)學活性(xing)或vWF的(de)(de)至少(shao)部(bu)分(fen)生(sheng)物(wu)學活性(xing)的(de)(de)任何多(duo)肽(tai)。編碼(ma)野(ye)生(sheng)型vWF的(de)(de)基(ji)(ji)(ji)因被轉錄成(cheng)9kb的(de)(de)mRNA，其(qi)被翻(fan)譯(yi)成(cheng)具(ju)有估計分(fen)子量為310,000Da的(de)(de)2813個(ge)氨(an)(an)基(ji)(ji)(ji)酸(suan)(suan)(suan)的(de)(de)前(qian)多(duo)肽(tai)原(yuan)。前(qian)多(duo)肽(tai)原(yuan)由2813個(ge)氨(an)(an)基(ji)(ji)(ji)酸(suan)(suan)(suan)組成(cheng)，并(bing)含有22個(ge)氨(an)(an)基(ji)(ji)(ji)酸(suan)(suan)(suan)的(de)(de)信號肽(tai)、741個(ge)氨(an)(an)基(ji)(ji)(ji)酸(suan)(suan)(suan)的(de)(de)多(duo)肽(tai)原(yuan)和成(cheng)熟亞單位。從(cong)N末端切割741個(ge)氨(an)(an)基(ji)(ji)(ji)酸(suan)(suan)(suan)的(de)(de)多(duo)肽(tai)原(yuan)得到由2050個(ge)氨(an)(an)基(ji)(ji)(ji)酸(suan)(suan)(suan)組成(cheng)的(de)(de)成(cheng)熟vWF。野(ye)生(sheng)型前(qian)原(yuan)vWF的(de)(de)cDNA序(xu)列顯示在(zai)SEQ ID NO：1中(zhong)。野(ye)生(sheng)型前(qian)原(yuan)vWF的(de)(de)氨(an)(an)基(ji)(ji)(ji)酸(suan)(suan)(suan)序(xu)列顯示在(zai)SEQ ID NO：2中(zhong)。除非另有說(shuo)明，分(fen)子本(ben)(ben)文(wen)(wen)使用(yong)(yong)的(de)(de)術語(yu)“vWF”是指vWF的(de)(de)成(cheng)熟形式。

野生(sheng)型vWF的(de)多肽(tai)原包含以下列順序排列的(de)多個(ge)結構域(yu)：

D1-D2-D'-D3-A1-A2-A3-D4-B1-B2-B3-C1-C2-CK

D1和D2結(jie)構域代表肽原，其被切割以產生成熟vWF。羧基末端90個殘基包含與蛋(dan)白質的“胱氨酸結(jie)”超家(jia)族同(tong)源的“CK”結(jie)構域。這些(xie)家(jia)族成員具有通過二硫鍵二聚化的傾向。

優(you)選地，野(ye)生(sheng)型(xing)(xing)(xing)vWF包含如(ru)SEQ ID NO：2所示的野(ye)生(sheng)型(xing)(xing)(xing)vWF的氨基酸序列。還包括vWF的添加、插入(ru)、N末端(duan)(duan)、C末端(duan)(duan)或(huo)內部缺失，只要保留vWF的至(zhi)少部分生(sheng)物(wu)(wu)學活(huo)性即可。野(ye)生(sheng)型(xing)(xing)(xing)vWF的生(sheng)物(wu)(wu)活(huo)性可以由(you)本領(ling)域技術人員(yuan)使用以下方法(fa)(fa)來測定：針對利托菌素(su)輔因子(zi)活(huo)性的方法(fa)(fa)(Federici AB等人2004.Haematologica 89：77-85)、vWF與血小板糖蛋白復合(he)物(wu)(wu)Ib-V-IX的GP Ibα的結合(he)(Sucker等人2006.Clin Appl Thromb Hemost.12：305-310)、膠(jiao)原(yuan)蛋白結合(he)測定法(fa)(fa)(Kallas&Talpsep.2001.Anals of Hematology 80：466-471)或(huo)FVIII結合(he)測定法(fa)(fa)。

某(mou)些實(shi)施方案(an)可以包括(kuo)如例(li)(li)如WO 2010/048275中(zhong)所述的(de)重組生產(chan)野生型的(de)vWF或其變體，例(li)(li)如，其中(zhong)已經(jing)引(yin)入一個或多個氨基酸(suan)缺失、添加(jia)和/或取代以增加(jia)或降低所述蛋(dan)白質的(de)至少(shao)一種生物(wu)活性(xing)。

因此，某些實施方案可以使用這些vWF相(xiang)關序(xu)列中(zhong)的(de)任何一個或多個，包括(kuo)(kuo)其組合(he)及其變(bian)體(ti)。還(huan)包括(kuo)(kuo)來自其它(ta)生(sheng)物(wu)體(ti)(諸如本文所(suo)述(shu)和本領(ling)域已知的(de)其它(ta)哺乳動物(wu))的(de)vWF相(xiang)關序(xu)列。

在某些實施(shi)方案中，術語(yu)“vWF”包括vWF的“融(rong)(rong)合(he)(he)蛋(dan)白(bai)”，優選vWF蛋(dan)白(bai)和(he)“異源(yuan)”融(rong)(rong)合(he)(he)伴侶的“融(rong)(rong)合(he)(he)蛋(dan)白(bai)”。還(huan)包括融(rong)(rong)合(he)(he)蛋(dan)白(bai)或(huo)修飾的蛋(dan)白(bai)，其(qi)包含vWF蛋(dan)白(bai)的至(zhi)少一個最(zui)小片段或(huo)部分(fen)和(he)異源(yuan)融(rong)(rong)合(he)(he)伴侶或(huo)異源(yuan)序列(lie)。

如(ru)本文所用(yong)，“融合(he)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)”包括與另一(yi)種(例如(ru)，不(bu)同(tong)的(de)(de)(de))vWF蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(例如(ru)以產生多個片(pian)段(duan))、vWF蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)或(huo)兩(liang)者(zhe)連接(jie)的(de)(de)(de)vWF蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)或(huo)其片(pian)段(duan)。“非vWF蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)”是(shi)指具有對(dui)應于(yu)不(bu)同(tong)于(yu)vWF蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)的(de)(de)(de)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)質的(de)(de)(de)氨基酸(suan)序列(lie)的(de)(de)(de)“異(yi)源多肽”，并且(qie)所述蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)質可以衍生自相同(tong)或(huo)不(bu)同(tong)的(de)(de)(de)生物體(ti)。融合(he)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)的(de)(de)(de)vWF蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)可以對(dui)應于(yu)生物活(huo)性(xing)vWF蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)氨基酸(suan)序列(lie)的(de)(de)(de)全(quan)部或(huo)一(yi)部分。在某些實施(shi)方案中，vWF融合(he)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)包括vWF蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)的(de)(de)(de)至少(shao)一(yi)個(或(huo)兩(liang)個、三個等)生物活(huo)性(xing)部分。

更一般地，可以(yi)利用與異源序列(諸如白蛋(dan)白或免(mian)疫球(qiu)(qiu)蛋(dan)白或衍生(sheng)自無抗原(yuan)結合(he)結構(gou)域的(de)免(mian)疫球(qiu)(qiu)蛋(dan)白的(de)片(pian)段(duan)(如Fc片(pian)段(duan)))的(de)融(rong)合(he)來(lai)去除不想要的(de)特征或改善vWF的(de)所需的(de)特征(例如，藥代動力學(xue)性質)。例如，與異源序列的(de)融(rong)合(he)可以(yi)增加化學(xue)穩定性，降低免(mian)疫原(yuan)性，改善體內靶向，和(he)/或增加vWF蛋(dan)白的(de)循環半(ban)率期。

本(ben)文所(suo)用的(de)(de)(de)(de)“白(bai)(bai)(bai)(bai)(bai)蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)(bai)”包括白(bai)(bai)(bai)(bai)(bai)蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)(bai)蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)(bai)質家族的(de)(de)(de)(de)多肽(tai)，諸如(ru)(ru)人(ren)血清(qing)白(bai)(bai)(bai)(bai)(bai)蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)(bai)和(he)牛(niu)血清(qing)白(bai)(bai)(bai)(bai)(bai)蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)(bai)，包括其變(bian)體和(he)衍生(sheng)物(wu)，諸如(ru)(ru)基因工程(cheng)化或(huo)化學修飾的(de)(de)(de)(de)白(bai)(bai)(bai)(bai)(bai)蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)(bai)變(bian)體和(he)白(bai)(bai)(bai)(bai)(bai)蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)(bai)片(pian)段。融(rong)合蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)(bai)的(de)(de)(de)(de)白(bai)(bai)(bai)(bai)(bai)蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)(bai)部分可(ke)以衍生(sheng)自任何脊(ji)椎動物(wu)，特(te)別是任何哺乳動物(wu)，例如(ru)(ru)人(ren)、牛(niu)、羊或(huo)豬。非哺乳動物(wu)白(bai)(bai)(bai)(bai)(bai)蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)(bai)包括但不(bu)限于雞(ji)和(he)鮭魚。白(bai)(bai)(bai)(bai)(bai)蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)(bai)連接的(de)(de)(de)(de)多肽(tai)的(de)(de)(de)(de)白(bai)(bai)(bai)(bai)(bai)蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)(bai)部分可(ke)來自與融(rong)合蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)(bai)的(de)(de)(de)(de)vWF蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)(bai)部分不(bu)同(tong)的(de)(de)(de)(de)動物(wu)。

包(bao)括(kuo)(kuo)在(zai)本(ben)文使(shi)用(yong)的(de)(de)(de)(de)術語“白(bai)(bai)(bai)(bai)蛋(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)”內的(de)(de)(de)(de)白(bai)(bai)(bai)(bai)蛋(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)蛋(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)質(zhi)家(jia)族包(bao)括(kuo)(kuo)進化上相關的(de)(de)(de)(de)血清轉運蛋(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)，例如白(bai)(bai)(bai)(bai)蛋(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)、甲胎蛋(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)(AFP；Beattie&Dugaiczyk，Gene.20：415-422,1982)、afamin(AFM；Lichenstein等(deng)人(ren)(ren)，J.Biol.Chem.269：18149-18154,1994)和(he)維生素(su)D結(jie)合蛋(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)(DBP；Cooke&David，J.Clin.Invest.76：2420-2424,1985)。甲胎蛋(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)已被要求保護以增強(qiang)附(fu)接的(de)(de)(de)(de)治療性(xing)(xing)多肽的(de)(de)(de)(de)半率(lv)期(參見WO 2005/024044)。它們的(de)(de)(de)(de)基因代表多基因簇，其(qi)具有映射到人(ren)(ren)、小鼠(shu)和(he)大鼠(shu)中(zhong)相同染(ran)色體(ti)區域的(de)(de)(de)(de)結(jie)構和(he)功能相似性(xing)(xing)。因此(ci)，本(ben)發(fa)明的(de)(de)(de)(de)一些實施方案可以使(shi)用(yong)如本(ben)文定(ding)義的(de)(de)(de)(de)此(ci)類白(bai)(bai)(bai)(bai)蛋(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)家(jia)族成員或其(qi)片(pian)段和(he)變(bian)體(ti)作(zuo)為(wei)融合蛋(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)的(de)(de)(de)(de)一部分。本(ben)發(fa)明的(de)(de)(de)(de)治療性(xing)(xing)融合蛋(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)的(de)(de)(de)(de)白(bai)(bai)(bai)(bai)蛋(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)家(jia)族成員還可以包(bao)括(kuo)(kuo)AFP、AFM和(he)DBP的(de)(de)(de)(de)天(tian)然存在(zai)的(de)(de)(de)(de)多態(tai)性(xing)(xing)變(bian)體(ti)。

VWF蛋白(bai)(bai)或其(qi)片段(duan)(duan)或變體(ti)(ti)可以與(yu)人(ren)血清白(bai)(bai)蛋白(bai)(bai)多(duo)肽或其(qi)片段(duan)(duan)或變體(ti)(ti)融合(參見(jian)例如WO 2009/156137)。人(ren)血清白(bai)(bai)蛋白(bai)(bai)(HSA或HA)是(shi)成熟形(xing)式(shi)具有585個(ge)氨(an)基酸(suan)的(de)蛋白(bai)(bai)質，并且(qie)負(fu)責血清顯著比(bi)例的(de)滲透壓，并且(qie)還用作內源和外(wai)源配體(ti)(ti)的(de)載體(ti)(ti)。在(zai)其(qi)它益處中，與(yu)HSA或其(qi)片段(duan)(duan)或變體(ti)(ti)的(de)融合可以增(zeng)加本(ben)文(wen)所述的(de)vWF蛋白(bai)(bai)的(de)保存期(qi)限、血清半(ban)率期(qi)和/或治療活性。

優選地，融合(he)蛋白(bai)包(bao)含作為C末端(duan)部(bu)分的(de)(de)白(bai)蛋白(bai)，以(yi)及作為N末端(duan)部(bu)分的(de)(de)vWF蛋白(bai)。在其(qi)他實施(shi)方案(an)中，融合(he)蛋白(bai)具有與白(bai)蛋白(bai)的(de)(de)N末端(duan)和C末端(duan)兩(liang)者融合(he)的(de)(de)vWF蛋白(bai)。

肽接頭(tou)(tou)序(xu)(xu)列(lie)(lie)可用(yong)(yong)(yong)于將(jiang)融合(he)蛋白的(de)(de)組分分隔開。例(li)如，肽接頭(tou)(tou)可以通過這樣的(de)(de)距離(li)將(jiang)組分分隔開，所(suo)述距離(li)足以確保(bao)每個多(duo)肽折(zhe)疊成(cheng)其二級和(he)三級結構(gou)(gou)。可以使用(yong)(yong)(yong)本文描述的(de)(de)和(he)本領域公知的(de)(de)標準技術(shu)將(jiang)此(ci)類肽接頭(tou)(tou)序(xu)(xu)列(lie)(lie)并入(ru)融合(he)蛋白中。合(he)適的(de)(de)肽接頭(tou)(tou)序(xu)(xu)列(lie)(lie)可以基于以下因素進行選擇：(1)它(ta)們采取柔性延伸(shen)構(gou)(gou)象(xiang)的(de)(de)能(neng)力；(2)它(ta)們不能(neng)采用(yong)(yong)(yong)可與第一(yi)和(he)第二多(duo)肽上的(de)(de)功能(neng)表位(wei)(wei)相互(hu)作用(yong)(yong)(yong)的(de)(de)二級結構(gou)(gou)的(de)(de)能(neng)力；和(he)(3)缺少可能(neng)與多(duo)肽功能(neng)表位(wei)(wei)反應的(de)(de)疏水性或帶電(dian)荷殘基。可有效地用(yong)(yong)(yong)作接頭(tou)(tou)的(de)(de)氨基酸序(xu)(xu)列(lie)(lie)包括在Maratea等人(ren)，Gene 40：39-46,1985；Murphy等人(ren)，Natl.Acad.Sci.USA 83：8258-8262,1986；美(mei)國(guo)專利號4,935,233和(he)美(mei)國(guo)專利號4,751,180。

一個(ge)或多(duo)個(ge)非(fei)肽或肽接頭(tou)是任選的。例如(ru)，在(zai)(zai)第(di)一和(he)第(di)二多(duo)肽具有(you)可(ke)用(yong)于(yu)將功能結構域(yu)分(fen)隔開并防止空間干擾的非(fei)必需的N末端和(he)/或C末端氨基酸區域(yu)的情況下，在(zai)(zai)融合蛋(dan)白中可(ke)能不需要接頭(tou)序(xu)列。

如本文(wen)所(suo)述(shu)，本發明(ming)的某些實施(shi)方案還考(kao)慮使用(yong)(yong)經修(xiu)飾(shi)的vWF蛋(dan)白(bai)，包(bao)括(kuo)(kuo)(kuo)改(gai)進蛋(dan)白(bai)所(suo)需特征的修(xiu)飾(shi)。vWF蛋(dan)白(bai)的修(xiu)飾(shi)包(bao)括(kuo)(kuo)(kuo)在一個或多個組成(cheng)氨基酸處(chu)的化(hua)學(xue)和/或酶衍生化(hua)，包(bao)括(kuo)(kuo)(kuo)側鏈修(xiu)飾(shi)、主(zhu)鏈修(xiu)飾(shi)以(yi)及(ji)N末端(duan)修(xiu)飾(shi)和C末端(duan)修(xiu)飾(shi)，包(bao)括(kuo)(kuo)(kuo)乙酰(xian)(xian)化(hua)、羥化(hua)、甲基化(hua)、酰(xian)(xian)胺化(hua)和碳水化(hua)合(he)物(wu)或脂質部(bu)分、輔因子(zi)的附接(jie)等(deng)(deng)等(deng)(deng)。示例(li)性修(xiu)飾(shi)還包(bao)括(kuo)(kuo)(kuo)vWF蛋(dan)白(bai)的PEG化(hua)(參見(jian)，例(li)如，Veronese和Harris，Advanced Drug Delivery Reviews 54：453-456,2002，通過引用(yong)(yong)并(bing)入本文(wen))。與生物(wu)學(xue)上可接(jie)受(shou)的聚(ju)合(he)物(wu)化(hua)學(xue)綴合(he)的VWF變(bian)體描述(shu)于例(li)如WO 2006/071801中。

本(ben)發明也(ye)可以與vWF蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)的(de)“變體”一起使用(yong)。術語蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)質(zhi)(zhi)“變體”包括與SEQ ID NO:2的(de)差別在(zai)于(yu)至少一個氨(an)基酸殘基的(de)添(tian)加、缺失(shi)和/或(huo)(huo)取(qu)代并且通(tong)常保留(liu)參考蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)質(zhi)(zhi)的(de)一種或(huo)(huo)多種活性的(de)蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)質(zhi)(zhi)。鑒定適合取(qu)代的(de)氨(an)基酸并設計(ji)相對于(yu)參考序列(lie)具有基本(ben)上未(wei)改變、改善或(huo)(huo)降(jiang)低的(de)活性的(de)變體在(zai)本(ben)領域(yu)技術人員的(de)技能范圍內。

如(ru)本(ben)(ben)(ben)文(wen)所述和(he)本(ben)(ben)(ben)領域已知的(de)，蛋白(bai)質(zhi)變體可(ke)以通過一(yi)個或多個取(qu)代區(qu)別于(yu)參考序列，所述取(qu)代可(ke)以是保(bao)守(shou)的(de)或非保(bao)守(shou)的(de)。在某些(xie)實施方案中，蛋白(bai)質(zhi)變體包含保(bao)守(shou)取(qu)代，并且在這方面，本(ben)(ben)(ben)領域熟知的(de)是，一(yi)些(xie)氨基酸可(ke)以改(gai)變為具有(you)廣泛相似(si)性質(zhi)的(de)其他氨基酸而不改(gai)變蛋白(bai)質(zhi)活性的(de)性質(zhi)。

如(ru)(ru)本文所用(yong)的(de)(de)術(shu)語“序(xu)列同一(yi)性(xing)”或例如(ru)(ru)包含(han)“50％相(xiang)同的(de)(de)序(xu)列”是指(zhi)序(xu)列基(ji)于逐個(ge)(ge)核(he)苷酸(suan)(suan)或逐個(ge)(ge)氨(an)(an)基(ji)酸(suan)(suan)在(zai)比(bi)較(jiao)窗(chuang)口上相(xiang)同的(de)(de)程(cheng)度。因此，可以(yi)通過在(zai)比(bi)較(jiao)窗(chuang)口上比(bi)較(jiao)兩(liang)個(ge)(ge)最佳對齊的(de)(de)序(xu)列計算“序(xu)列同一(yi)性(xing)的(de)(de)百分比(bi)”，確定相(xiang)同核(he)酸(suan)(suan)堿基(ji)(例如(ru)(ru)A、T、C、G、I)或相(xiang)同氨(an)(an)基(ji)酸(suan)(suan)殘基(ji)(例如(ru)(ru)Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和(he)Met)在(zai)兩(liang)個(ge)(ge)序(xu)列中都(dou)存在(zai)的(de)(de)位置的(de)(de)數(shu)目以(yi)得(de)到匹配(pei)位置的(de)(de)數(shu)目，將匹配(pei)位置的(de)(de)數(shu)目除(chu)以(yi)比(bi)較(jiao)窗(chuang)口中的(de)(de)位置的(de)(de)總數(shu)(即窗(chuang)口大(da)小)，并將結(jie)果乘以(yi)100以(yi)得(de)到序(xu)列同一(yi)性(xing)的(de)(de)百分比(bi)。

用于描述兩(liang)(liang)個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)或(huo)更(geng)多(duo)個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)多(duo)肽(tai)之(zhi)(zhi)間(jian)的(de)(de)(de)(de)(de)序(xu)(xu)列(lie)(lie)(lie)(lie)關系(xi)的(de)(de)(de)(de)(de)術(shu)語包(bao)括“參(can)考(kao)序(xu)(xu)列(lie)(lie)(lie)(lie)”、“比(bi)(bi)(bi)較(jiao)(jiao)窗(chuang)(chuang)(chuang)(chuang)口(kou)”、“序(xu)(xu)列(lie)(lie)(lie)(lie)同(tong)一性(xing)”、“序(xu)(xu)列(lie)(lie)(lie)(lie)同(tong)一性(xing)百分(fen)比(bi)(bi)(bi)”和(he)(he)“實(shi)質同(tong)一性(xing)”。“參(can)考(kao)序(xu)(xu)列(lie)(lie)(lie)(lie)”是至(zhi)(zhi)少(shao)(shao)長(chang)12個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)但通(tong)(tong)常15至(zhi)(zhi)18個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)以(yi)及常常至(zhi)(zhi)少(shao)(shao)25個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)單體單位(wei)，包(bao)括核苷酸和(he)(he)氨基(ji)酸殘基(ji)。因為兩(liang)(liang)個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)多(duo)肽(tai)可以(yi)各(ge)自包(bao)含(1)兩(liang)(liang)個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)多(duo)肽(tai)之(zhi)(zhi)間(jian)相(xiang)似的(de)(de)(de)(de)(de)序(xu)(xu)列(lie)(lie)(lie)(lie)(即(ji)僅完整多(duo)肽(tai)序(xu)(xu)列(lie)(lie)(lie)(lie)的(de)(de)(de)(de)(de)一部分(fen))，和(he)(he)(2)兩(liang)(liang)個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)多(duo)肽(tai)之(zhi)(zhi)間(jian)不同(tong)的(de)(de)(de)(de)(de)序(xu)(xu)列(lie)(lie)(lie)(lie)，兩(liang)(liang)個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)(或(huo)更(geng)多(duo))多(duo)肽(tai)之(zhi)(zhi)間(jian)的(de)(de)(de)(de)(de)序(xu)(xu)列(lie)(lie)(lie)(lie)比(bi)(bi)(bi)較(jiao)(jiao)通(tong)(tong)常通(tong)(tong)過(guo)(guo)在(zai)(zai)“比(bi)(bi)(bi)較(jiao)(jiao)窗(chuang)(chuang)(chuang)(chuang)口(kou)”上比(bi)(bi)(bi)較(jiao)(jiao)兩(liang)(liang)個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)多(duo)肽(tai)的(de)(de)(de)(de)(de)序(xu)(xu)列(lie)(lie)(lie)(lie)進(jin)(jin)(jin)行，以(yi)鑒定和(he)(he)比(bi)(bi)(bi)較(jiao)(jiao)序(xu)(xu)列(lie)(lie)(lie)(lie)相(xiang)似性(xing)的(de)(de)(de)(de)(de)局部區(qu)域。“比(bi)(bi)(bi)較(jiao)(jiao)窗(chuang)(chuang)(chuang)(chuang)口(kou)”是指至(zhi)(zhi)少(shao)(shao)6個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)連(lian)(lian)續位(wei)置，通(tong)(tong)常約(yue)50至(zhi)(zhi)約(yue)100個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)，更(geng)通(tong)(tong)常約(yue)100至(zhi)(zhi)約(yue)150個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)概念區(qu)段(duan)，其中在(zai)(zai)兩(liang)(liang)個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)序(xu)(xu)列(lie)(lie)(lie)(lie)被優化對(dui)齊(qi)(qi)后(hou)將序(xu)(xu)列(lie)(lie)(lie)(lie)與在(zai)(zai)相(xiang)同(tong)數目的(de)(de)(de)(de)(de)連(lian)(lian)續位(wei)置的(de)(de)(de)(de)(de)參(can)考(kao)序(xu)(xu)列(lie)(lie)(lie)(lie)進(jin)(jin)(jin)行比(bi)(bi)(bi)較(jiao)(jiao)。針對(dui)兩(liang)(liang)個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)序(xu)(xu)列(lie)(lie)(lie)(lie)的(de)(de)(de)(de)(de)優化比(bi)(bi)(bi)對(dui)，與參(can)考(kao)序(xu)(xu)列(lie)(lie)(lie)(lie)(其不包(bao)含添(tian)加(jia)或(huo)缺失(shi))相(xiang)比(bi)(bi)(bi)，比(bi)(bi)(bi)較(jiao)(jiao)窗(chuang)(chuang)(chuang)(chuang)口(kou)可以(yi)包(bao)含為約(yue)20％或(huo)更(geng)少(shao)(shao)的(de)(de)(de)(de)(de)添(tian)加(jia)或(huo)缺失(shi)(即(ji)缺口(kou))。可以(yi)通(tong)(tong)過(guo)(guo)計(ji)算機化實(shi)施的(de)(de)(de)(de)(de)算法(Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0，Genetics Computer Group，575Science Drive Madison，WI，USA中的(de)(de)(de)(de)(de)GAP、BESTFIT、FASTA和(he)(he)TFASTA)或(huo)通(tong)(tong)過(guo)(guo)檢(jian)查和(he)(he)通(tong)(tong)過(guo)(guo)所選擇的(de)(de)(de)(de)(de)各(ge)種(zhong)方法中的(de)(de)(de)(de)(de)任一種(zhong)產生(sheng)的(de)(de)(de)(de)(de)最佳比(bi)(bi)(bi)對(dui)(即(ji)，導(dao)致在(zai)(zai)比(bi)(bi)(bi)較(jiao)(jiao)窗(chuang)(chuang)(chuang)(chuang)口(kou)上的(de)(de)(de)(de)(de)最高百分(fen)比(bi)(bi)(bi)同(tong)源(yuan)性(xing))進(jin)(jin)(jin)行用于對(dui)齊(qi)(qi)比(bi)(bi)(bi)較(jiao)(jiao)窗(chuang)(chuang)(chuang)(chuang)口(kou)的(de)(de)(de)(de)(de)序(xu)(xu)列(lie)(lie)(lie)(lie)的(de)(de)(de)(de)(de)優化對(dui)齊(qi)(qi)。

如(ru)上所(suo)述，與(yu)參考殘(can)(can)基(ji)(ji)相比，生物活(huo)性變(bian)體蛋白質可以在沿其(qi)序列的不同位置(zhi)含(han)有保(bao)守(shou)氨(an)(an)(an)基(ji)(ji)酸(suan)(suan)取代。“保(bao)守(shou)氨(an)(an)(an)基(ji)(ji)酸(suan)(suan)取代”包括(kuo)其(qi)中氨(an)(an)(an)基(ji)(ji)酸(suan)(suan)殘(can)(can)基(ji)(ji)被具(ju)(ju)有相似側(ce)(ce)鏈(lian)的氨(an)(an)(an)基(ji)(ji)酸(suan)(suan)殘(can)(can)基(ji)(ji)替換的氨(an)(an)(an)基(ji)(ji)酸(suan)(suan)取代。具(ju)(ju)有相似側(ce)(ce)鏈(lian)的氨(an)(an)(an)基(ji)(ji)酸(suan)(suan)殘(can)(can)基(ji)(ji)家族(zu)在本領域中已經定義(yi)，其(qi)通常可以亞分類如(ru)下：

酸性的(de)：由于在生(sheng)理pH下(xia)失去(qu)H離子，殘(can)基(ji)具有(you)負(fu)電荷，并且殘(can)基(ji)被水(shui)溶液吸引，使得(de)當肽在生(sheng)理pH的(de)水(shui)性介質中時，殘(can)基(ji)尋(xun)找包(bao)含(han)其的(de)肽的(de)構(gou)象中的(de)表面位置。具有(you)酸性側(ce)鏈的(de)氨(an)基(ji)酸包(bao)括(kuo)谷(gu)氨(an)酸和(he)天(tian)冬氨(an)酸。

堿性(xing)(xing)的(de)：由于(yu)在生理(li)pH或(huo)其(qi)一個或(huo)兩個pH單位內與H離(li)子締合，殘基具有正電荷(例(li)如(ru)，組氨(an)酸(suan))，并且殘基被水溶液吸(xi)引，使(shi)得當肽在生理(li)pH的(de)水性(xing)(xing)介質(zhi)中(zhong)時，殘基尋找(zhao)包含其(qi)的(de)肽的(de)構象(xiang)中(zhong)的(de)表面位置。具有堿性(xing)(xing)側鏈的(de)氨(an)基酸(suan)包括精氨(an)酸(suan)、賴氨(an)酸(suan)和組氨(an)酸(suan)。

帶電(dian)荷的：殘基(ji)在(zai)生理(li)pH下帶電(dian)荷，因此(ci)包括具有酸性或(huo)堿性側鏈的氨(an)基(ji)酸(即(ji)谷氨(an)酸、天冬氨(an)酸、精氨(an)酸、賴氨(an)酸和組氨(an)酸)。

疏(shu)(shu)水的：殘基(ji)(ji)在生理(li)pH下(xia)不(bu)帶電荷，并且殘基(ji)(ji)被水溶液排斥，使得當肽(tai)(tai)在水性介質中(zhong)時，殘基(ji)(ji)尋找(zhao)包含(han)其的肽(tai)(tai)的構象(xiang)中(zhong)的內部位置。具有疏(shu)(shu)水側(ce)鏈的氨(an)基(ji)(ji)酸包括酪氨(an)酸、纈(xie)氨(an)酸、異(yi)亮氨(an)酸、亮氨(an)酸、甲硫氨(an)酸、苯丙氨(an)酸和色氨(an)酸。

中(zhong)性(xing)/極(ji)性(xing)：殘(can)基在生理pH下不帶電荷，但是殘(can)基不被水溶液充分(fen)排斥，使得當肽在水性(xing)介質中(zhong)時，殘(can)基將尋找包(bao)含(han)其的肽的構象中(zhong)的內部位置。具有中(zhong)性(xing)/極(ji)性(xing)側(ce)鏈的氨基酸(suan)包(bao)括天(tian)冬酰(xian)(xian)胺，谷氨酰(xian)(xian)胺，半胱氨酸(suan)，組氨酸(suan)，絲氨酸(suan)和蘇氨酸(suan)。

該描述還將某些氨(an)(an)(an)基(ji)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)表征為(wei)“小(xiao)(xiao)的(de)(de)(de)”，因(yin)為(wei)它(ta)們的(de)(de)(de)側(ce)鏈不(bu)足夠大(即使缺少極(ji)性基(ji)團(tuan))以賦予疏水(shui)性。除了脯(fu)氨(an)(an)(an)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)，“小(xiao)(xiao)的(de)(de)(de)”氨(an)(an)(an)基(ji)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)是(shi)當側(ce)鏈上至少一(yi)個極(ji)性基(ji)團(tuan)存(cun)在時(shi)(shi)具有4個或更少的(de)(de)(de)碳(tan)的(de)(de)(de)氨(an)(an)(an)基(ji)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)，而(er)當不(bu)存(cun)在極(ji)性基(ji)團(tuan)時(shi)(shi)具有3個或更少的(de)(de)(de)碳(tan)的(de)(de)(de)氨(an)(an)(an)基(ji)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)。具有小(xiao)(xiao)的(de)(de)(de)側(ce)鏈的(de)(de)(de)氨(an)(an)(an)基(ji)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)包括甘氨(an)(an)(an)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)、絲氨(an)(an)(an)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)、丙氨(an)(an)(an)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)和(he)蘇氨(an)(an)(an)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)。基(ji)因(yin)編碼(ma)的(de)(de)(de)二級氨(an)(an)(an)基(ji)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)脯(fu)氨(an)(an)(an)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)是(shi)一(yi)種(zhong)特殊(shu)情況，因(yin)為(wei)其對肽鏈的(de)(de)(de)二級構象(xiang)具有已知的(de)(de)(de)作用。脯(fu)氨(an)(an)(an)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)的(de)(de)(de)結構不(bu)同于(yu)所有其它(ta)天然存(cun)在的(de)(de)(de)氨(an)(an)(an)基(ji)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)，其側(ce)鏈與(yu)α-氨(an)(an)(an)基(ji)的(de)(de)(de)氮以及(ji)α-碳(tan)鍵合(he)。出于(yu)本發明(ming)的(de)(de)(de)目的(de)(de)(de)，脯(fu)氨(an)(an)(an)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)被(bei)分類為(wei)“小(xiao)(xiao)的(de)(de)(de)”氨(an)(an)(an)基(ji)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)。

分類為極(ji)性或非極(ji)性所需的(de)(de)(de)(de)吸引或排斥程度是(shi)任意的(de)(de)(de)(de)，因此本(ben)發明特(te)(te)別考慮的(de)(de)(de)(de)氨基(ji)酸已被分類為一種(zhong)或另(ling)一種(zhong)。大多數未特(te)(te)別命(ming)名(ming)的(de)(de)(de)(de)氨基(ji)酸可以基(ji)于已知的(de)(de)(de)(de)行(xing)為進行(xing)分類。

氨(an)(an)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)酸殘(can)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)可(ke)(ke)以進一(yi)步亞類(lei)分(fen)(fen)類(lei)為環狀的(de)(de)(de)(de)(de)(de)或(huo)(huo)非環狀的(de)(de)(de)(de)(de)(de)，以及芳族(zu)(zu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)或(huo)(huo)非芳族(zu)(zu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)、就殘(can)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)側(ce)鏈取(qu)代基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)自我解釋分(fen)(fen)類(lei)，以及分(fen)(fen)類(lei)為小(xiao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)或(huo)(huo)大(da)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)。如(ru)果殘(can)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)含有(you)總(zong)共四個或(huo)(huo)更少(shao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)碳原子(zi)(包(bao)括(kuo)羧(suo)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)碳)，則認(ren)為殘(can)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)是(shi)小(xiao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)，條(tiao)件是(shi)存在額外的(de)(de)(de)(de)(de)(de)極性(xing)取(qu)代基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)；如(ru)果不存在額外的(de)(de)(de)(de)(de)(de)極性(xing)取(qu)代基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)則含有(you)三個或(huo)(huo)更少(shao)。小(xiao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)殘(can)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)當(dang)然(ran)總(zong)是(shi)非芳族(zu)(zu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)。取(qu)決(jue)于它們的(de)(de)(de)(de)(de)(de)結構特性(xing)，氨(an)(an)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)酸殘(can)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)可(ke)(ke)以分(fen)(fen)為兩類(lei)或(huo)(huo)更多類(lei)。對于天然(ran)存在的(de)(de)(de)(de)(de)(de)蛋白質氨(an)(an)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)酸，根(gen)據該方案的(de)(de)(de)(de)(de)(de)亞分(fen)(fen)類(lei)示于下表1中。

表1：氨基酸亞分類

保(bao)守氨(an)(an)基(ji)(ji)(ji)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)取代還包括基(ji)(ji)(ji)于側(ce)(ce)鏈的(de)(de)分組(zu)。例如，具(ju)(ju)有(you)脂肪(fang)族側(ce)(ce)鏈的(de)(de)一組(zu)氨(an)(an)基(ji)(ji)(ji)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)是甘氨(an)(an)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)、丙(bing)(bing)氨(an)(an)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)、纈氨(an)(an)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)、亮(liang)(liang)氨(an)(an)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)和(he)異(yi)亮(liang)(liang)氨(an)(an)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)；具(ju)(ju)有(you)脂肪(fang)族-羥基(ji)(ji)(ji)側(ce)(ce)鏈的(de)(de)一組(zu)氨(an)(an)基(ji)(ji)(ji)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)是絲氨(an)(an)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)和(he)蘇(su)氨(an)(an)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)；具(ju)(ju)有(you)含(han)酰胺側(ce)(ce)鏈的(de)(de)一組(zu)氨(an)(an)基(ji)(ji)(ji)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)是天(tian)冬酰胺和(he)谷氨(an)(an)酰胺；具(ju)(ju)有(you)芳香族側(ce)(ce)鏈的(de)(de)一組(zu)氨(an)(an)基(ji)(ji)(ji)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)是苯丙(bing)(bing)氨(an)(an)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)、酪氨(an)(an)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)和(he)色(se)氨(an)(an)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)；具(ju)(ju)有(you)堿性(xing)側(ce)(ce)鏈的(de)(de)一組(zu)氨(an)(an)基(ji)(ji)(ji)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)是賴氨(an)(an)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)、精氨(an)(an)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)和(he)組(zu)氨(an)(an)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)；具(ju)(ju)有(you)含(han)硫(liu)側(ce)(ce)鏈的(de)(de)一組(zu)氨(an)(an)基(ji)(ji)(ji)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)是半(ban)胱氨(an)(an)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)和(he)甲硫(liu)氨(an)(an)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)。例如，合理地(di)預期用(yong)異(yi)亮(liang)(liang)氨(an)(an)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)或纈氨(an)(an)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)替(ti)(ti)換(huan)(huan)(huan)亮(liang)(liang)氨(an)(an)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)，用(yong)谷氨(an)(an)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)替(ti)(ti)換(huan)(huan)(huan)天(tian)冬氨(an)(an)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)，用(yong)絲氨(an)(an)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)替(ti)(ti)換(huan)(huan)(huan)蘇(su)氨(an)(an)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)，或用(yong)結構相關的(de)(de)氨(an)(an)基(ji)(ji)(ji)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)替(ti)(ti)換(huan)(huan)(huan)氨(an)(an)基(ji)(ji)(ji)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)的(de)(de)類似(si)替(ti)(ti)換(huan)(huan)(huan)將不會對(dui)所得變體多肽的(de)(de)性(xing)質具(ju)(ju)有(you)主要(yao)的(de)(de)影響(xiang)。如本文所述，氨(an)(an)基(ji)(ji)(ji)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)變化(hua)是否(fou)得到生(sheng)物活性(xing)蛋白質可以容易地(di)通過測定其生(sheng)色(se)和(he)/或凝血活性(xing)來測定。

術語“低分子量vWF多聚體”或“LMW vWF多聚體”或“LMW vWF”被同(tong)義地使用，并且(qie)意味著在根(gen)據Ott等人(Am J Clin Pathol 2010；133：322-330)的(de)密度計(ji)vWF分析(xi)中對應于條帶1至5。

術語“高分子量vWF多(duo)(duo)聚(ju)體”或(huo)(huo)“HMW vWF多(duo)(duo)聚(ju)體”或(huo)(huo)“HMW vWF”被同義地使(shi)用(yong)，并且(qie)意味著在根據Ott等人(Am J Clin Pathol 2010；133：322-330)的(de)密(mi)度計vWF分析中對應于條帶11或(huo)(huo)更(geng)高，其中“更(geng)高”是指(zhi)條帶11和所有(you)更(geng)大的(de)vWF多(duo)(duo)聚(ju)體。

“超(chao)大(da)分子量vWF多(duo)聚(ju)(ju)體(ti)”或“ULMW vWF多(duo)聚(ju)(ju)體(ti)”被同(tong)義地使用，并(bing)且意味著(zhu)在(zai)根(gen)據Ott等人(ren)(Am J Clin Pathol 2010；133：322-330)的密度(du)計vWF分析中對應于條帶20和更(geng)高，其中“更(geng)高”是指條帶20和所有更(geng)大(da)的vWF多(duo)聚(ju)(ju)體(ti)。

術語“HMW多(duo)聚體(ti)比率”是指滲余物(wu)中(zhong)vWF多(duo)聚體(ti)條(tiao)帶11和更高(gao)的“相對于(yu)標準(zhun)人血漿的累(lei)積像(xiang)素強度”除以滲透(tou)物(wu)中(zhong)vWF多(duo)聚體(ti)條(tiao)帶11和更高(gao)的“相對于(yu)標準(zhun)人血漿的累(lei)積像(xiang)素強度”的比率。

術語(yu)vWF多(duo)聚體帶(dai)11和(he)(he)更高的(de)(de)“相對于標(biao)準(zhun)(zhun)人(ren)血(xue)(xue)漿的(de)(de)累積像(xiang)素強度”是指當(dang)根(gen)據Ott等人(ren)(Am J Clin Pathol 2010；133：322-330)的(de)(de)密(mi)度計(ji)vWF分(fen)析中測定(ding)的(de)(de)條帶(dai)11和(he)(he)更高的(de)(de)量除以根(gen)據Ott等人(ren)(Am J Clin Pathol 2010；133：322-330)的(de)(de)密(mi)度計(ji)vWF分(fen)析中測定(ding)的(de)(de)標(biao)準(zhun)(zhun)人(ren)血(xue)(xue)漿的(de)(de)條帶(dai)11和(he)(he)更高的(de)(de)量時獲(huo)得的(de)(de)數值。優(you)選使(shi)用標(biao)準(zhun)(zhun)人(ren)血(xue)(xue)漿(SHP)(Siemens，標(biao)準(zhun)(zhun)人(ren)血(xue)(xue)漿，ORKL17)。

術(shu)語(yu)“LMW多聚體(ti)比率”是指滲(shen)余物(wu)中vWF多聚體(ti)條帶1至5的“相對(dui)于標準人血漿(jiang)的累積像(xiang)素強(qiang)度”除以(yi)滲(shen)透物(wu)中vWF多聚體(ti)條帶1至5的“相對(dui)于標準人血漿(jiang)的累積像(xiang)素強(qiang)度”的比率。

術語(yu)vWF多(duo)聚體(ti)條帶(dai)1至(zhi)5的(de)(de)(de)(de)“相對(dui)于標準人(ren)(ren)(ren)(ren)血漿(jiang)的(de)(de)(de)(de)累(lei)積像素強度”是指當根(gen)據(ju)Ott等人(ren)(ren)(ren)(ren)(Am J Clin Pathol 2010；133：322-330)的(de)(de)(de)(de)密(mi)度計vWF分(fen)析中(zhong)測(ce)定的(de)(de)(de)(de)條帶(dai)1至(zhi)5的(de)(de)(de)(de)量除以根(gen)據(ju)Ott等人(ren)(ren)(ren)(ren)(Am J Clin Pathol 2010；133：322-330)的(de)(de)(de)(de)密(mi)度計vWF分(fen)析中(zhong)測(ce)定的(de)(de)(de)(de)標準人(ren)(ren)(ren)(ren)血漿(jiang)的(de)(de)(de)(de)條帶(dai)1至(zhi)5的(de)(de)(de)(de)量時(shi)獲得的(de)(de)(de)(de)數值(zhi)。優選(xuan)使(shi)用標準人(ren)(ren)(ren)(ren)血漿(jiang)(SHP)(Siemens，標準人(ren)(ren)(ren)(ren)血漿(jiang)，ORKL17)。

滲透物中(zhong)LMW vWF多(duo)聚(ju)體比(bi)(bi)率在(zai)(zai)分離前的(de)(de)細(xi)胞培(pei)養基的(de)(de)LMW vWF多(duo)聚(ju)體比(bi)(bi)率“之下”通(tong)常是“統計學上顯著”降(jiang)低的(de)(de)比(bi)(bi)率，并且可以包括(kuo)在(zai)(zai)分離前細(xi)胞培(pei)養基的(de)(de)LMW vWF多(duo)聚(ju)體比(bi)(bi)率之下減少(shao)了1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.2、3.4、3.6、3.8、4.0、4.2、4.3、4.4、4.6、4.8、5、6、7、8、9、10或更多(duo)倍(包括(kuo)所有整數(shu)和小(xiao)數(shu)點以及(ji)介于(yu)其間(jian)的(de)(de)范圍以及(ji)大于(yu)1，例如5.5、5.6、5.7、5.8等)。

滲(shen)透物中HMW vWF多(duo)(duo)聚(ju)(ju)體(ti)比(bi)率(lv)在分(fen)離(li)前(qian)的(de)(de)細(xi)胞(bao)培(pei)(pei)養基的(de)(de)HMW vWF多(duo)(duo)聚(ju)(ju)體(ti)比(bi)率(lv)“之上(shang)”通常是(shi)“統(tong)計學(xue)上(shang)顯著”增(zeng)加的(de)(de)比(bi)率(lv)，并且可以包括(kuo)在分(fen)離(li)前(qian)細(xi)胞(bao)培(pei)(pei)養基的(de)(de)HMW vWF多(duo)(duo)聚(ju)(ju)體(ti)比(bi)率(lv)之上(shang)增(zeng)加了1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.2、3.4、3.6、3.8、4.0、4.2、4.3、4.4、4.6、4.8、5、6、7、8、9、10或(huo)更多(duo)(duo)倍(包括(kuo)所有整(zheng)數和小數點以及介于其(qi)間的(de)(de)范(fan)圍以及大于1，例如5.5、5.6、5.7、5.8等(deng))。

本發明的蛋白質的表(biao)達(da)和(he)純化

本(ben)發明的實施方案包(bao)括用(yong)于表達、收集和(he)(he)任選純化本(ben)文所述的vWF級分的方法和(he)(he)相關組合物。

例如，某(mou)些實施方案包括用于產生(sheng)vWF或其(qi)變體的(de)方法，包括在細(xi)(xi)胞(bao)培(pei)養(yang)(yang)(yang)基中培(pei)養(yang)(yang)(yang)細(xi)(xi)胞(bao)，任選哺乳(ru)動物細(xi)(xi)胞(bao)，其(qi)中所述細(xi)(xi)胞(bao)包含至少(shao)一個導入的(de)編碼vWF的(de)多(duo)(duo)核苷(gan)酸(suan)，其(qi)中所述多(duo)(duo)核苷(gan)酸(suan)可操作地連接到至少(shao)一種調節元件并表達蛋白質；和從細(xi)(xi)胞(bao)或細(xi)(xi)胞(bao)培(pei)養(yang)(yang)(yang)基收集(ji)蛋白質。

重組vWF或其(qi)變體(ti)可以(yi)使用(yong)標準操作方案方便地制備。作為(wei)一(yi)(yi)個(ge)一(yi)(yi)般實例，可以(yi)通過包括一(yi)(yi)個(ge)或多(duo)個(ge)下列步驟的程序(xu)制備重組vWF：(a)制備包含編(bian)碼蛋白(bai)質(zhi)并且可操作地連接(jie)至(zhi)少(shao)一(yi)(yi)種(zhong)調節元件的多(duo)核苷酸序(xu)列的構(gou)建體(ti)；(b)將所(suo)述構(gou)建體(ti)引入宿(su)主細胞(bao)；(c)培養宿(su)主細胞(bao)以(yi)表達多(duo)肽，和(d)從宿(su)主細胞(bao)收集或分(fen)離多(duo)肽。

為了表達(da)vWF，可(ke)以(yi)將(jiang)編碼(ma)多(duo)肽的核苷酸序(xu)列(lie)(lie)或功能等同物插入合適(shi)的表達(da)載(zai)體，即(ji)含有(you)用于插入編碼(ma)序(xu)列(lie)(lie)的轉錄和翻譯(yi)的必需元件(jian)的載(zai)體。本(ben)領(ling)域技(ji)術(shu)人員公(gong)知的方法(fa)可(ke)用于構建含有(you)編碼(ma)vWF和合適(shi)的轉錄和翻譯(yi)控制元件(jian)的序(xu)列(lie)(lie)的表達(da)載(zai)體。這(zhe)些方法(fa)包括體外重組DNA技(ji)術(shu)、合成技(ji)術(shu)和體內遺傳(chuan)重組，并且是本(ben)領(ling)域已知的。

存在于表達載(zai)體(ti)中的(de)(de)“調(diao)節(jie)元件”或“調(diao)節(jie)序(xu)列”包括載(zai)體(ti)的(de)(de)那(nei)些非翻譯區，例(li)如增(zeng)強子(zi)(zi)、啟動子(zi)(zi)、5'和(he)3'非翻譯區、核糖體(ti)結合(he)位(wei)點(dian)、RNA剪接位(wei)點(dian)(如果存在含有內含子(zi)(zi)的(de)(de)基因組DNA)、聚腺苷酸化位(wei)點(dian)、轉(zhuan)錄終止序(xu)列，其與宿主(zhu)細胞蛋白質相(xiang)互作(zuo)用以進行轉(zhuan)錄和(he)翻譯。此類(lei)元件的(de)(de)強度(du)和(he)特異性(xing)可以不同。

根(gen)據所使(shi)用(yong)的(de)(de)載體系統和宿主，可(ke)以使(shi)用(yong)任何數量的(de)(de)合(he)適(shi)的(de)(de)轉(zhuan)錄(lu)和翻譯(yi)元件，包括組成型和誘(you)導型啟動子。例如，在哺乳動物(wu)細胞(bao)系統中，來自哺乳動物(wu)基因或來自哺乳動物(wu)病毒(du)的(de)(de)啟動子通常(chang)是優選的(de)(de)。

也可以(yi)使(shi)用特(te)異性(xing)起始(shi)信號來(lai)實現編(bian)碼目標多肽的(de)序列的(de)更(geng)有效的(de)翻譯。這(zhe)樣的(de)信號包括ATG起始(shi)密碼子和相鄰序列。

在(zai)將編(bian)碼(ma)(ma)vWF、其(qi)起(qi)(qi)始(shi)密碼(ma)(ma)子(zi)(zi)(zi)和上游序列的(de)(de)(de)(de)序列插(cha)入到合(he)適的(de)(de)(de)(de)表達載體中(zhong)的(de)(de)(de)(de)情(qing)況下，可能不需要額(e)外的(de)(de)(de)(de)轉錄或翻(fan)譯控制(zhi)信(xin)號。然(ran)而，在(zai)僅插(cha)入編(bian)碼(ma)(ma)序列或其(qi)一(yi)部分的(de)(de)(de)(de)情(qing)況下，應提供(gong)包(bao)括ATG起(qi)(qi)始(shi)密碼(ma)(ma)子(zi)(zi)(zi)的(de)(de)(de)(de)外源(yuan)翻(fan)譯控制(zhi)信(xin)號。此(ci)外，起(qi)(qi)始(shi)密碼(ma)(ma)子(zi)(zi)(zi)應當在(zai)正確(que)(que)的(de)(de)(de)(de)閱(yue)讀框中(zhong)以(yi)確(que)(que)保整個插(cha)入物(wu)的(de)(de)(de)(de)翻(fan)譯。外源(yuan)翻(fan)譯元件和起(qi)(qi)始(shi)密碼(ma)(ma)子(zi)(zi)(zi)可以(yi)是多種來源(yuan)的(de)(de)(de)(de)，天然(ran)的(de)(de)(de)(de)和合(he)成的(de)(de)(de)(de)。表達的(de)(de)(de)(de)效率(lv)可以(yi)通(tong)過包(bao)含(han)適合(he)于所(suo)(suo)使用的(de)(de)(de)(de)特(te)定細胞(bao)系(xi)統的(de)(de)(de)(de)增(zeng)強(qiang)子(zi)(zi)(zi)來增(zeng)強(qiang)，諸如在(zai)文獻中(zhong)所(suo)(suo)描(miao)述的(de)(de)(de)(de)那些。

在(zai)哺乳(ru)動物(wu)(wu)宿(su)主細(xi)胞(bao)(bao)中(zhong)，通(tong)常可(ke)獲得許(xu)多基于(yu)病(bing)(bing)毒(du)(du)的(de)(de)(de)(de)表(biao)達(da)系(xi)統(tong)。例(li)如(ru)，在(zai)使用(yong)腺病(bing)(bing)毒(du)(du)作為表(biao)達(da)載(zai)體的(de)(de)(de)(de)情況下，編碼目標多肽的(de)(de)(de)(de)序(xu)(xu)列可(ke)以連(lian)接到由晚期啟動子(zi)和三聯前導序(xu)(xu)列組(zu)成的(de)(de)(de)(de)腺病(bing)(bing)毒(du)(du)轉錄/翻譯(yi)復合(he)物(wu)(wu)中(zhong)。插入病(bing)(bing)毒(du)(du)基因組(zu)的(de)(de)(de)(de)非(fei)必需E1或E3區域(yu)可(ke)用(yong)于(yu)獲得能在(zai)感染的(de)(de)(de)(de)宿(su)主細(xi)胞(bao)(bao)中(zhong)表(biao)達(da)多肽的(de)(de)(de)(de)活病(bing)(bing)毒(du)(du)。此外，轉錄增強子(zi)(諸如(ru)勞氏肉瘤病(bing)(bing)毒(du)(du)(RSV)增強子(zi)或CMV啟動子(zi)/增強子(zi))可(ke)用(yong)于(yu)增加哺乳(ru)動物(wu)(wu)宿(su)主細(xi)胞(bao)(bao)中(zhong)的(de)(de)(de)(de)表(biao)達(da)。

合(he)適的(de)(de)宿主(zhu)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)是高等真核細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)，諸如(ru)哺乳(ru)(ru)動(dong)(dong)物細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)。有(you)用的(de)(de)哺乳(ru)(ru)動(dong)(dong)物宿主(zhu)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)系(xi)(xi)(xi)的(de)(de)實例(li)包括由SV40轉化的(de)(de)猴(hou)腎CV1系(xi)(xi)(xi)(COS-7，ATCC CRL 1651)；人(ren)(ren)胚腎細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)系(xi)(xi)(xi)(例(li)如(ru)，HEK293細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)，亞克(ke)隆用于在(zai)懸浮培養中生長的(de)(de)293細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)；幼倉鼠(shu)(shu)腎細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(BHK，ATCC CCL 10))；小鼠(shu)(shu)sertoli細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)；猴(hou)腎細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(CV1，ATCC CCL 70)；非洲(zhou)綠猴(hou)腎細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(VERO細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)，VERO-76，ATCC CRL-1587)；COS細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)，人(ren)(ren)宮頸癌(ai)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(Hela細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)，ATCC CCL 2)；犬腎細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(MDCK，ATCC CCL 34)；大(da)鼠(shu)(shu)肝細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人(ren)(ren)肺細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(W138，ATCC CCL 75)；人(ren)(ren)肝細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(HepG2，HB8065)；小鼠(shu)(shu)乳(ru)(ru)腺腫瘤細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(MMT 060562，ATCC CCL51)；TR1細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)；MRC 5細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)；FS4細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)和人(ren)(ren)肝癌(ai)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)系(xi)(xi)(xi)(Hep G2)。其它有(you)用的(de)(de)哺乳(ru)(ru)動(dong)(dong)物宿主(zhu)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)系(xi)(xi)(xi)包括中國倉鼠(shu)(shu)卵巢細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(CHO細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)，包括DHFR-CHO細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao))和骨髓瘤細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)系(xi)(xi)(xi)如(ru)NSO和Sp2/0。

其(qi)它合適的細(xi)(xi)(xi)胞(bao)系包(bao)括但不限于大(da)鼠(shu)Hep I(大(da)鼠(shu)肝癌(ai)；ATCC CRL 1600)，大(da)鼠(shu)Hep II(大(da)鼠(shu)肝癌(ai)；ATCC CRL 1548)，TCMK(ATCC CCL 139)，人肺(ATCC HB 8065)，NCTC 1469(ATCC CCL 9.1)；DUKX細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(CHO細(xi)(xi)(xi)胞(bao)系)和DG44(CHO細(xi)(xi)(xi)胞(bao)系)。也有用(yong)的是3T3細(xi)(xi)(xi)胞(bao)、Namalwa細(xi)(xi)(xi)胞(bao)、骨髓瘤和骨髓瘤與其(qi)他(ta)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)的融合物。

某些優選(xuan)的哺乳動物細(xi)(xi)胞表(biao)達系統(tong)(tong)包(bao)括基于CHO和HEK293細(xi)(xi)胞的表(biao)達系統(tong)(tong)。CHO細(xi)(xi)胞的具(ju)體實例包(bao)括CHO-K1和CHO-S細(xi)(xi)胞。還包(bao)括可在無血清培養(yang)基上(shang)生長的宿主(zhu)細(xi)(xi)胞，諸如某些HEK293細(xi)(xi)胞和CHO細(xi)(xi)胞。

在一些實施方案中，宿主(zhu)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)能夠(gou)在懸(xuan)(xuan)(xuan)浮(fu)培(pei)養中生(sheng)長。如本文(wen)所用，懸(xuan)(xuan)(xuan)浮(fu)-感(gan)受態(tai)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)是(shi)可以在懸(xuan)(xuan)(xuan)浮(fu)液中生(sheng)長而不產生(sheng)大的(de)(de)、堅固的(de)(de)聚(ju)集(ji)體(ti)的(de)(de)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)，即(ji)單分散(san)或以松散(san)聚(ju)集(ji)體(ti)生(sheng)長的(de)(de)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)，每聚(ju)集(ji)體(ti)僅(jin)有少量細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)。懸(xuan)(xuan)(xuan)浮(fu)-感(gan)受態(tai)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)包(bao)括但(dan)不限于在懸(xuan)(xuan)(xuan)浮(fu)液中生(sheng)長而沒有適應化(hua)或操作的(de)(de)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(例(li)如，造血(xue)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)、淋巴樣(yang)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao))和(he)已通(tong)過從依賴貼壁細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)至懸(xuan)(xuan)(xuan)浮(fu)生(sheng)長的(de)(de)逐漸適應而變成懸(xuan)(xuan)(xuan)浮(fu)感(gan)受態(tai)的(de)(de)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(例(li)如上皮細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)、成纖維細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao))。

在一些實施(shi)方案中(zhong)，宿主(zhu)細(xi)胞可以包括相對于它們源自的(de)細(xi)胞類型(xing)突變或重組細(xi)胞，包括表達定性(xing)或定量不同蛋白質譜的(de)細(xi)胞，其催化蛋白質的(de)翻(fan)譯后修飾(例(li)如(ru)(ru)糖基化酶(mei)諸(zhu)如(ru)(ru)糖基轉(zhuan)移酶(mei)和/或糖苷酶(mei)，加工酶(mei)諸(zhu)如(ru)(ru)肽原(yuan)，包括促進(jin)功能性(xing)vWF形成的(de)酶(mei))。

作為一(yi)(yi)(yi)個實例，宿主細胞包(bao)含編碼至(zhi)(zhi)少一(yi)(yi)(yi)種“加(jia)(jia)工(gong)因(yin)子”蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)的(de)(de)(de)引入的(de)(de)(de)多(duo)核苷酸(suan)，其(qi)中所述多(duo)核苷酸(suan)可操作地(di)連(lian)接至(zhi)(zhi)至(zhi)(zhi)少一(yi)(yi)(yi)種調節元件并表達(da)加(jia)(jia)工(gong)因(yin)子蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)。術語“加(jia)(jia)工(gong)因(yin)子”包(bao)括(kuo)促進功能性蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)質(zhi)形成(cheng)的(de)(de)(de)任何蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)質(zhi)、肽、非(fei)肽輔(fu)因(yin)子、底物(wu)或(huo)核酸(suan)。加(jia)(jia)工(gong)因(yin)子的(de)(de)(de)實例包(bao)括(kuo)但不(bu)限于(yu)成(cheng)對堿(jian)性氨(an)基酸(suan)轉化酶(mei)(PACE)、維生素K依賴性環氧化物(wu)還原酶(mei)(VKOR)、維生素K依賴性γ-谷氨(an)酰基羧(suo)化酶(mei)(VKGC)或(huo)其(qi)組合。具(ju)體的(de)(de)(de)實施方案利用針對PACE、VKOR和(he)/或(huo)VKGC的(de)(de)(de)人序(xu)列。

最初從人肝細(xi)胞系分(fen)離的(de)(de)PACE是枯(ku)草桿菌蛋白(bai)(bai)酶(mei)(mei)樣內(nei)肽(tai)酶(mei)(mei)，即對(dui)蛋白(bai)(bai)質(zhi)的(de)(de)堿性殘基(例如，-Lys-Arg-，-Arg-Arg-或-Lys-Lys-)處(chu)的(de)(de)切割(ge)具有特異性的(de)(de)肽(tai)原切割(ge)酶(mei)(mei)。PACE和(he)需(xu)要加工以產生成(cheng)熟蛋白(bai)(bai)的(de)(de)蛋白(bai)(bai)質(zhi)原的(de)(de)共(gong)表達導致成(cheng)熟蛋白(bai)(bai)的(de)(de)高水平表達。

對于(yu)vWF的(de)長(chang)期、高產量生(sheng)(sheng)產，通常優選(xuan)(xuan)(xuan)(xuan)穩(wen)定表(biao)達(da)(da)。例(li)如(ru)，穩(wen)定表(biao)達(da)(da)vWF的(de)細(xi)胞(bao)系可(ke)以(yi)使用可(ke)以(yi)在相同或(huo)單獨(du)的(de)載體(ti)上含有病毒復制起點和/或(huo)內(nei)源表(biao)達(da)(da)元件和選(xuan)(xuan)(xuan)(xuan)擇(ze)性(xing)(xing)標(biao)記基因(yin)的(de)表(biao)達(da)(da)載體(ti)進(jin)行(xing)轉化(hua)。在引入(ru)載體(ti)后，可(ke)以(yi)使細(xi)胞(bao)在非選(xuan)(xuan)(xuan)(xuan)擇(ze)性(xing)(xing)培(pei)(pei)養(yang)基中(zhong)生(sheng)(sheng)長(chang)約1-2天，然后將它們轉換到選(xuan)(xuan)(xuan)(xuan)擇(ze)性(xing)(xing)培(pei)(pei)養(yang)基。選(xuan)(xuan)(xuan)(xuan)擇(ze)性(xing)(xing)標(biao)記的(de)目的(de)是賦予對選(xuan)(xuan)(xuan)(xuan)擇(ze)的(de)抗性(xing)(xing)，并且它的(de)存在允(yun)許成功表(biao)達(da)(da)引入(ru)的(de)序列(lie)的(de)細(xi)胞(bao)的(de)生(sheng)(sheng)長(chang)和回收。

可(ke)以使用適合于細(xi)胞(bao)(bao)(bao)類型的(de)(de)(de)組織培養(yang)技術使穩定(ding)(ding)轉(zhuan)化(hua)(hua)的(de)(de)(de)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)的(de)(de)(de)抗(kang)性(xing)克隆增殖。任何數(shu)目(mu)的(de)(de)(de)選擇(ze)性(xing)標記(ji)或(huo)(huo)(huo)系(xi)統可(ke)用于回收(shou)或(huo)(huo)(huo)鑒定(ding)(ding)轉(zhuan)化(hua)(hua)或(huo)(huo)(huo)轉(zhuan)導(dao)的(de)(de)(de)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)系(xi)，無論是(shi)(shi)瞬(shun)時的(de)(de)(de)還(huan)是(shi)(shi)穩定(ding)(ding)的(de)(de)(de)。這些包括(kuo)但不限于分別(bie)可(ke)用于tk-或(huo)(huo)(huo)aprt-細(xi)胞(bao)(bao)(bao)中的(de)(de)(de)單純皰疹病毒胸苷激酶和腺(xian)嘌呤(ling)磷酸核糖(tang)基(ji)轉(zhuan)移(yi)酶基(ji)因。此(ci)外(wai)，抗(kang)代(dai)(dai)謝(xie)物、抗(kang)生素(su)或(huo)(huo)(huo)除草劑抗(kang)性(xing)可(ke)用作選擇(ze)的(de)(de)(de)基(ji)礎；例如，二氫葉酸還(huan)原酶(DHFR)賦(fu)予(yu)對(dui)氨(an)(an)甲蝶呤(ling)的(de)(de)(de)抗(kang)性(xing)；npt賦(fu)予(yu)對(dui)氨(an)(an)基(ji)糖(tang)苷類、新霉素(su)和G-418的(de)(de)(de)抗(kang)性(xing)；als或(huo)(huo)(huo)pat分別(bie)賦(fu)予(yu)對(dui)氯(lv)磺(huang)隆和膦絲菌素(su)乙酰轉(zhuan)移(yi)酶的(de)(de)(de)抗(kang)性(xing)。已經描述(shu)了另外(wai)的(de)(de)(de)可(ke)選擇(ze)基(ji)因，例如，trpB，其允(yun)許(xu)(xu)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)利(li)用吲哚(duo)代(dai)(dai)替色氨(an)(an)酸，或(huo)(huo)(huo)hisD，其允(yun)許(xu)(xu)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)利(li)用組氨(an)(an)醇代(dai)(dai)替組氨(an)(an)酸。

用(yong)編碼vWF的(de)多核(he)苷酸序(xu)列轉化(hua)的(de)宿主細胞可在適合于從細胞培(pei)(pei)養(yang)(yang)物(wu)表(biao)達和回(hui)收(shou)vWF的(de)條件(jian)下培(pei)(pei)養(yang)(yang)。可以使用(yong)任何化(hua)學成(cheng)分(fen)確定(ding)的(de)細胞培(pei)(pei)養(yang)(yang)基(ji)。具體實例包括無血清培(pei)(pei)養(yang)(yang)基(ji)、無蛋白質(zhi)培(pei)(pei)養(yang)(yang)基(ji)、化(hua)學成(cheng)分(fen)確定(ding)的(de)培(pei)(pei)養(yang)(yang)基(ji)和缺(que)乏(fa)動物(wu)來源組分(fen)的(de)培(pei)(pei)養(yang)(yang)基(ji)。

示例性(xing)細(xi)胞(bao)培(pei)養(yang)(yang)(yang)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)包括(kuo)但不限于(yu)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)礎(chu)培(pei)養(yang)(yang)(yang)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)Eagle(BME)；CMRL-1066培(pei)養(yang)(yang)(yang)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)；Dulbecco’s改良(liang)的(de)(de)Eagle培(pei)養(yang)(yang)(yang)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(DMEM)；格拉(la)斯哥最低必需(xu)培(pei)養(yang)(yang)(yang)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)，GMEM；H-Y培(pei)養(yang)(yang)(yang)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(Hybri-)；培(pei)養(yang)(yang)(yang)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)199；最低必需(xu)培(pei)養(yang)(yang)(yang)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)Eagle(EMEM)；NCTC培(pei)養(yang)(yang)(yang)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)；Swim’s S-77培(pei)養(yang)(yang)(yang)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)；和Williams培(pei)養(yang)(yang)(yang)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)E.Click’s培(pei)養(yang)(yang)(yang)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)；MCDB培(pei)養(yang)(yang)(yang)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)131和Iscove’s改良(liang)的(de)(de)Dulbecco’s培(pei)養(yang)(yang)(yang)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(IMDM)。還包括(kuo)DMEM/Ham's營養(yang)(yang)(yang)混合物(wu)F-12(50:50)，其經常用作用于(yu)開(kai)發專有和特殊培(pei)養(yang)(yang)(yang)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)以培(pei)養(yang)(yang)(yang)用于(yu)生(sheng)物(wu)制造(zao)的(de)(de)CHO細(xi)胞(bao)的(de)(de)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)礎(chu)培(pei)養(yang)(yang)(yang)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)，以及為CHO細(xi)胞(bao)開(kai)發的(de)(de)MCDB培(pei)養(yang)(yang)(yang)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)302。

在具體實施方案中，所述培養基是補充有一種或多種以下成分的基于無血清DMEM/HAM’s F12的制劑：(a)谷氨酰胺；例如，最終濃度約0.9g/l，(b)硫酸鐵x7H₂O，例(li)如在(zai)約(yue)0.0006g/l，(c)腐(fu)胺(an)，x 2HCl，例(li)如在(zai)約(yue)0.0036g/l，(d)維生素K1，例(li)如在(zai)約(yue)0.0025g/l，(e)Synperonic；例(li)如，在(zai)最終濃度約(yue)1g/l，(f)酚(fen)紅(hong)，例(li)如在(zai)約(yue)0.008g/l，(g)乙醇(chun)胺(an)，例(li)如在(zai)約(yue)0.00153g/l，和/或(huo)(h)碳酸氫鈉(na)，例(li)如在(zai)約(yue)2g/l。

在具體實施方案中，細胞培養基是CD-CHO培養基或CD-CHO AGT^TM培養基或CD OptiCHO^TM AGT^TM培養基，其是可商購的或Pro-CHO^TM或Power-CHO^TM培養基CH-CHO、CD-CHO AGT^TM和CD OptiCHO^TM AGT^TM培養基可以用作化學成分確定的培養基、無蛋白質培養基和/或無血清培養基，并且如果需要可以補充L-谷氨酰胺。無需鈣補充的1X CD-CHO AGT^TM培養基的Ca²⁺水平可以(yi)為(wei)約0.25-0.35mM的范(fan)圍(通(tong)過(guo)原子吸收(shou)光譜法(fa)測定(ding))。

如(ru)上所述，某些實施(shi)方案(an)利用無血清(qing)細(xi)胞(bao)(bao)培(pei)養基(ji)。一(yi)個(ge)實例包括(kuo)確定(ding)的(de)無血清(qing)培(pei)養基(ji)，其能夠生長寬(kuan)范(fan)圍的(de)懸浮液(ye)和(he)單層細(xi)胞(bao)(bao)，并(bing)且其包括(kuo)由胎球蛋白、轉鐵蛋白、磷(lin)脂(zhi)(zhi)酰膽堿(例如(ru)1-油酰基(ji)-2-棕(zong)櫚酰基(ji)-磷(lin)脂(zhi)(zhi)酰膽堿)、亞(ya)油酸(suan)(suan)和(he)膽固醇組(zu)成(cheng)的(de)血清(qing)替(ti)代物。另一(yi)個(ge)實例包括(kuo)含(han)有固醇(例如(ru)膽固醇)的(de)細(xi)胞(bao)(bao)培(pei)養基(ji)，其通(tong)過(guo)表面活性劑而(er)不是血清(qing)產物或磷(lin)脂(zhi)(zhi)膠(jiao)束穩定(ding)，并(bing)任選(xuan)含(han)有可溶性羧酸(suan)(suan)作為(wei)脂(zhi)(zhi)肪(fang)酸(suan)(suan)前體以滿(man)足(zu)脂(zhi)(zhi)質需求，和(he)/或能夠促進細(xi)胞(bao)(bao)的(de)醇。

某些實施方案采用缺(que)乏(fa)“動(dong)(dong)物(wu)(wu)(wu)(wu)來(lai)源(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)”組(zu)(zu)分(fen)(fen)(fen)(fen)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)細(xi)胞(bao)培(pei)(pei)(pei)(pei)養(yang)基(ji)。如(ru)(ru)本文所用，“動(dong)(dong)物(wu)(wu)(wu)(wu)來(lai)源(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)”組(zu)(zu)分(fen)(fen)(fen)(fen)可以(yi)包括在(zai)(zai)完整(zheng)動(dong)(dong)物(wu)(wu)(wu)(wu)中(zhong)(zhong)產生(sheng)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)任何組(zu)(zu)分(fen)(fen)(fen)(fen)(例(li)(li)如(ru)(ru)，從(cong)(cong)血清(qing)中(zhong)(zhong)分(fen)(fen)(fen)(fen)離和純(chun)(chun)化(hua)(hua)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)質(zhi)(zhi)(zhi))或(huo)(huo)(huo)通過使(shi)用在(zai)(zai)完整(zheng)動(dong)(dong)物(wu)(wu)(wu)(wu)中(zhong)(zhong)產生(sheng)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)組(zu)(zu)分(fen)(fen)(fen)(fen)產生(sheng)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)組(zu)(zu)分(fen)(fen)(fen)(fen)(例(li)(li)如(ru)(ru)，通過使(shi)用從(cong)(cong)動(dong)(dong)物(wu)(wu)(wu)(wu)分(fen)(fen)(fen)(fen)離和純(chun)(chun)化(hua)(hua)以(yi)水解植(zhi)物(wu)(wu)(wu)(wu)來(lai)源(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)材料的(de)(de)(de)(de)(de)(de)酶(mei))。相(xiang)反，具有(you)動(dong)(dong)物(wu)(wu)(wu)(wu)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)序列(即(ji)該蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)具有(you)動(dong)(dong)物(wu)(wu)(wu)(wu)中(zhong)(zhong)基(ji)因組(zu)(zu)來(lai)源(yuan)(yuan)(yuan)(yuan))、但是(shi)(shi)是(shi)(shi)在(zai)(zai)細(xi)胞(bao)培(pei)(pei)(pei)(pei)養(yang)物(wu)(wu)(wu)(wu)中(zhong)(zhong)體外產生(sheng)(例(li)(li)如(ru)(ru)在(zai)(zai)重組(zu)(zu)酵母(mu)或(huo)(huo)(huo)細(xi)菌(jun)細(xi)胞(bao)中(zhong)(zhong)或(huo)(huo)(huo)在(zai)(zai)重組(zu)(zu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)或(huo)(huo)(huo)非重組(zu)(zu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)哺乳(ru)動(dong)(dong)物(wu)(wu)(wu)(wu)細(xi)胞(bao)系中(zhong)(zhong))、在(zai)(zai)缺(que)少在(zai)(zai)完整(zheng)動(dong)(dong)物(wu)(wu)(wu)(wu)中(zhong)(zhong)產生(sheng)和從(cong)(cong)其(qi)分(fen)(fen)(fen)(fen)離和純(chun)(chun)化(hua)(hua)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)組(zu)(zu)分(fen)(fen)(fen)(fen)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)培(pei)(pei)(pei)(pei)養(yang)基(ji)中(zhong)(zhong)產生(sheng)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)，不(bu)是(shi)(shi)“動(dong)(dong)物(wu)(wu)(wu)(wu)來(lai)源(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)”組(zu)(zu)分(fen)(fen)(fen)(fen)。例(li)(li)如(ru)(ru)，具有(you)動(dong)(dong)物(wu)(wu)(wu)(wu)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)序列(即(ji)具有(you)動(dong)(dong)物(wu)(wu)(wu)(wu)中(zhong)(zhong)基(ji)因組(zu)(zu)來(lai)源(yuan)(yuan)(yuan)(yuan))但在(zai)(zai)缺(que)乏(fa)動(dong)(dong)物(wu)(wu)(wu)(wu)來(lai)源(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)組(zu)(zu)分(fen)(fen)(fen)(fen)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)培(pei)(pei)(pei)(pei)養(yang)基(ji)中(zhong)(zhong)在(zai)(zai)重組(zu)(zu)細(xi)胞(bao)中(zhong)(zhong)產生(sheng)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)不(bu)是(shi)(shi)“動(dong)(dong)物(wu)(wu)(wu)(wu)來(lai)源(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)”組(zu)(zu)分(fen)(fen)(fen)(fen)。因此，缺(que)乏(fa)動(dong)(dong)物(wu)(wu)(wu)(wu)來(lai)源(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)組(zu)(zu)分(fen)(fen)(fen)(fen)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)細(xi)胞(bao)培(pei)(pei)(pei)(pei)養(yang)基(ji)是(shi)(shi)可含有(you)重組(zu)(zu)產生(sheng)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)動(dong)(dong)物(wu)(wu)(wu)(wu)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)細(xi)胞(bao)培(pei)(pei)(pei)(pei)養(yang)基(ji)；但是(shi)(shi)這樣(yang)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)培(pei)(pei)(pei)(pei)養(yang)基(ji)不(bu)含例(li)(li)如(ru)(ru)動(dong)(dong)物(wu)(wu)(wu)(wu)血清(qing)或(huo)(huo)(huo)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)或(huo)(huo)(huo)從(cong)(cong)動(dong)(dong)物(wu)(wu)(wu)(wu)血清(qing)純(chun)(chun)化(hua)(hua)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)其(qi)它產物(wu)(wu)(wu)(wu)。這樣(yang)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)培(pei)(pei)(pei)(pei)養(yang)基(ji)可以(yi)例(li)(li)如(ru)(ru)含有(you)一種(zhong)或(huo)(huo)(huo)多種(zhong)源(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)自植(zhi)物(wu)(wu)(wu)(wu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)組(zu)(zu)分(fen)(fen)(fen)(fen)。

可使用在本發明的(de)條件下支持細(xi)胞(bao)生(sheng)長(chang)和維(wei)持的(de)任何細(xi)胞(bao)培(pei)(pei)養基。通常，培(pei)(pei)養基含(han)有(you)水、重量摩爾滲透壓濃度(du)調節劑、緩沖液、能量源、氨基酸(suan)、無(wu)機或(huo)重組(zu)(zu)鐵源、一種或(huo)多種合成或(huo)重組(zu)(zu)生(sheng)長(chang)因(yin)子(zi)、維(wei)生(sheng)素(su)和輔因(yin)子(zi)。缺少動物來源的(de)組(zu)(zu)分和/或(huo)蛋(dan)白(bai)質(zhi)的(de)培(pei)(pei)養基可從商業供應商獲得，諸如，例如，SAFC、或(huo)

例如(ru)，某(mou)些實施方(fang)(fang)案采用懸(xuan)浮細胞培(pei)養技術(shu)。懸(xuan)浮細胞培(pei)養技術(shu)的(de)實例包括灌注方(fang)(fang)法(fa)、分批方(fang)(fang)法(fa)(例如(ru)，簡(jian)單分批方(fang)(fang)法(fa)、補(bu)料分批方(fang)(fang)法(fa))和(he)取出-填充(draw-fill)方(fang)(fang)法(fa)。

在懸浮細(xi)(xi)胞灌注(zhu)方法中，通常將(jiang)細(xi)(xi)胞接(jie)種(zhong)到(dao)含(han)有細(xi)(xi)胞培養(yang)基的(de)種(zhong)子培養(yang)容器中，所述細(xi)(xi)胞培養(yang)基優選缺乏動物來源的(de)組(zu)分，并且(qie)增殖直到(dao)細(xi)(xi)胞達到(dao)最(zui)小密度。

隨后，將增(zeng)殖(zhi)的種子培(pei)(pei)養(yang)(yang)物轉移(yi)到大規模培(pei)(pei)養(yang)(yang)容器(qi)中(zhong)，其同樣包含優選缺乏動物來源的組(zu)分(fen)的培(pei)(pei)養(yang)(yang)基。細胞(bao)增(zeng)殖(zhi)直到達到至少預(yu)定的細胞(bao)密(mi)度。在該階段(duan)中(zhong)，細胞(bao)在懸浮液中(zhong)生長以允許培(pei)(pei)養(yang)(yang)容器(qi)內的細胞(bao)數目增(zeng)加到預(yu)定或臨界值。

可(ke)以(yi)通過用新鮮培養(yang)(yang)(yang)基連續灌(guan)(guan)注培養(yang)(yang)(yang)容器(qi)(qi)來(lai)進(jin)行(xing)培養(yang)(yang)(yang)基交換，同時重組細(xi)(xi)胞保留在培養(yang)(yang)(yang)容器(qi)(qi)中。灌(guan)(guan)注培養(yang)(yang)(yang)基的(de)量(liang)可(ke)以(yi)取決于細(xi)(xi)胞密度，并且(qie)通常為(wei)每天(24小(xiao)時)罐容量(liang)的(de)約10-300％，優選約10％至(zhi)95％，25％至(zhi)80％。

在生長期(qi)，培(pei)養物增殖直到(dao)(dao)(dao)細胞達(da)到(dao)(dao)(dao)一定密(mi)度。達(da)到(dao)(dao)(dao)這種密(mi)度，培(pei)養物進入生產階段。

當(dang)細胞密度達到適(shi)(shi)于(yu)(yu)開始生產階段(duan)(duan)的(de)(de)值時(shi)，罐(guan)(guan)中的(de)(de)罐(guan)(guan)培(pei)養基(ji)的(de)(de)約60-95％每(mei)24小(xiao)時(shi)更換，優(you)選(xuan)約80％。在生產階段(duan)(duan)中也(ye)優(you)選(xuan)使用80％的(de)(de)培(pei)養基(ji)交(jiao)換。也(ye)可(ke)以(yi)在這一(yi)點改變設(she)定(ding)點，并設(she)定(ding)為適(shi)(shi)合于(yu)(yu)生產各自蛋(dan)白質的(de)(de)值。培(pei)養基(ji)灌(guan)注優(you)選(xuan)連續進行。培(pei)養基(ji)的(de)(de)流速可(ke)以(yi)以(yi)每(mei)個限定(ding)的(de)(de)時(shi)間段(duan)(duan)的(de)(de)培(pei)養基(ji)的(de)(de)罐(guan)(guan)體積百分比表(biao)示。

培養(yang)基(ji)灌(guan)注可以(yi)是(shi)每(mei)10-48小(xiao)時(shi)約10-200％罐(guan)體(ti)積；優選地，培養(yang)基(ji)灌(guan)注為每(mei)10-48小(xiao)時(shi)約90％，更(geng)優選地，培養(yang)基(ji)灌(guan)注為每(mei)24小(xiao)時(shi)約80％罐(guan)體(ti)積。

可以(yi)使用(yong)許多細(xi)胞(bao)保留裝置實現(xian)培養(yang)容器(qi)內(nei)(nei)的(de)細(xi)胞(bao)保留。不同的(de)分離原理可用(yong)于該(gai)方(fang)法。該(gai)方(fang)法可以(yi)基于重力沉(chen)降、聲(sheng)學沉(chen)降、離心沉(chen)降或過(guo)(guo)濾(lv)。以(yi)下成套設備可以(yi)全部(bu)(bu)用(yong)于該(gai)方(fang)法：內(nei)(nei)部(bu)(bu)或外部(bu)(bu)過(guo)(guo)濾(lv)器(qi)例如內(nei)(nei)部(bu)(bu)或外部(bu)(bu)旋轉過(guo)(guo)濾(lv)器(qi)(例如來自(zi)(zi)Sartorius的(de)Spinfilter P)，外部(bu)(bu)錯(cuo)流過(guo)(guo)濾(lv)器(qi)、外部(bu)(bu)或內(nei)(nei)部(bu)(bu)中空纖(xian)維(wei)筒式過(guo)(guo)濾(lv)器(qi)(例如來自(zi)(zi)Refine的(de)交變切向流(ATF))。

VWF多(duo)聚體(ti)可以從(cong)簡單(dan)的(de)(de)(de)(de)二聚體(ti)變(bian)化到由超過(guo)16個(ge)共價連接的(de)(de)(de)(de)vWF單(dan)體(ti)組成的(de)(de)(de)(de)多(duo)聚體(ti)。不(bu)同的(de)(de)(de)(de)蛋白質形式(shi)確實(shi)(shi)(shi)具有不(bu)同的(de)(de)(de)(de)生物活(huo)性。例如，vWF的(de)(de)(de)(de)低分子(zi)量(liang)多(duo)聚體(ti)確實(shi)(shi)(shi)具有較低的(de)(de)(de)(de)利托菌素(su)輔因(yin)(yin)子(zi)活(huo)性(vWF:RCoF)，而(er)vWF的(de)(de)(de)(de)高(gao)分子(zi)量(liang)形式(shi)確實(shi)(shi)(shi)具有較高(gao)的(de)(de)(de)(de)vWF:RCoF活(huo)性。vWF制(zhi)劑(ji)(ji)的(de)(de)(de)(de)高(gao)vWF:RCoF活(huo)性與初始止(zhi)血(xue)的(de)(de)(de)(de)高(gao)活(huo)性相關，因(yin)(yin)為具有高(gao)vWF:RCoF的(de)(de)(de)(de)vWF制(zhi)劑(ji)(ji)更(geng)有效地促進(jin)血(xue)小板的(de)(de)(de)(de)凝集(ji)和血(xue)小板對損傷暴露的(de)(de)(de)(de)膠(jiao)原蛋白的(de)(de)(de)(de)系鏈束縛。人血(xue)漿中vWF:RCoF與抗(kang)原含量(liang)(vWF:Ag)的(de)(de)(de)(de)比率定義(yi)為1.0。

因此(ci)，期(qi)望制備具(ju)有以下vWF:RCoF與vWF:Ag比率的藥物(wu)vWF制劑：至(zhi)(zhi)少(shao)(shao)(shao)(shao)0.5、或(huo)(huo)(huo)至(zhi)(zhi)少(shao)(shao)(shao)(shao)0.55、或(huo)(huo)(huo)至(zhi)(zhi)少(shao)(shao)(shao)(shao)0.6、或(huo)(huo)(huo)至(zhi)(zhi)少(shao)(shao)(shao)(shao)0.65、或(huo)(huo)(huo)至(zhi)(zhi)少(shao)(shao)(shao)(shao)0.7、或(huo)(huo)(huo)至(zhi)(zhi)少(shao)(shao)(shao)(shao)0.75、或(huo)(huo)(huo)至(zhi)(zhi)少(shao)(shao)(shao)(shao)0.8、或(huo)(huo)(huo)至(zhi)(zhi)少(shao)(shao)(shao)(shao)0.85、或(huo)(huo)(huo)至(zhi)(zhi)少(shao)(shao)(shao)(shao)0.9、或(huo)(huo)(huo)至(zhi)(zhi)少(shao)(shao)(shao)(shao)0.95或(huo)(huo)(huo)至(zhi)(zhi)少(shao)(shao)(shao)(shao)1.0。

在某(mou)些治療情況(kuang)下，還優選制備vWF制劑，其確實具有比(bi)人血漿中存在的(de)(de)vWF:RCoF/vWF:Ag比(bi)率(lv)更高(gao)(gao)的(de)(de)升高(gao)(gao)的(de)(de)vWF:RCoF/vWF:Ag比(bi)率(lv)，例如至(zhi)(zhi)少(shao)(shao)(shao)(shao)1.05、或(huo)至(zhi)(zhi)少(shao)(shao)(shao)(shao)1.1、或(huo)至(zhi)(zhi)少(shao)(shao)(shao)(shao)1.15、或(huo)至(zhi)(zhi)少(shao)(shao)(shao)(shao)1.2或(huo)至(zhi)(zhi)少(shao)(shao)(shao)(shao)1.25、或(huo)至(zhi)(zhi)少(shao)(shao)(shao)(shao)1.3、或(huo)至(zhi)(zhi)少(shao)(shao)(shao)(shao)1.35、或(huo)至(zhi)(zhi)少(shao)(shao)(shao)(shao)1.40、或(huo)至(zhi)(zhi)少(shao)(shao)(shao)(shao)1.45或(huo)至(zhi)(zhi)少(shao)(shao)(shao)(shao)1.50、或(huo)至(zhi)(zhi)少(shao)(shao)(shao)(shao)1.55或(huo)至(zhi)(zhi)少(shao)(shao)(shao)(shao)1.60、或(huo)至(zhi)(zhi)少(shao)(shao)(shao)(shao)1.65或(huo)至(zhi)(zhi)少(shao)(shao)(shao)(shao)1.70或(huo)至(zhi)(zhi)少(shao)(shao)(shao)(shao)1.75、或(huo)至(zhi)(zhi)少(shao)(shao)(shao)(shao)1.80、或(huo)至(zhi)(zhi)少(shao)(shao)(shao)(shao)1.85或(huo)至(zhi)(zhi)少(shao)(shao)(shao)(shao)1.90或(huo)至(zhi)(zhi)少(shao)(shao)(shao)(shao)1.95或(huo)至(zhi)(zhi)少(shao)(shao)(shao)(shao)2.0。

為了制(zhi)備具(ju)有升高的(de)(de)(de)(de)vWF:RCoF/vWF:Ag比(bi)率的(de)(de)(de)(de)藥物vWF制(zhi)劑(ji)，通(tong)常(chang)(chang)需要設計增(zeng)加(jia)vWF的(de)(de)(de)(de)較高分(fen)子量多聚體(ti)的(de)(de)(de)(de)量的(de)(de)(de)(de)下(xia)游純化程序。這通(tong)常(chang)(chang)是麻煩(fan)的(de)(de)(de)(de)，并且可能(neng)導(dao)致(zhi)vWF產(chan)物的(de)(de)(de)(de)產(chan)率降低，因為每(mei)個下(xia)游純化步驟通(tong)常(chang)(chang)與一(yi)些產(chan)物損(sun)失(shi)相關。

本發明的(de)(de)(de)發明人(ren)現已(yi)驚(jing)奇地發現，在細胞培養過(guo)程中在制備的(de)(de)(de)上游(you)階(jie)段已(yi)經可(ke)以(yi)通過(guo)使(shi)用分離(li)裝(zhuang)置來實現vWF的(de)(de)(de)更(geng)高(gao)分子(zi)(zi)(zi)量(liang)多(duo)聚體(ti)的(de)(de)(de)富集，所述(shu)分離(li)裝(zhuang)置在生(sheng)物反應器(滲(shen)余物)保留vWF的(de)(de)(de)所需高(gao)分子(zi)(zi)(zi)量(liang)多(duo)聚體(ti)形(xing)(xing)式而較不(bu)期望的(de)(de)(de)較低分子(zi)(zi)(zi)量(liang)形(xing)(xing)式的(de)(de)(de)vWF通過(guo)分離(li)裝(zhuang)置(滲(shen)透物)。然而，由于(yu)較低分子(zi)(zi)(zi)量(liang)形(xing)(xing)式的(de)(de)(de)vWF仍然能(neng)夠結合和穩定因子(zi)(zi)(zi)VIII，滲(shen)透物中的(de)(de)(de)級分也可(ke)以(yi)是(shi)用于(yu)某些特定用途(tu)的(de)(de)(de)產(chan)物，例如用于(yu)穩定因子(zi)(zi)(zi)VIII。在后一種情況下(xia)，vWF多(duo)聚體(ti)的(de)(de)(de)低分子(zi)(zi)(zi)量(liang)級分可(ke)以(yi)是(shi)所需的(de)(de)(de)vWF形(xing)(xing)式。

收獲富含HMW vWF多(duo)聚體(ti)的(de)級(ji)分(fen)可(ke)以在(zai)i)在(zai)發(fa)(fa)酵(jiao)方(fang)法結(jie)束時(shi)或ii)伴隨(sui)地通過使(shi)用另(ling)外的(de)分(fen)離裝置(zhi)進行。在(zai)情況ii)中(zhong)的(de)該另(ling)外的(de)分(fen)離裝置(zhi)可(ke)以是將細胞(bao)與(yu)滲余物(wu)分(fen)開(kai)的(de)任何分(fen)離裝置(zhi)，其(qi)不進一步將LMW vWF多(duo)聚體(ti)與(yu)HMW vWF多(duo)聚體(ti)分(fen)開(kai)。作(zuo)為(wei)在(zai)情況ii)中(zhong)的(de)這(zhe)種發(fa)(fa)酵(jiao)方(fang)法的(de)結(jie)果，獲得富含HMW vWF多(duo)聚體(ti)的(de)vWF制劑(ji)，并且與(yu)在(zai)情況i)中(zhong)的(de)發(fa)(fa)酵(jiao)方(fang)法相(xiang)比，在(zai)生物(wu)反(fan)應(ying)器中(zhong)的(de)停留時(shi)間(jian)減少(shao)。縮(suo)短(duan)停留時(shi)間(jian)通常有(you)利于使(shi)降解(jie)事件最小化(hua)。

然(ran)而(er)，如(ru)果vWF:RCoF/vWF:Ag的(de)(de)比率(lv)高于2.0，當將這(zhe)樣的(de)(de)制劑給(gei)予患者時，血栓(shuan)栓(shuan)塞(sai)并發癥的(de)(de)風險(xian)增加，因為這(zhe)種(zhong)超大分子量多聚體vWF可導致血小板在(zai)非生(sheng)理情況下凝集。

如果(guo)這種超(chao)大分子(zi)量多聚體存在(zai)于細胞培養基中，應用截留分子(zi)量(MWCO)為10,000,000Da的分離裝置可(ke)能是有益的，其(qi)在(zai)生物反應器(滲余物)中保留超(chao)大多聚體vWF，而所需的高(gao)分子(zi)量形式的vWF被(bei)分離進入濾液。

本發明人還發現了用于通(tong)過(guo)在生物反(fan)應(ying)器中在細(xi)胞(bao)(bao)(bao)培(pei)(pei)養(yang)(yang)基中培(pei)(pei)養(yang)(yang)宿主細(xi)胞(bao)(bao)(bao)來制備重(zhong)組von Willebrand因子(vWF)的方法(fa)，其(qi)中宿主細(xi)胞(bao)(bao)(bao)產(chan)生分(fen)泌(mi)到細(xi)胞(bao)(bao)(bao)培(pei)(pei)養(yang)(yang)基中的重(zhong)組vWF，并且(qie)其(qi)中在細(xi)胞(bao)(bao)(bao)培(pei)(pei)養(yang)(yang)基中的vWF包含不(bu)同大小的vWF多(duo)聚(ju)體，其(qi)中將至少(shao)一(yi)種細(xi)胞(bao)(bao)(bao)培(pei)(pei)養(yang)(yang)基組分(fen)進料至細(xi)胞(bao)(bao)(bao)培(pei)(pei)養(yang)(yang)基中，并且(qie)其(qi)中將包含細(xi)胞(bao)(bao)(bao)、重(zhong)組vWF和細(xi)胞(bao)(bao)(bao)培(pei)(pei)養(yang)(yang)基的細(xi)胞(bao)(bao)(bao)培(pei)(pei)養(yang)(yang)物泵送通(tong)過(guo)分(fen)離(li)系統，并且(qie)其(qi)中所述分(fen)離(li)系統將vWF多(duo)聚(ju)體分(fen)離(li)成至少(shao)：

滲透物級(ji)分(fen)，與分(fen)離前的(de)細胞培養上清液(ye)中的(de)vWF多(duo)(duo)聚(ju)體(ti)相比，所述滲透物級(ji)分(fen)富含vWF的(de)低分(fen)子(zi)量(LMW)多(duo)(duo)聚(ju)體(ti)而vWF的(de)高分(fen)子(zi)量(HMW)多(duo)(duo)聚(ju)體(ti)減少，和

滲余物級(ji)分(fen)，與分(fen)離前的(de)細(xi)胞培(pei)養上清液中(zhong)的(de)vWF多(duo)聚體(ti)相比，所述(shu)滲余物級(ji)分(fen)的(de)vWF的(de)低分(fen)子量(LMW)多(duo)聚體(ti)減少而富含vWF的(de)高分(fen)子量(HMW)多(duo)聚體(ti)。

HMW vWF多聚(ju)體比率優選等于(yu)(yu)或(huo)(huo)(huo)(huo)大(da)(da)(da)于(yu)(yu)1.1、或(huo)(huo)(huo)(huo)大(da)(da)(da)于(yu)(yu)1.2、或(huo)(huo)(huo)(huo)大(da)(da)(da)于(yu)(yu)1.25、或(huo)(huo)(huo)(huo)大(da)(da)(da)于(yu)(yu)1.30、或(huo)(huo)(huo)(huo)大(da)(da)(da)于(yu)(yu)1.35、或(huo)(huo)(huo)(huo)大(da)(da)(da)于(yu)(yu)1.40或(huo)(huo)(huo)(huo)大(da)(da)(da)于(yu)(yu)1.45或(huo)(huo)(huo)(huo)大(da)(da)(da)于(yu)(yu)1.50或(huo)(huo)(huo)(huo)大(da)(da)(da)于(yu)(yu)1.60、或(huo)(huo)(huo)(huo)大(da)(da)(da)于(yu)(yu)1.70、或(huo)(huo)(huo)(huo)大(da)(da)(da)于(yu)(yu)1.80、或(huo)(huo)(huo)(huo)大(da)(da)(da)于(yu)(yu)1.90。

在優選的(de)實施方案中，本發(fa)明還包(bao)(bao)括生物反(fan)應器(qi)，其(qi)包(bao)(bao)含(han)(han)在滲余物中的(de)包(bao)(bao)含(han)(han)vWF多聚體的(de)細(xi)(xi)胞(bao)培(pei)養基和在滲透物中包(bao)(bao)含(han)(han)vWF多聚體的(de)細(xi)(xi)胞(bao)培(pei)養基，其(qi)中HMW vWF多聚體比(bi)率等于(yu)(yu)或(huo)(huo)大(da)(da)(da)于(yu)(yu)1.1、或(huo)(huo)大(da)(da)(da)于(yu)(yu)1.2、或(huo)(huo)大(da)(da)(da)于(yu)(yu)1.25、或(huo)(huo)大(da)(da)(da)于(yu)(yu)1.30、或(huo)(huo)大(da)(da)(da)于(yu)(yu)1.35、或(huo)(huo)大(da)(da)(da)于(yu)(yu)1.40或(huo)(huo)大(da)(da)(da)于(yu)(yu)1.45或(huo)(huo)大(da)(da)(da)于(yu)(yu)1.50或(huo)(huo)大(da)(da)(da)于(yu)(yu)1.60、或(huo)(huo)大(da)(da)(da)于(yu)(yu)1.70、或(huo)(huo)大(da)(da)(da)于(yu)(yu)1.80、或(huo)(huo)大(da)(da)(da)于(yu)(yu)1.90。

LMW vWF多聚體比率優選等于(yu)(yu)(yu)或(huo)(huo)(huo)小(xiao)(xiao)于(yu)(yu)(yu)0.90、或(huo)(huo)(huo)小(xiao)(xiao)于(yu)(yu)(yu)0.85、或(huo)(huo)(huo)小(xiao)(xiao)于(yu)(yu)(yu)0.80、或(huo)(huo)(huo)小(xiao)(xiao)于(yu)(yu)(yu)0.75、或(huo)(huo)(huo)小(xiao)(xiao)于(yu)(yu)(yu)0.70或(huo)(huo)(huo)小(xiao)(xiao)于(yu)(yu)(yu)0.65或(huo)(huo)(huo)小(xiao)(xiao)于(yu)(yu)(yu)0.60、或(huo)(huo)(huo)小(xiao)(xiao)于(yu)(yu)(yu)0.55、或(huo)(huo)(huo)小(xiao)(xiao)于(yu)(yu)(yu)0.50。

本發明的優選實(shi)施方(fang)案還(huan)包括生物(wu)反應器(qi)，其(qi)包含含有vWF多(duo)聚體(ti)的細(xi)胞(bao)培養(yang)基(ji)和(he)在滲透(tou)物(wu)中的包含vWF多(duo)聚體(ti)的細(xi)胞(bao)培養(yang)基(ji)，其(qi)中LMW vWF多(duo)聚體(ti)比(bi)率小(xiao)于0.90、或(huo)小(xiao)于0.85、或(huo)小(xiao)于0.80、或(huo)小(xiao)于0.75、或(huo)小(xiao)于0.70或(huo)小(xiao)于0.65或(huo)小(xiao)于0.60、或(huo)小(xiao)于0.55、或(huo)小(xiao)于0.50。

通過選擇(ze)(ze)分離裝置的(de)(de)MWCO，本發明(ming)使本領域(yu)技術人(ren)員能夠選擇(ze)(ze)vWF產物的(de)(de)分子大小，然后根(gen)據本領域(yu)公知的(de)(de)技術將其隨后純化。

在(zai)(zai)發酵階段，即在(zai)(zai)上游(you)(you)加工過程中(zhong)(zhong)，不同(tong)分(fen)(fen)子量的(de)(de)(de)(de)vWF多(duo)(duo)聚(ju)體(ti)的(de)(de)(de)(de)此(ci)(ci)類(lei)分(fen)(fen)離極大地(di)促(cu)進了在(zai)(zai)隨后的(de)(de)(de)(de)發酵后或下(xia)游(you)(you)純化(hua)中(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)分(fen)(fen)離，因為vWF多(duo)(duo)聚(ju)體(ti)的(de)(de)(de)(de)所(suo)需(xu)級(ji)分(fen)(fen)已經富(fu)含所(suo)需(xu)的(de)(de)(de)(de)vWF多(duo)(duo)聚(ju)體(ti)。因此(ci)(ci)，在(zai)(zai)下(xia)游(you)(you)加工中(zhong)(zhong)需(xu)要潛在(zai)(zai)的(de)(de)(de)(de)更(geng)少的(de)(de)(de)(de)純化(hua)步(bu)驟，導致更(geng)快(kuai)的(de)(de)(de)(de)加工時(shi)間和更(geng)高(gao)的(de)(de)(de)(de)產率。本發明通常還導致所(suo)得vWF制品的(de)(de)(de)(de)更(geng)高(gao)純度，因為純化(hua)的(de)(de)(de)(de)一部分(fen)(fen)已經在(zai)(zai)生物反應器(qi)中(zhong)(zhong)開(kai)始，隨后下(xia)游(you)(you)加工從已經富(fu)集了所(suo)需(xu)分(fen)(fen)子量級(ji)分(fen)(fen)的(de)(de)(de)(de)vWF開(kai)始。

某些實施方案可包括監測和控制某些參數諸如pH、溶解氧張力(DOT)和溫度的培養方法。作為一個實例，可以通過調節頂空氣體和/或噴霧器中的CO₂濃度，以及當需要時向培養基中加入堿來控制pH。因此，某些實施方案包括在細胞培養基中大規模生產重組多肽，其中監測培養物中溶解的CO₂的濃度，并且使用通過培養基的恒定或間歇性空氣噴射來維持CO₂的某些濃度范圍。在一些方面，溶解的CO₂的濃度的預定范圍為約80-200mmHg，優選約100-180mmHg，例如約140mmHg。在大多數情況下，相對于監測的培養基中溶解的CO₂的濃度來控制空氣的噴射速率。例如，空氣的噴射速率可以在每升培養液約0.000-0.100L/min，優選約每升培養液約0.005-0.020L/min的范圍內，特別是當監測的溶解CO₂的濃度為等于(預定)設定點濃度。在一些情況下，當監測的溶解CO₂的濃度等于設定點濃度-5mmHg時，空氣的噴射速率在每升培養液0.000-0.005的范圍內，諸如約0.0L/min；當監測的溶解CO₂的(de)(de)(de)濃度(du)等于設定點濃度(du)+5mmHg時，在每升培(pei)養(yang)液(ye)0.010-0.100L/min的(de)(de)(de)范圍內(參見美國申請號2006/0216790)。這樣(yang)的(de)(de)(de)方(fang)法可以用于在細(xi)胞培(pei)養(yang)基中維持期望的(de)(de)(de)pH，例如，其中添加到培(pei)養(yang)基中的(de)(de)(de)任何(he)固體或(huo)液(ye)體物質不產生高于約7.5的(de)(de)(de)局(ju)部pH值。

溶解氧張(zhang)力可(ke)以例如通(tong)過用空氣或純氧或其混(hun)合(he)物(wu)噴(pen)射來維持。溫度控(kong)制介(jie)質通(tong)常(chang)是水或其他液(ye)體，根據需要加(jia)熱或冷卻。在某些方(fang)面，水可(ke)以通(tong)過圍繞容器的(de)夾套或通(tong)過浸沒在培養物(wu)中的(de)管線圈。

由重(zhong)組細胞產生(sheng)的(de)vWF可以(yi)(yi)根據(ju)本領域已(yi)知(zhi)的(de)各種技術進(jin)行(xing)純(chun)(chun)(chun)化(hua)(hua)和表征。用(yong)于(yu)(yu)進(jin)行(xing)蛋白質(zhi)(zhi)純(chun)(chun)(chun)化(hua)(hua)和分(fen)析(xi)蛋白質(zhi)(zhi)純(chun)(chun)(chun)度的(de)示例(li)性(xing)系(xi)統(tong)包(bao)括(kuo)快速(su)蛋白質(zhi)(zhi)液相色譜(pu)(FPLC)(例(li)如(ru)(ru)(ru)，和Bio-Rad FPLC系(xi)統(tong))、疏(shu)(shu)水相互作(zuo)用(yong)色譜(pu)和高壓液相色譜(pu)(HPLC)。用(yong)于(yu)(yu)純(chun)(chun)(chun)化(hua)(hua)的(de)示例(li)性(xing)化(hua)(hua)學物質(zhi)(zhi)包(bao)括(kuo)離子(zi)交換層析(xi)(例(li)如(ru)(ru)(ru)Q、S)、尺寸排阻色譜(pu)、鹽梯度、親和純(chun)(chun)(chun)化(hua)(hua)(例(li)如(ru)(ru)(ru)Ni、Co、FLAG、麥芽糖、谷胱(guang)甘肽、蛋白A/G)、凝膠過濾、反相、陶瓷離子(zi)交換層析(xi)和疏(shu)(shu)水相互作(zuo)用(yong)柱(HIC)，以(yi)(yi)及(ji)本領域已(yi)知(zhi)的(de)其他內(nei)容。還包(bao)括(kuo)分(fen)析(xi)方法諸如(ru)(ru)(ru)SDS-PAGE(例(li)如(ru)(ru)(ru)考馬(ma)斯、銀(yin)染)、制備性(xing)等(deng)電聚焦(IEF)、免疫(yi)印跡、Bradford、差示溶解度(例(li)如(ru)(ru)(ru)硫酸銨沉淀(dian))和ELISA，其可用(yong)于(yu)(yu)生(sheng)產或純(chun)(chun)(chun)化(hua)(hua)方法的(de)任意步驟過程中，通(tong)常用(yong)于(yu)(yu)測量蛋白質(zhi)(zhi)組合物的(de)純(chun)(chun)(chun)度。

在(zai)某些方(fang)面(mian)，重(zhong)組(zu)vWF可(ke)以進行(xing)多(duo)個(ge)色(se)(se)(se)(se)譜(pu)(pu)(pu)純化步驟，包(bao)括(kuo)親和(he)(he)(he)色(se)(se)(se)(se)譜(pu)(pu)(pu)、離子交換(huan)色(se)(se)(se)(se)譜(pu)(pu)(pu)、疏水相(xiang)互作用色(se)(se)(se)(se)譜(pu)(pu)(pu)、染(ran)料(liao)色(se)(se)(se)(se)譜(pu)(pu)(pu)、羥基磷灰石(shi)色(se)(se)(se)(se)譜(pu)(pu)(pu)、尺寸排(pai)阻色(se)(se)(se)(se)譜(pu)(pu)(pu)和(he)(he)(he)優(you)選(xuan)免疫親和(he)(he)(he)色(se)(se)(se)(se)譜(pu)(pu)(pu)的(de)任何組(zu)合，主要(yao)用于濃縮所(suo)需蛋白(bai)(bai)(bai)(bai)質(zhi)(zhi)并且去除(chu)在(zai)制造、儲存(cun)和(he)(he)(he)/或使用過(guo)程中可(ke)能導致重(zhong)組(zu)蛋白(bai)(bai)(bai)(bai)的(de)斷裂、活化和(he)(he)(he)/或降解的(de)物(wu)質(zhi)(zhi)。優(you)選(xuan)通(tong)過(guo)純化除(chu)去的(de)此類物(wu)質(zhi)(zhi)的(de)示例(li)性實(shi)例(li)包(bao)括(kuo)其它蛋白(bai)(bai)(bai)(bai)質(zhi)(zhi)污染(ran)物(wu)，諸如(ru)(ru)修(xiu)飾(shi)酶如(ru)(ru)PACE/弗林蛋白(bai)(bai)(bai)(bai)酶、VKOR和(he)(he)(he)VKGC；蛋白(bai)(bai)(bai)(bai)質(zhi)(zhi)，諸如(ru)(ru)宿主細胞蛋白(bai)(bai)(bai)(bai)質(zhi)(zhi)，其在(zai)重(zhong)組(zu)蛋白(bai)(bai)(bai)(bai)質(zhi)(zhi)生產過(guo)程中從生產細胞釋放(fang)到組(zu)織培養(yang)基中；非蛋白(bai)(bai)(bai)(bai)質(zhi)(zhi)污染(ran)物(wu)，諸如(ru)(ru)脂質(zhi)(zhi)；和(he)(he)(he)蛋白(bai)(bai)(bai)(bai)質(zhi)(zhi)和(he)(he)(he)非蛋白(bai)(bai)(bai)(bai)質(zhi)(zhi)污染(ran)物(wu)的(de)混合物(wu)，諸如(ru)(ru)脂蛋白(bai)(bai)(bai)(bai)。vWF蛋白(bai)(bai)(bai)(bai)的(de)純化方(fang)法是本領域已(yi)知的(de)(參(can)見例(li)如(ru)(ru)WO 2011/022657)。

為了(le)使(shi)病(bing)毒污染的(de)理論風險最小化，可以在(zai)允許(xu)有(you)效滅活或(huo)(huo)消(xiao)除(chu)病(bing)毒的(de)方法中(zhong)包括額外(wai)的(de)步驟(zou)。此類步驟(zou)包括例如在(zai)液體或(huo)(huo)固體狀態下(xia)的(de)熱處理、用溶劑和/或(huo)(huo)洗滌劑處理、在(zai)可見光(guang)或(huo)(huo)UV光(guang)譜中(zhong)的(de)輻(fu)射、γ-輻(fu)射和納米過(guo)濾(lv)。

藥物組合物

本(ben)發明的(de)(de)(de)(de)實施方案包括蛋(dan)白(bai)質(zhi)并優選vWF蛋(dan)白(bai)質(zhi)，其根據本(ben)文(wen)提供的(de)(de)(de)(de)方法產生(sheng)，并且(qie)配(pei)制于(yu)(yu)藥(yao)學(xue)(xue)上可接受(shou)或(huo)生(sheng)理學(xue)(xue)上可接受(shou)的(de)(de)(de)(de)溶液中用于(yu)(yu)施用于(yu)(yu)細胞或(huo)動物(wu)，單獨或(huo)與一種(zhong)或(huo)多種(zhong)更多其他治療方案組(zu)合。還將(jiang)理解的(de)(de)(de)(de)是，如果需要，本(ben)發明的(de)(de)(de)(de)組(zu)合物(wu)同樣可以與其它試劑組(zu)合施用，諸如例如其它蛋(dan)白(bai)質(zhi)或(huo)多肽(tai)或(huo)各(ge)種(zhong)藥(yao)學(xue)(xue)活性(xing)劑。對于(yu)(yu)也可以包括在(zai)組(zu)合物(wu)中的(de)(de)(de)(de)其它組(zu)分實際上沒有限(xian)制，條件是這些另外的(de)(de)(de)(de)試劑不(bu)會(hui)不(bu)利地影響期望待(dai)實現的(de)(de)(de)(de)調節(jie)或(huo)其他效果。

在本(ben)發明的(de)(de)藥(yao)物組合物中，藥(yao)學上可(ke)接受的(de)(de)賦形(xing)劑和(he)載(zai)體溶液的(de)(de)制劑是本(ben)領域技術人員所公知的(de)(de)，如開發合適的(de)(de)給藥(yao)和(he)治療方(fang)案以(yi)將本(ben)文所述的(de)(de)特定組合物用于各種治療方(fang)案包括(kuo)例(li)如口(kou)服、腸胃(wei)外、靜脈內(nei)、鼻內(nei)、皮下和(he)肌(ji)肉內(nei)施(shi)用和(he)配(pei)制。

在(zai)(zai)(zai)(zai)某些應用中，本發明的(de)藥(yao)(yao)物(wu)(wu)或治療(liao)組(zu)合(he)(he)物(wu)(wu)不(bu)刺(ci)激免疫反應。在(zai)(zai)(zai)(zai)一些方面，包含蛋白質的(de)藥(yao)(yao)物(wu)(wu)組(zu)合(he)(he)物(wu)(wu)可(ke)(ke)以配制(zhi)(zhi)成穩(wen)定的(de)液(ye)體形式。在(zai)(zai)(zai)(zai)其(qi)它方面，藥(yao)(yao)物(wu)(wu)組(zu)合(he)(he)物(wu)(wu)可(ke)(ke)以配制(zhi)(zhi)成凍(dong)干形式；蛋白質可(ke)(ke)以通過本領域已知的(de)各種方法(fa)凍(dong)干。凍(dong)干制(zhi)(zhi)劑通常通過加入(ru)一種或多種藥(yao)(yao)學上(shang)可(ke)(ke)接受的(de)稀釋劑諸如注射用無菌水(shui)或無菌生理鹽(yan)水(shui)溶(rong)液(ye)在(zai)(zai)(zai)(zai)使用前重構。

在某些實(shi)施(shi)方案中(zhong)，蛋白(bai)質具有對(dui)于特定施(shi)用(yong)模(mo)式(諸(zhu)如靜脈內施(shi)用(yong))所(suo)需(xu)的(de)溶(rong)解度。所(suo)需(xu)的(de)溶(rong)解度的(de)實(shi)例(li)包(bao)括至(zhi)(zhi)少(shao)約1mg/ml、至(zhi)(zhi)少(shao)約10mg/ml、，至(zhi)(zhi)少(shao)約25mg/ml和至(zhi)(zhi)少(shao)約50mg/ml。

在某(mou)些情況下，需要(yao)腸胃外、皮(pi)下、靜(jing)脈內、肌內、動(dong)脈內、鞘內、實(shi)質內(intraparenchymally)、腦室內(intraventricularly)、尿道內、胸骨內、顱內、滑膜內或甚至腹膜內遞送本文公(gong)開的藥物組合(he)(he)物。用于(yu)胃腸外施用的合(he)(he)適的裝置包括針(包括微(wei)針)注(zhu)射(she)器、無針注(zhu)射(she)器和輸注(zhu)技(ji)術。

對(dui)于在水溶液(ye)中(zhong)的腸(chang)胃外給藥，例如，如果需要，應該適當地緩(huan)沖溶液(ye)，并且首先(xian)用(yong)足夠的鹽水或葡萄糖使液(ye)體稀釋劑等滲。這(zhe)些特(te)定的水溶液(ye)特(te)別適用(yong)于靜(jing)脈內(nei)、肌內(nei)、皮下和腹(fu)膜內(nei)施用(yong)。

無菌(jun)注(zhu)射溶(rong)液(ye)可(ke)以通(tong)(tong)過將所需(xu)(xu)量(liang)的(de)(de)活(huo)性化合物摻入合適的(de)(de)溶(rong)劑(ji)中，根據需(xu)(xu)要與上(shang)(shang)述各種其(qi)它成(cheng)(cheng)分(fen)(fen)混合，然后過濾(lv)滅(mie)(mie)菌(jun)來制(zhi)備。通(tong)(tong)常(chang)，通(tong)(tong)過將各種滅(mie)(mie)菌(jun)的(de)(de)活(huo)性成(cheng)(cheng)分(fen)(fen)摻入無菌(jun)載劑(ji)中制(zhi)備分(fen)(fen)散體，所述無菌(jun)載劑(ji)含有(you)基本分(fen)(fen)散介質和(he)來自(zi)上(shang)(shang)面列舉的(de)(de)那些的(de)(de)所需(xu)(xu)其(qi)它成(cheng)(cheng)分(fen)(fen)。在用于(yu)制(zhi)備無菌(jun)注(zhu)射溶(rong)液(ye)的(de)(de)無菌(jun)粉末的(de)(de)情況下，優選(xuan)的(de)(de)制(zhi)備方法是真空干燥和(he)冷凍干燥技術，其(qi)從其(qi)先(xian)前無菌(jun)過濾(lv)的(de)(de)溶(rong)液(ye)得到(dao)活(huo)性成(cheng)(cheng)分(fen)(fen)的(de)(de)粉末加上(shang)(shang)任何額(e)外的(de)(de)所需(xu)(xu)成(cheng)(cheng)分(fen)(fen)。

本(ben)文公開的組合物可以(yi)(yi)配(pei)制成中性或鹽形式。藥(yao)學上可接受的鹽包(bao)括酸(suan)加成鹽(與蛋白質(zhi)的游離氨(an)基(ji)形成)，并且其是(shi)與無(wu)機酸(suan)(諸(zhu)如(ru)(ru)例(li)如(ru)(ru)鹽酸(suan)或磷酸(suan))或有(you)機酸(suan)(諸(zhu)如(ru)(ru)乙酸(suan)、草(cao)酸(suan)、酒石酸(suan)、扁桃酸(suan)等)形成的。與游離羧(suo)基(ji)形成的鹽也可以(yi)(yi)衍生自無(wu)機堿(諸(zhu)如(ru)(ru)例(li)如(ru)(ru)氫氧(yang)化鈉、氫氧(yang)化鉀、氫氧(yang)化銨、氫氧(yang)化鈣或氫氧(yang)化鐵(tie))，以(yi)(yi)及(ji)有(you)機堿(諸(zhu)如(ru)(ru)異丙胺、三甲胺、組氨(an)酸(suan)、普(pu)魯卡因等)。在配(pei)制時，將(jiang)以(yi)(yi)與劑(ji)量(liang)制劑(ji)相容(rong)的方式和以(yi)(yi)治療(liao)有(you)效的量(liang)施用溶(rong)液(ye)。制劑(ji)容(rong)易(yi)以(yi)(yi)各種劑(ji)型施用，例(li)如(ru)(ru)注射溶(rong)液(ye)、藥(yao)物釋(shi)放膠囊等。

如本文所用(yong)，“載(zai)(zai)體”包括任何(he)和(he)所有溶劑(ji)(ji)、分(fen)散介質、載(zai)(zai)劑(ji)(ji)、包衣(yi)、稀釋(shi)劑(ji)(ji)、抗細菌劑(ji)(ji)和(he)抗真菌劑(ji)(ji)、等滲和(he)吸(xi)收延遲劑(ji)(ji)、緩(huan)沖劑(ji)(ji)、載(zai)(zai)體溶液、懸浮液、膠(jiao)體等。此類(lei)介質和(he)試劑(ji)(ji)用(yong)于(yu)藥物活性物質的用(yong)途是(shi)本領(ling)域公知的。除非在任何(he)常規介質或試劑(ji)(ji)與(yu)活性成分(fen)不相容的情況下，否則考慮(lv)其在治療(liao)組合物中(zhong)的用(yong)途。補充的活性成分(fen)也可以摻入組合物中(zhong)。

短(duan)語“藥學上可接(jie)受的(de)”是(shi)指當施用于人時不產生過敏或類(lei)似(si)的(de)不良反應的(de)分子實體和組(zu)合物(wu)。含有蛋白質作為活性成分的(de)水性組(zu)合物(wu)的(de)制備在(zai)本領域是(shi)眾所周知的(de)。

通常，將這樣的(de)組合物制備(bei)為(wei)可(ke)注射的(de)，作為(wei)液(ye)體(ti)溶液(ye)或(huo)懸浮(fu)液(ye)；也可(ke)以制備(bei)適于在注射前溶解(jie)或(huo)懸浮(fu)在液(ye)體(ti)中的(de)固體(ti)形式。制劑也可(ke)以乳(ru)化。

藥(yao)物(wu)(wu)組合(he)物(wu)(wu)可(ke)以配制成(cheng)立即和/或持續釋放(fang)。持續釋放(fang)組合(he)物(wu)(wu)包括(kuo)延遲的(de)、修飾(shi)的(de)、脈沖(chong)的(de)、受控的(de)、靶向的(de)和程序性的(de)釋放(fang)。

配制方(fang)法是本領(ling)域公(gong)知的。本文提供(gong)的重組(zu)蛋白可相(xiang)應地施(shi)用于(yu)任何治療有(you)(you)(you)效(xiao)的給藥方(fang)案。可以(yi)(yi)選擇劑量和(he)頻率以(yi)(yi)產生有(you)(you)(you)效(xiao)量的蛋白質并(bing)使有(you)(you)(you)害作用最小(xiao)化。有(you)(you)(you)效(xiao)量將取決各種因素，包括施(shi)用途徑、所(suo)治療的受試(shi)者的類型和(he)所(suo)考(kao)慮(lv)的受試(shi)者的身體特征(諸如體重、飲食)、同時(shi)給藥和(he)醫學領(ling)域將認可的其他因素。

vWF的制劑已經描述于例如WO 2010/048275中(zhong)。

在本說明書中引(yin)用的所有(you)出版(ban)物、專利(li)申請和(he)授(shou)權(quan)專利(li)通(tong)過(guo)引(yin)用并(bing)入，如同每個單獨的出版(ban)物、專利(li)申請或(huo)授(shou)權(quan)專利(li)被具體(ti)地和(he)單獨地指示通(tong)過(guo)引(yin)用并(bing)入。

盡(jin)管為了清楚理解的(de)(de)目(mu)的(de)(de)通過說明(ming)(ming)和實施(shi)例相當詳細(xi)地描述了前述發明(ming)(ming)，但是根據本發明(ming)(ming)的(de)(de)教(jiao)導(dao)，本領域(yu)普通技術(shu)人員將(jiang)容易明(ming)(ming)白，某些改(gai)變和修改(gai)可以在不脫離(li)所附權利要求書(shu)的(de)(de)精(jing)神(shen)或(huo)范圍的(de)(de)情況下。提供以下實施(shi)例僅作為說明(ming)(ming)而不是限(xian)制。本領域(yu)技術(shu)人員將(jiang)容易地認(ren)識到(dao)可以改(gai)變或(huo)修改(gai)以得到(dao)基本相似的(de)(de)結果的(de)(de)各種(zhong)非關鍵參數。

實施例

使用(yong)Sartorius Biostat B-DCU Controller進行所(suo)有(you)發(fa)酵以將pH控制在(zai)7.0，DO在(zai)30％空氣(qi)飽和，溫(wen)度和150rpm的攪拌器(qi)速度。該方法(fa)在(zai)具有(you)5L工作體積(ji)的Sartorius B容器(qi)中進行。在(zai)反(fan)應器(qi)接(jie)種(zhong)后，在(zai)37℃下進行生長(chang)期，然后在(zai)33℃下進行生產期。所(suo)有(you)方法(fa)都用(yong)相同的表達在(zai)其C末端與人野(ye)生型全長(chang)白(bai)蛋白(bai)融合(he)的野(ye)生型全長(chang)vWF的CHO細胞(bao)系進行。如WO 2009/156137中所(suo)述獲得細胞(bao)系。

實施(shi)例(li)1(分批方法，比較例(li))

以4.4×10⁵個細胞/mL的細胞密度開始用CSL-DBM-PFCDM-培養基(SAFC)運行的分批方法。7天后，達到6.9×10⁶個細胞(bao)/mL的細胞(bao)密度(du)。每天對生物反應器進行(xing)取樣，并測定(ding)樣品(pin)的vWF活性(xing)(vWF:RCoF)和(he)抗原(yuan)(vWF:Ag)。從這些測量計算vWF:RCoF/vWF:Ag的比率。圖(tu)1顯(xian)示在(zai)約第2天達到峰值水平后該比值略有降低。

實施例(li)2(本發明的方法)

截留模塊，ATF 4(Refine Technology)以3L/min的排氣流速和3L/min的壓力流速操作。使用獲自GE Healthcare Life Sciences的以ATF流動模式操作的750kDa截留分子量(MWCO)中空纖維膜來富集生物反應器中的高分子量(HMW)vWF，并降低生物反應器中的低分子量(LMW)vWF。在生長期期間使用基于CD CHO(Gibco)的培養基并且其也作為進料培養基。以5×10⁵個細胞/mL開始培養。在4天的生長期(數據未顯示)后，以每天罐容積的約100％的滲透物收獲率開始ATF。此時，生物反應器中的細胞密度為3.8×10⁶個細胞/mL。當細胞密度達到7×10⁶個細胞/mL時，將溫度(du)從(cong)37℃變為(wei)用于生產期的(de)33℃。

每天對(dui)生物(wu)反應器和滲透(tou)物(wu)進行取樣，并測(ce)定vWF利托菌素輔因子活(huo)性(vWF:RCoF)和vWF抗原(vWF:Ag)。從這些測(ce)量計(ji)算vWF:RCoF/vWF:Ag的(de)比(bi)率(lv)。顯示由于去除(chu)了LMW vWF，滲余(yu)物(wu)(生物(wu)反應器)中vWF:RCoF/vWF:Ag的(de)比(bi)率(lv)正在升高，而(er)由于去除(chu)了HMW vWF，滲透(tou)物(wu)中vWF:RCoF/vWF:Ag的(de)比(bi)率(lv)正在降低(di)(圖2)。

在(zai)第4天進(jin)行了根(gen)據(ju)Ott等(deng)(deng)人(ren)(ren)(ren)(Am J Clin Pathol 2010；133：322-330)的(de)(de)(de)(de)vWF多(duo)聚體分(fen)析(xi)(多(duo)聚體電泳)，以顯示(shi)在(zai)滲(shen)(shen)(shen)余物(生(sheng)物反應(ying)器)中(zhong)高分(fen)子量vWF的(de)(de)(de)(de)富集(ji)以及(ji)在(zai)滲(shen)(shen)(shen)透物中(zhong)分(fen)離和(he)(he)去除(chu)低(di)分(fen)子量vWF。除(chu)了滲(shen)(shen)(shen)余物和(he)(he)滲(shen)(shen)(shen)透物的(de)(de)(de)(de)樣品(pin)的(de)(de)(de)(de)多(duo)聚體分(fen)析(xi)之外(wai)，根(gen)據(ju)Ott等(deng)(deng)人(ren)(ren)(ren)(Am J Clin Pathol 2010；133：322-330)進(jin)行了標(biao)準(zhun)人(ren)(ren)(ren)血漿(SHP)(Siemens，標(biao)準(zhun)人(ren)(ren)(ren)血漿，ORKL17)樣品(pin)的(de)(de)(de)(de)多(duo)聚體分(fen)析(xi)，并且在(zai)每(mei)個(ge)單獨(du)的(de)(de)(de)(de)印跡(ji)中(zhong)用作參考。然后通過(guo)將(jiang)各個(ge)樣本中(zhong)的(de)(de)(de)(de)帶段1-5、6-10和(he)(he)≥11的(de)(de)(de)(de)像(xiang)素(su)強(qiang)度分(fen)別(bie)除(chu)以標(biao)準(zhun)人(ren)(ren)(ren)血漿中(zhong)相應(ying)帶段的(de)(de)(de)(de)平均像(xiang)素(su)強(qiang)度來計算“相對于標(biao)準(zhun)人(ren)(ren)(ren)血漿的(de)(de)(de)(de)累積(ji)(ji)像(xiang)素(su)強(qiang)度”，其中(zhong)兩個(ge)單獨(du)的(de)(de)(de)(de)累積(ji)(ji)像(xiang)素(su)強(qiang)度根(gen)據(ju)Ott等(deng)(deng)人(ren)(ren)(ren)(Am J Clin Pathol 2010；133：322-330)進(jin)行測定(表2，圖3)。

表2(vWF多聚體分析)：

實(shi)施例3(本發明的方法)

截留模塊，ATF 4(Refine Technology)以3L/min的排氣流速和3L/min的壓力流速操作。使用獲自GE Healthcare Life Sciences的以ATF流動模式操作的750kDa截留分子量(MWCO)中空纖維膜來富集生物反應器中的HMW vWF并降低生物反應器中的LMW vFW。基于PowerCHO-3的細胞培養基(Lonza)用于整個過程。以4×10⁵個細胞/mL開始培養。在3天的生長期(數據未顯示)后，以每天罐容積的約100％的滲透物收獲率開始ATF。此時，生物反應器中的細胞密度為1.4×10⁶個細胞/mL。當細胞密度達到1.7×10⁶個細胞/mL時，將溫度從37℃變為用于生產期的33℃。

每天對生(sheng)物(wu)反應器和滲透(tou)物(wu)進行(xing)取樣，如實施(shi)例1所(suo)述(shu)測定活性(vWF:RCoF)和抗(kang)原(vWF:Ag)。從這些(xie)測量計算vWF:RCoF/vWF:Ag的比(bi)率。顯示由(you)于去除(chu)了(le)LMW vWF，滲余物(wu)(生(sheng)物(wu)反應器)中vWF:RCoF/vWF:Ag的比(bi)率正在升(sheng)高，而由(you)于去除(chu)了(le)HMW vWF，滲透(tou)物(wu)中的比(bi)率vWF:RCoF/vWF:Ag正在降低(圖4)。

在該過程結(jie)束時，進(jin)行多(duo)聚體電(dian)泳以顯示高分子(zi)量(liang)(liang)vWF在生(sheng)物反應器中的(de)積累(lei)和低分子(zi)量(liang)(liang)vWF與滲透(tou)物的(de)分離/去除。如上(shang)計算(suan)相對于標準(zhun)人血漿(jiang)的(de)累(lei)積像(xiang)素強度。

在(zai)第9天進(jin)行(xing)了(le)根(gen)據Ott等人(Am J Clin Pathol 2010；133：322-330)的(de)vWF多(duo)聚體分(fen)(fen)析(多(duo)聚體電(dian)泳)，以顯示(shi)在(zai)滲(shen)(shen)余物(生物反應器)中(zhong)高分(fen)(fen)子量vWF的(de)富集以及在(zai)滲(shen)(shen)透物中(zhong)分(fen)(fen)離和(he)(he)去除低(di)分(fen)(fen)子量vWF。除了(le)滲(shen)(shen)余物和(he)(he)滲(shen)(shen)透物的(de)樣(yang)品的(de)多(duo)聚體分(fen)(fen)析之外，根(gen)據Ott等人(Am J Clin Pathol 2010；133：322-330)進(jin)行(xing)標(biao)準(zhun)人血(xue)漿(jiang)(SHP)(Siemens，標(biao)準(zhun)人血(xue)漿(jiang)，ORKL17)樣(yang)品的(de)多(duo)聚體分(fen)(fen)析，并(bing)且在(zai)每(mei)個單獨的(de)印跡中(zhong)用作參考。然后如實(shi)施例2中(zhong)所述計算“相(xiang)對(dui)于(yu)標(biao)準(zhun)人血(xue)漿(jiang)的(de)累(lei)積(ji)像素強度”(表3，圖5)。

表(biao)3(vWF多聚(ju)體(ti)分析(xi))：

實施例4

本發明的另(ling)一(yi)方面是一(yi)種(zhong)方法，其中(zhong)使用另(ling)外的分(fen)離(li)(li)裝置(zhi)從生(sheng)物(wu)反(fan)應器(qi)中(zhong)直(zhi)接收(shou)獲(huo)如在(zai)實(shi)(shi)施例2和(he)3中(zhong)的任一(yi)個中(zhong)獲(huo)得的滲(shen)余物(wu)。在(zai)這種(zhong)情況下，分(fen)離(li)(li)裝置(zhi)可以(yi)是將細胞與滲(shen)余物(wu)分(fen)離(li)(li)的任何分(fen)離(li)(li)裝置(zhi)，其不進一(yi)步將LMW vWF多聚體與HMW vWF多聚體分(fen)離(li)(li)。生(sheng)物(wu)反(fan)應器(qi)條件和(he)培(pei)養基(ji)如前述(shu)實(shi)(shi)施例中(zhong)所述(shu)。

作(zuo)為此類發酵方法的結果，獲得富(fu)含HMW vWF多聚體的vWF制(zhi)劑，并(bing)且(qie)減(jian)少了在(zai)生(sheng)物反(fan)應器(qi)中的停留時間。此外，這種方法不(bu)(bu)受加工時間的限制(zhi)，因為不(bu)(bu)發生(sheng)vWF多聚體的積累。

實施例5

本(ben)發明的另(ling)(ling)一(yi)(yi)方(fang)面是一(yi)(yi)種方(fang)法，其(qi)(qi)中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)如在實施例(li)2和3中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)的任一(yi)(yi)個中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)獲(huo)得的滲(shen)余物然(ran)后另(ling)(ling)外進(jin)行第(di)二次(ci)分離(li)，其(qi)(qi)中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)超大(da)vWF多(duo)聚(ju)體(ti)(ti)(ULMW vWF多(duo)聚(ju)體(ti)(ti))在滲(shen)余物中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)富集，提(ti)供第(di)二滲(shen)透物，所(suo)(suo)述(shu)第(di)二滲(shen)透物中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)總vWF多(duo)聚(ju)體(ti)(ti)量(liang)(liang)中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)超大(da)vWF多(duo)聚(ju)體(ti)(ti)的比(bi)例(li)與在所(suo)(suo)述(shu)第(di)二次(ci)分離(li)之前(qian)所(suo)(suo)述(shu)滲(shen)余物中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)總vWF多(duo)聚(ju)體(ti)(ti)量(liang)(liang)中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)超大(da)vWF多(duo)聚(ju)體(ti)(ti)的比(bi)例(li)相(xiang)比(bi)降低(di)。生物反應(ying)器(qi)(qi)條件和培養(yang)基(ji)如前(qian)述(shu)實施例(li)中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)所(suo)(suo)述(shu)。第(di)二ATF系統連接到生物反應(ying)器(qi)(qi)(圖6)，其(qi)(qi)裝配有MWCO約(yue)為(wei)10,000,000Da或0.1μm的中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)空纖維(wei)膜。通過(guo)以20-200％的罐體(ti)(ti)積的流量(liang)(liang)收獲(huo)第(di)二分離(li)系統的滲(shen)透物，除去ULMW vWF多(duo)聚(ju)體(ti)(ti)。

作為此(ci)類發(fa)酵的(de)(de)結果，包括第一次分離(li)，導致(zhi)vWF的(de)(de)HMW多(duo)聚(ju)體的(de)(de)富(fu)集，第二(er)次分離(li)，導致(zhi)HMW多(duo)聚(ju)體從ULMW vWF多(duo)聚(ju)體中(zhong)耗盡，在(zai)第二(er)次分離(li)的(de)(de)滲透(tou)物(wu)中(zhong)產生VWF制劑，其耗盡了LMW vWF多(duo)聚(ju)體和ULMW vWF多(duo)聚(ju)體二(er)者，然后在(zai)初級止血中(zhong)均(jun)具有高活性(xing)，但是避免了由于ULMW vWF多(duo)聚(ju)體的(de)(de)存在(zai)而(er)可(ke)能的(de)(de)不利影響。

兩次分離可以平行(xing)或順序進行(xing)。

實施(shi)例6(本發明的方法)

使用Sartorius Biostat B-DCU Controller進(jin)(jin)行發酵以將pH控制(zhi)在7.0，DO在30％空氣飽和，溫度和150rpm的(de)攪拌器(qi)速度。該方法在具有5L工作體積的(de)Sartorius B容(rong)器(qi)中進(jin)(jin)行。

在(zai)反應器接種(zhong)后(hou)，在(zai)37℃進行(xing)(xing)生(sheng)長期，隨(sui)后(hou)在(zai)33.5℃下進行(xing)(xing)生(sheng)產期。該方法(fa)用(yong)表達(da)野(ye)生(sheng)型全(quan)長vWF(NCBI序列(lie)NP_000543)的CHO細(xi)(xi)胞系進行(xing)(xing)。如WO 2009/156137中所述獲得細(xi)(xi)胞系。

截留(liu)模(mo)塊，ATF 4(Refine Technology)以(yi)3L/min的(de)排氣(qi)流速(su)和3L/min的(de)壓力流速(su)操作。使用獲自GE Healthcare Life Sciences的(de)以(yi)ATF流動(dong)模(mo)式(shi)操作的(de)750kDa截留(liu)分(fen)子量(liang)(MWCO)中空纖維膜來富集生(sheng)物(wu)反(fan)應器中的(de)高分(fen)子量(liang)(HMW)vWF，并降低生(sheng)物(wu)反(fan)應器中的(de)低分(fen)子量(liang)(LMW)vWF。

在生長期期間使用基于CD CHO(Gibco)的培養基并且其也作為進料培養基。以7.6×10⁵個細胞/mL開(kai)始培養。

在1天的生長期(數據未顯示)后，以每天罐體積的約100％的滲透物收獲率開始ATF。此外，將溫度從37℃變為用于整個生產期的33.5℃。此時，生物反應器中的細胞密度為10.9×10⁵個細胞/mL。在第7天，細胞密度達到70.0×10⁵個細胞/mL。

每天對(dui)生物(wu)反應器和滲(shen)透物(wu)進行取樣(yang)，并測(ce)定vWF利托菌(jun)素輔因子(zi)活性(vWF:RCoF)和vWF抗原(yuan)(vWF:Ag)。從(cong)這些測(ce)量計算vWF:RCoF/vWF:Ag的比(bi)率(lv)。顯(xian)示由(you)于(yu)去除了LMW vWF，滲(shen)余物(wu)(生物(wu)反應器)中(zhong)vWF:RCoF/vWF:Ag的比(bi)率(lv)正在升高，而由(you)于(yu)去除了HMW vWF，滲(shen)透物(wu)中(zhong)vWF:RCoF/vWF:Ag的比(bi)率(lv)正在降低(圖9)。

在第7天進(jin)行(xing)了根(gen)據(ju)(ju)Ott等(deng)人(ren)(ren)(Am J Clin Pathol 2010；133：322-330)的(de)vWF多(duo)聚體(ti)分(fen)(fen)析(xi)(多(duo)聚體(ti)電(dian)泳)，以(yi)顯(xian)示(shi)在滲余物(wu)(wu)(wu)(生物(wu)(wu)(wu)反應(ying)器)中(zhong)(zhong)高(gao)分(fen)(fen)子(zi)量vWF的(de)富集以(yi)及(ji)在滲透物(wu)(wu)(wu)中(zhong)(zhong)分(fen)(fen)離(li)和(he)(he)去除低分(fen)(fen)子(zi)量vWF。除了滲余物(wu)(wu)(wu)和(he)(he)滲透物(wu)(wu)(wu)的(de)樣(yang)(yang)品(pin)的(de)多(duo)聚體(ti)分(fen)(fen)析(xi)之(zhi)外，根(gen)據(ju)(ju)Ott等(deng)人(ren)(ren)(Am J Clin Pathol 2010；133：322-330)進(jin)行(xing)標(biao)準人(ren)(ren)血漿(jiang)(SHP)(Siemens，標(biao)準人(ren)(ren)血漿(jiang)，ORKL17)樣(yang)(yang)品(pin)的(de)多(duo)聚體(ti)分(fen)(fen)析(xi)，并且(qie)在每個單(dan)(dan)獨的(de)印跡中(zhong)(zhong)用作參考。然(ran)后通過將各個樣(yang)(yang)本中(zhong)(zhong)的(de)帶段1-5、6-10和(he)(he)≥11的(de)像(xiang)素(su)強度(du)分(fen)(fen)別除以(yi)標(biao)準人(ren)(ren)血漿(jiang)中(zhong)(zhong)相應(ying)帶段的(de)平均像(xiang)素(su)強度(du)來計算(suan)“相對于標(biao)準人(ren)(ren)血漿(jiang)的(de)累積像(xiang)素(su)強度(du)”，其(qi)中(zhong)(zhong)兩個單(dan)(dan)獨的(de)累積像(xiang)素(su)強度(du)根(gen)據(ju)(ju)Ott等(deng)人(ren)(ren)(Am J Clin Pathol 2010；133：322-330)進(jin)行(xing)測定(表4，圖8)。

表4(vWF多聚體分析)：

序列表

<110> CSL Ltd.

<120> 生(sheng)物反應器中重組von Willebrand因(yin)子的改進生(sheng)產

<130> 2014_P002_A227

<150> EP 14172338.7

<151> 2014-06-13

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 8442

<212> DNA

<213> 智人

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(8442)

<400> 1

atg att cct gcc aga ttt gcc ggg gtg ctg ctt gct ctg gcc ctc att 48

Met Ile Pro Ala Arg Phe Ala Gly Val Leu Leu Ala Leu Ala Leu Ile

1 5 10 15

ttg cca ggg acc ctt tgt gca gaa gga act cgc ggc agg tca tcc acg 96

Leu Pro Gly Thr Leu Cys Ala Glu Gly Thr Arg Gly Arg Ser Ser Thr

 20 25 30

gcc cga tgc agc ctt ttc gga agt gac ttc gtc aac acc ttt gat ggg 144

Ala Arg Cys Ser Leu Phe Gly Ser Asp Phe Val Asn Thr Phe Asp Gly

35 40 45

agc atg tac agc ttt gcg gga tac tgc agt tac ctc ctg gca ggg ggc 192

Ser Met Tyr Ser Phe Ala Gly Tyr Cys Ser Tyr Leu Leu Ala Gly Gly

50 55 60

tgc cag aaa cgc tcc ttc tcg att att ggg gac ttc cag aat ggc aag 240

Cys Gln Lys Arg Ser Phe Ser Ile Ile Gly Asp Phe Gln Asn Gly Lys

65 70  75 80

aga gtg agc ctc tcc gtg tat ctt ggg gaa ttt ttt gac atc cat ttg 288

Arg Val Ser Leu Ser Val Tyr Leu Gly Glu Phe Phe Asp Ile His Leu

85  90  95

ttt gtc aat ggt acc gtg aca cag ggg gac caa aga gtc tcc atg ccc 336

Phe Val Asn Gly Thr Val Thr Gln Gly Asp Gln Arg Val Ser Met Pro

100 105  110

tat gcc tcc aaa ggg ctg tat cta gaa act gag gct ggg tac tac aag 384

Tyr Ala Ser Lys Gly Leu Tyr Leu Glu Thr Glu Ala Gly Tyr Tyr Lys

 115 120  125

ctg tcc ggt gag gcc tat ggc ttt gtg gcc agg atc gat ggc agc ggc 432

Leu Ser Gly Glu Ala Tyr Gly Phe Val Ala Arg Ile Asp Gly Ser Gly

130 135 140

aac ttt caa gtc ctg ctg tca gac aga tac ttc aac aag acc tgc ggg 480

Asn Phe Gln Val Leu Leu Ser Asp Arg Tyr Phe Asn Lys Thr Cys Gly

145 150  155 160

ctg tgt ggc aac ttt aac atc ttt gct gaa gat gac ttt atg acc caa 528

Leu Cys Gly Asn Phe Asn Ile Phe Ala Glu Asp Asp Phe Met Thr Gln

 165 170 175

gaa ggg acc ttg acc tcg gac cct tat gac ttt gcc aac tca tgg gct 576

Glu Gly Thr Leu Thr Ser Asp Pro Tyr Asp Phe Ala Asn Ser Trp Ala

180 185 190

ctg agc agt gga gaa cag tgg tgt gaa cgg gca tct cct ccc agc agc 624

Leu Ser Ser Gly Glu Gln Trp Cys Glu Arg Ala Ser Pro Pro Ser Ser

195 200  205

tca tgc aac atc tcc tct ggg gaa atg cag aag ggc ctg tgg gag cag 672

Ser Cys Asn Ile Ser Ser Gly Glu Met Gln Lys Gly Leu Trp Glu Gln

210 215 220

tgc cag ctt ctg aag agc acc tcg gtg ttt gcc cgc tgc cac cct ctg 720

Cys Gln Leu Leu Lys Ser Thr Ser Val Phe Ala Arg Cys His Pro Leu

225  230 235  240

gtg gac ccc gag cct ttt gtg gcc ctg tgt gag aag act ttg tgt gag 768

Val Asp Pro Glu Pro Phe Val Ala Leu Cys Glu Lys Thr Leu Cys Glu

245  250 255

tgt gct ggg ggg ctg gag tgc gcc tgc cct gcc ctc ctg gag tac gcc 816

Cys Ala Gly Gly Leu Glu Cys Ala Cys Pro Ala Leu Leu Glu Tyr Ala

260 265  270

cgg acc tgt gcc cag gag gga atg gtg ctg tac ggc tgg acc gac cac 864

Arg Thr Cys Ala Gln Glu Gly Met Val Leu Tyr Gly Trp Thr Asp His

275  280 285

agc gcg tgc agc cca gtg tgc cct gct ggt atg gag tat agg cag tgt 912

Ser Ala Cys Ser Pro Val Cys Pro Ala Gly Met Glu Tyr Arg Gln Cys

290 295 300

gtg tcc cct tgc gcc agg acc tgc cag agc ctg cac atc aat gaa atg 960

Val Ser Pro Cys Ala Arg Thr Cys Gln Ser Leu His Ile Asn Glu Met

305 310  315 320

tgt cag gag cga tgc gtg gat ggc tgc agc tgc cct gag gga cag ctc 1008

Cys Gln Glu Arg Cys Val Asp Gly Cys Ser Cys Pro Glu Gly Gln Leu

325 330  335

ctg gat gaa ggc ctc tgc gtg gag agc acc gag tgt ccc tgc gtg cat 1056

Leu Asp Glu Gly Leu Cys Val Glu Ser Thr Glu Cys Pro Cys Val His

340 345  350

tcc gga aag cgc tac cct ccc ggc acc tcc ctc tct cga gac tgc aac 1104

Ser Gly Lys Arg Tyr Pro Pro Gly Thr Ser Leu Ser Arg Asp Cys Asn

 355 360 365

acc tgc att tgc cga aac agc cag tgg atc tgc agc aat gaa gaa tgt 1152

Thr Cys Ile Cys Arg Asn Ser Gln Trp Ile Cys Ser Asn Glu Glu Cys

370 375 380

cca ggg gag tgc ctt gtc aca ggt caa tca cac ttc aag agc ttt gac 1200

Pro Gly Glu Cys Leu Val Thr Gly Gln Ser His Phe Lys Ser Phe Asp

385 390 395 400

aac aga tac ttc acc ttc agt ggg atc tgc cag tac ctg ctg gcc cgg 1248

Asn Arg Tyr Phe Thr Phe Ser Gly Ile Cys Gln Tyr Leu Leu Ala Arg

405  410 415

gat tgc cag gac cac tcc ttc tcc att gtc att gag act gtc cag tgt 1296

Asp Cys Gln Asp His Ser Phe Ser Ile Val Ile Glu Thr Val Gln Cys

 420 425 430

gct gat gac cgc gac gct gtg tgc acc cgc tcc gtc acc gtc cgg ctg 1344

Ala Asp Asp Arg Asp Ala Val Cys Thr Arg Ser Val Thr Val Arg Leu

435 440  445

cct ggc ctg cac aac agc ctt gtg aaa ctg aag cat ggg gca gga gtt 1392

Pro Gly Leu His Asn Ser Leu Val Lys Leu Lys His Gly Ala Gly Val

450 455 460

gcc atg gat ggc cag gac gtc cag ctc ccc ctc ctg aaa ggt gac ctc 1440

Ala Met Asp Gly Gln Asp Val Gln Leu Pro Leu Leu Lys Gly Asp Leu

465 470 475 480

cgc atc cag cat aca gtg acg gcc tcc gtg cgc ctc agc tac ggg gag 1488

Arg Ile Gln His Thr Val Thr Ala Ser Val Arg Leu Ser Tyr Gly Glu

 485 490  495

gac ctg cag atg gac tgg gat ggc cgc ggg agg ctg ctg gtg aag ctg 1536

Asp Leu Gln Met Asp Trp Asp Gly Arg Gly Arg Leu Leu Val Lys Leu

 500 505 510

tcc ccc gtc tat gcc ggg aag acc tgc ggc ctg tgt ggg aat tac aat 1584

Ser Pro Val Tyr Ala Gly Lys Thr Cys Gly Leu Cys Gly Asn Tyr Asn

515  520 525

ggc aac cag ggc gac gac ttc ctt acc ccc tct ggg ctg gcg gag ccc 1632

Gly Asn Gln Gly Asp Asp Phe Leu Thr Pro Ser Gly Leu Ala Glu Pro

530 535 540

cgg gtg gag gac ttc ggg aac gcc tgg aag ctg cac ggg gac tgc cag 1680

Arg Val Glu Asp Phe Gly Asn Ala Trp Lys Leu His Gly Asp Cys Gln

545 550 555   560

gac ctg cag aag cag cac agc gat ccc tgc gcc ctc aac ccg cgc atg 1728

Asp Leu Gln Lys Gln His Ser Asp Pro Cys Ala Leu Asn Pro Arg Met

565 570   575

acc agg ttc tcc gag gag gcg tgc gcg gtc ctg acg tcc ccc aca ttc 1776

Thr Arg Phe Ser Glu Glu Ala Cys Ala Val Leu Thr Ser Pro Thr Phe

580 585  590

gag gcc tgc cat cgt gcc gtc agc ccg ctg ccc tac ctg cgg aac tgc 1824

Glu Ala Cys His Arg Ala Val Ser Pro Leu Pro Tyr Leu Arg Asn Cys

595  600  605

cgc tac gac gtg tgc tcc tgc tcg gac ggc cgc gag tgc ctg tgc ggc 1872

Arg Tyr Asp Val Cys Ser Cys Ser Asp Gly Arg Glu Cys Leu Cys Gly

610 615 620

gcc ctg gcc agc tat gcc gcg gcc tgc gcg ggg aga ggc gtg cgc gtc 1920

Ala Leu Ala Ser Tyr Ala Ala Ala Cys Ala Gly Arg Gly Val Arg Val

625  630 635 640

gcg tgg cgc gag cca ggc cgc tgt gag ctg aac tgc ccg aaa ggc cag 1968

Ala Trp Arg Glu Pro Gly Arg Cys Glu Leu Asn Cys Pro Lys Gly Gln

645 650  655

gtg tac ctg cag tgc ggg acc ccc tgc aac ctg acc tgc cgc tct ctc 2016

Val Tyr Leu Gln Cys Gly Thr Pro Cys Asn Leu Thr Cys Arg Ser Leu

 660  665 670

tct tac ccg gat gag gaa tgc aat gag gcc tgc ctg gag ggc tgc ttc 2064

Ser Tyr Pro Asp Glu Glu Cys Asn Glu Ala Cys Leu Glu Gly Cys Phe

675 680 685

tgc ccc cca ggg ctc tac atg gat gag agg ggg gac tgc gtg ccc aag 2112

Cys Pro Pro Gly Leu Tyr Met Asp Glu Arg Gly Asp Cys Val Pro Lys

690 695 700

gcc cag tgc ccc tgt tac tat gac ggt gag atc ttc cag cca gaa gac 2160

Ala Gln Cys Pro Cys Tyr Tyr Asp Gly Glu Ile Phe Gln Pro Glu Asp

705 710  715  720

atc ttc tca gac cat cac acc atg tgc tac tgt gag gat ggc ttc atg 2208

Ile Phe Ser Asp His His Thr Met Cys Tyr Cys Glu Asp Gly Phe Met

 725 730  735

cac tgt acc atg agt gga gtc ccc gga agc ttg ctg cct gac gct gtc 2256

His Cys Thr Met Ser Gly Val Pro Gly Ser Leu Leu Pro Asp Ala Val

740 745 750

ctc agc agt ccc ctg tct cat cgc agc aaa agg agc cta tcc tgt cgg 2304

Leu Ser Ser Pro Leu Ser His Arg Ser Lys Arg Ser Leu Ser Cys Arg

755  760  765

ccc ccc atg gtc aag ctg gtg tgt ccc gct gac aac ctg cgg gct gaa 2352

Pro Pro Met Val Lys Leu Val Cys Pro Ala Asp Asn Leu Arg Ala Glu

770 775 780

ggg ctc gag tgt acc aaa acg tgc cag aac tat gac ctg gag tgc atg 2400

Gly Leu Glu Cys Thr Lys Thr Cys Gln Asn Tyr Asp Leu Glu Cys Met

785 790 795  800

agc atg ggc tgt gtc tct ggc tgc ctc tgc ccc ccg ggc atg gtc cgg 2448

Ser Met Gly Cys Val Ser Gly Cys Leu Cys Pro Pro Gly Met Val Arg

805 810   815

cat gag aac aga tgt gtg gcc ctg gaa agg tgt ccc tgc ttc cat cag 2496

His Glu Asn Arg Cys Val Ala Leu Glu Arg Cys Pro Cys Phe His Gln

 820 825 830

ggc aag gag tat gcc cct gga gaa aca gtg aag att ggc tgc aac act 2544

Gly Lys Glu Tyr Ala Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Gly Cys Asn Thr

835  840  845

tgt gtc tgt cgg gac cgg aag tgg aac tgc aca gac cat gtg tgt gat 2592

Cys Val Cys Arg Asp Arg Lys Trp Asn Cys Thr Asp His Val Cys Asp

850 855 860

gcc acg tgc tcc acg atc ggc atg gcc cac tac ctc acc ttc gac ggg 2640

Ala Thr Cys Ser Thr Ile Gly Met Ala His Tyr Leu Thr Phe Asp Gly

865  870 875 880

ctc aaa tac ctg ttc ccc ggg gag tgc cag tac gtt ctg gtg cag gat 2688

Leu Lys Tyr Leu Phe Pro Gly Glu Cys Gln Tyr Val Leu Val Gln Asp

 885 890 895

tac tgc ggc agt aac cct ggg acc ttt cgg atc cta gtg ggg aat aag 2736

Tyr Cys Gly Ser Asn Pro Gly Thr Phe Arg Ile Leu Val Gly Asn Lys

 900 905 910

gga tgc agc cac ccc tca gtg aaa tgc aag aaa cgg gtc acc atc ctg 2784

Gly Cys Ser His Pro Ser Val Lys Cys Lys Lys Arg Val Thr Ile Leu

915 920 925

gtg gag gga gga gag att gag ctg ttt gac ggg gag gtg aat gtg aag 2832

Val Glu Gly Gly Glu Ile Glu Leu Phe Asp Gly Glu Val Asn Val Lys

930 935 940

agg ccc atg aag gat gag act cac ttt gag gtg gtg gag tct ggc cgg 2880

Arg Pro Met Lys Asp Glu Thr His Phe Glu Val Val Glu Ser Gly Arg

945 950  955  960

tac atc att ctg ctg ctg ggc aaa gcc ctc tcc gtg gtc tgg gac cgc 2928

Tyr Ile Ile Leu Leu Leu Gly Lys Ala Leu Ser Val Val Trp Asp Arg

965 970  975

cac ctg agc atc tcc gtg gtc ctg aag cag aca tac cag gag aaa gtg 2976

His Leu Ser Ile Ser Val Val Leu Lys Gln Thr Tyr Gln Glu Lys Val

 980  985 990

tgt ggc ctg tgt ggg aat ttt gat ggc atc cag aac aat gac ctc acc 3024

Cys Gly Leu Cys Gly Asn Phe Asp Gly Ile Gln Asn Asn Asp Leu Thr

995 1000 1005

agc agc aac ctc caa gtg gag gaa gac cct gtg gac ttt ggg aac 3069

Ser Ser Asn Leu Gln Val Glu Glu Asp Pro Val Asp Phe Gly Asn

1010 1015  1020

tcc tgg aaa gtg agc tcg cag tgt gct gac acc aga aaa gtg cct 3114

Ser Trp Lys Val Ser Ser Gln Cys Ala Asp Thr Arg Lys Val Pro

1025 1030 1035

ctg gac tca tcc cct gcc acc tgc cat aac aac atc atg aag cag 3159

Leu Asp Ser Ser Pro Ala Thr Cys His Asn Asn Ile Met Lys Gln

 1040 1045 1050

acg atg gtg gat tcc tcc tgt aga atc ctt acc agt gac gtc ttc 3204

Thr Met Val Asp Ser Ser Cys Arg Ile Leu Thr Ser Asp Val Phe

 1055 1060 1065

cag gac tgc aac aag ctg gtg gac ccc gag cca tat ctg gat gtc 3249

Gln Asp Cys Asn Lys Leu Val Asp Pro Glu Pro Tyr Leu Asp Val

1070  1075 1080

tgc att tac gac acc tgc tcc tgt gag tcc att ggg gac tgc gcc 3294

Cys Ile Tyr Asp Thr Cys Ser Cys Glu Ser Ile Gly Asp Cys Ala

 1085 1090 1095

tgc ttc tgc gac acc att gct gcc tat gcc cac gtg tgt gcc cag 3339

Cys Phe Cys Asp Thr Ile Ala Ala Tyr Ala His Val Cys Ala Gln

1100 1105 1110

cat ggc aag gtg gtg acc tgg agg acg gcc aca ttg tgc ccc cag 3384

His Gly Lys Val Val Thr Trp Arg Thr Ala Thr Leu Cys Pro Gln

1115  1120 1125

agc tgc gag gag agg aat ctc cgg gag aac ggg tat gag tgt gag 3429

Ser Cys Glu Glu Arg Asn Leu Arg Glu Asn Gly Tyr Glu Cys Glu

1130 1135 1140

tgg cgc tat aac agc tgt gca cct gcc tgt caa gtc acg tgt cag 3474

Trp Arg Tyr Asn Ser Cys Ala Pro Ala Cys Gln Val Thr Cys Gln

1145  1150 1155

cac cct gag cca ctg gcc tgc cct gtg cag tgt gtg gag ggc tgc 3519

His Pro Glu Pro Leu Ala Cys Pro Val Gln Cys Val Glu Gly Cys

1160 1165  1170

cat gcc cac tgc cct cca ggg aaa atc ctg gat gag ctt ttg cag 3564

His Ala His Cys Pro Pro Gly Lys Ile Leu Asp Glu Leu Leu Gln

1175 1180  1185

acc tgc gtt gac cct gaa gac tgt cca gtg tgt gag gtg gct ggc 3609

Thr Cys Val Asp Pro Glu Asp Cys Pro Val Cys Glu Val Ala Gly

1190 1195  1200

cgg cgt ttt gcc tca gga aag aaa gtc acc ttg aat ccc agt gac 3654

Arg Arg Phe Ala Ser Gly Lys Lys Val Thr Leu Asn Pro Ser Asp

1205  1210 1215

cct gag cac tgc cag att tgc cac tgt gat gtt gtc aac ctc acc 3699

Pro Glu His Cys Gln Ile Cys His Cys Asp Val Val Asn Leu Thr

1220 1225 1230

tgt gaa gcc tgc cag gag ccg gga ggc ctg gtg gtg cct ccc aca 3744

Cys Glu Ala Cys Gln Glu Pro Gly Gly Leu Val Val Pro Pro Thr

1235 1240  1245

gat gcc ccg gtg agc ccc acc act ctg tat gtg gag gac atc tcg 3789

Asp Ala Pro Val Ser Pro Thr Thr Leu Tyr Val Glu Asp Ile Ser

1250 1255 1260

gaa ccg ccg ttg cac gat ttc tac tgc agc agg cta ctg gac ctg 3834

Glu Pro Pro Leu His Asp Phe Tyr Cys Ser Arg Leu Leu Asp Leu

1265  1270 1275

gtc ttc ctg ctg gat ggc tcc tcc agg ctg tcc gag gct gag ttt 3879

Val Phe Leu Leu Asp Gly Ser Ser Arg Leu Ser Glu Ala Glu Phe

 1280 1285 1290

gaa gtg ctg aag gcc ttt gtg gtg gac atg atg gag cgg ctg cgc 3924

Glu Val Leu Lys Ala Phe Val Val Asp Met Met Glu Arg Leu Arg

1295 1300  1305

atc tcc cag aag tgg gtc cgc gtg gcc gtg gtg gag tac cac gac 3969

Ile Ser Gln Lys Trp Val Arg Val Ala Val Val Glu Tyr His Asp

1310  1315 1320

ggc tcc cac gcc tac atc ggg ctc aag gac cgg aag cga ccg tca 4014

Gly Ser His Ala Tyr Ile Gly Leu Lys Asp Arg Lys Arg Pro Ser

1325 1330 1335

gag ctg cgg cgc att gcc agc cag gtg aag tat gcg ggc agc cag 4059

Glu Leu Arg Arg Ile Ala Ser Gln Val Lys Tyr Ala Gly Ser Gln

 1340 1345 1350

gtg gcc tcc acc agc gag gtc ttg aaa tac aca ctg ttc caa atc 4104

Val Ala Ser Thr Ser Glu Val Leu Lys Tyr Thr Leu Phe Gln Ile

1355  1360 1365

ttc agc aag atc gac cgc cct gaa gcc tcc cgc atc gcc ctg ctc 4149

Phe Ser Lys Ile Asp Arg Pro Glu Ala Ser Arg Ile Ala Leu Leu

1370  1375 1380

ctg atg gcc agc cag gag ccc caa cgg atg tcc cgg aac ttt gtc 4194

Leu Met Ala Ser Gln Glu Pro Gln Arg Met Ser Arg Asn Phe Val

1385  1390 1395

cgc tac gtc cag ggc ctg aag aag aag aag gtc att gtg atc ccg 4239

Arg Tyr Val Gln Gly Leu Lys Lys Lys Lys Val Ile Val Ile Pro

1400  1405 1410

gtg ggc att ggg ccc cat gcc aac ctc aag cag atc cgc ctc atc 4284

Val Gly Ile Gly Pro His Ala Asn Leu Lys Gln Ile Arg Leu Ile

1415 1420 1425

gag aag cag gcc cct gag aac aag gcc ttc gtg ctg agc agt gtg 4329

Glu Lys Gln Ala Pro Glu Asn Lys Ala Phe Val Leu Ser Ser Val

1430  1435 1440

gat gag ctg gag cag caa agg gac gag atc gtt agc tac ctc tgt 4374

Asp Glu Leu Glu Gln Gln Arg Asp Glu Ile Val Ser Tyr Leu Cys

1445 1450 1455

gac ctt gcc cct gaa gcc cct cct cct act ctg ccc ccc cac atg 4419

Asp Leu Ala Pro Glu Ala Pro Pro Pro Thr Leu Pro Pro His Met

1460 1465  1470

gca caa gtc act gtg ggc ccg ggg ctc ttg ggg gtt tcg acc ctg 4464

Ala Gln Val Thr Val Gly Pro Gly Leu Leu Gly Val Ser Thr Leu

1475 1480 1485

ggg ccc aag agg aac tcc atg gtt ctg gat gtg gcg ttc gtc ctg 4509

Gly Pro Lys Arg Asn Ser Met Val Leu Asp Val Ala Phe Val Leu

1490 1495  1500

gaa gga tcg gac aaa att ggt gaa gcc gac ttc aac agg agc aag 4554

Glu Gly Ser Asp Lys Ile Gly Glu Ala Asp Phe Asn Arg Ser Lys

1505 1510 1515

gag ttc atg gag gag gtg att cag cgg atg gat gtg ggc cag gac 4599

Glu Phe Met Glu Glu Val Ile Gln Arg Met Asp Val Gly Gln Asp

1520 1525  1530

agc atc cac gtc acg gtg ctg cag tac tcc tac atg gtg acc gtg 4644

Ser Ile His Val Thr Val Leu Gln Tyr Ser Tyr Met Val Thr Val

1535  1540 1545

gag tac ccc ttc agc gag gca cag tcc aaa ggg gac atc ctg cag 4689

Glu Tyr Pro Phe Ser Glu Ala Gln Ser Lys Gly Asp Ile Leu Gln

1550 1555  1560

cgg gtg cga gag atc cgc tac cag ggc ggc aac agg acc aac act 4734

Arg Val Arg Glu Ile Arg Tyr Gln Gly Gly Asn Arg Thr Asn Thr

1565 1570  1575

ggg ctg gcc ctg cgg tac ctc tct gac cac agc ttc ttg gtc agc 4779

Gly Leu Ala Leu Arg Tyr Leu Ser Asp His Ser Phe Leu Val Ser

1580 1585  1590

cag ggt gac cgg gag cag gcg ccc aac ctg gtc tac atg gtc acc 4824

Gln Gly Asp Arg Glu Gln Ala Pro Asn Leu Val Tyr Met Val Thr

1595  1600 1605

gga aat cct gcc tct gat gag atc aag agg ctg cct gga gac atc 4869

Gly Asn Pro Ala Ser Asp Glu Ile Lys Arg Leu Pro Gly Asp Ile

1610 1615 1620

cag gtg gtg ccc att gga gtg ggc cct aat gcc aac gtg cag gag 4914

Gln Val Val Pro Ile Gly Val Gly Pro Asn Ala Asn Val Gln Glu

1625 1630 1635

ctg gag agg att ggc tgg ccc aat gcc cct atc ctc atc cag gac 4959

Leu Glu Arg Ile Gly Trp Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ile Gln Asp

1640 1645 1650

ttt gag acg ctc ccc cga gag gct cct gac ctg gtg ctg cag agg 5004

Phe Glu Thr Leu Pro Arg Glu Ala Pro Asp Leu Val Leu Gln Arg

1655 1660 1665

tgc tgc tcc gga gag ggg ctg cag atc ccc acc ctc tcc cct gca 5049

Cys Cys Ser Gly Glu Gly Leu Gln Ile Pro Thr Leu Ser Pro Ala

 1670 1675 1680

cct gac tgc agc cag ccc ctg gac gtg atc ctt ctc ctg gat ggc 5094

Pro Asp Cys Ser Gln Pro Leu Asp Val Ile Leu Leu Leu Asp Gly

1685 1690 1695

tcc tcc agt ttc cca gct tct tat ttt gat gaa atg aag agt ttc 5139

Ser Ser Ser Phe Pro Ala Ser Tyr Phe Asp Glu Met Lys Ser Phe

1700 1705 1710

gcc aag gct ttc att tca aaa gcc aat ata ggg cct cgt ctc act 5184

Ala Lys Ala Phe Ile Ser Lys Ala Asn Ile Gly Pro Arg Leu Thr

1715 1720 1725

cag gtg tca gtg ctg cag tat gga agc atc acc acc att gac gtg 5229

Gln Val Ser Val Leu Gln Tyr Gly Ser Ile Thr Thr Ile Asp Val

1730 1735  1740

cca tgg aac gtg gtc ccg gag aaa gcc cat ttg ctg agc ctt gtg 5274

Pro Trp Asn Val Val Pro Glu Lys Ala His Leu Leu Ser Leu Val

1745  1750 1755

gac gtc atg cag cgg gag gga ggc ccc agc caa atc ggg gat gcc 5319

Asp Val Met Gln Arg Glu Gly Gly Pro Ser Gln Ile Gly Asp Ala

1760 1765 1770

ttg ggc ttt gct gtg cga tac ttg act tca gaa atg cat ggg gcg 5364

Leu Gly Phe Ala Val Arg Tyr Leu Thr Ser Glu Met His Gly Ala

1775 1780 1785

cgc ccg gga gcc tca aag gcg gtg gtc atc ctg gtc acg gac gtc 5409

Arg Pro Gly Ala Ser Lys Ala Val Val Ile Leu Val Thr Asp Val

1790 1795 1800

tct gtg gat tca gtg gat gca gca gct gat gcc gcc agg tcc aac 5454

Ser Val Asp Ser Val Asp Ala Ala Ala Asp Ala Ala Arg Ser Asn

1805 1810 1815

aga gtg aca gtg ttc cct att gga att gga gat cgc tac gat gca 5499

Arg Val Thr Val Phe Pro Ile Gly Ile Gly Asp Arg Tyr Asp Ala

1820 1825  1830

gcc cag cta cgg atc ttg gca ggc cca gca ggc gac tcc aac gtg 5544

Ala Gln Leu Arg Ile Leu Ala Gly Pro Ala Gly Asp Ser Asn Val

1835  1840 1845

gtg aag ctc cag cga atc gaa gac ctc cct acc atg gtc acc ttg 5589

Val Lys Leu Gln Arg Ile Glu Asp Leu Pro Thr Met Val Thr Leu

1850 1855  1860

ggc aat tcc ttc ctc cac aaa ctg tgc tct gga ttt gtt agg att 5634

Gly Asn Ser Phe Leu His Lys Leu Cys Ser Gly Phe Val Arg Ile

1865  1870 1875

tgc atg gat gag gat ggg aat gag aag agg ccc ggg gac gtc tgg 5679

Cys Met Asp Glu Asp Gly Asn Glu Lys Arg Pro Gly Asp Val Trp

1880 1885  1890

acc ttg cca gac cag tgc cac acc gtg act tgc cag cca gat ggc 5724

Thr Leu Pro Asp Gln Cys His Thr Val Thr Cys Gln Pro Asp Gly

1895 1900  1905

cag acc ttg ctg aag agt cat cgg gtc aac tgt gac cgg ggg ctg 5769

Gln Thr Leu Leu Lys Ser His Arg Val Asn Cys Asp Arg Gly Leu

1910 1915 1920

agg cct tcg tgc cct aac agc cag tcc cct gtt aaa gtg gaa gag 5814

Arg Pro Ser Cys Pro Asn Ser Gln Ser Pro Val Lys Val Glu Glu

1925 1930  1935

acc tgt ggc tgc cgc tgg acc tgc ccc tgc gtg tgc aca ggc agc 5859

Thr Cys Gly Cys Arg Trp Thr Cys Pro Cys Val Cys Thr Gly Ser

1940 1945 1950

tcc act cgg cac atc gtg acc ttt gat ggg cag aat ttc aag ctg 5904

Ser Thr Arg His Ile Val Thr Phe Asp Gly Gln Asn Phe Lys Leu

1955  1960 1965

act ggc agc tgt tct tat gtc cta ttt caa aac aag gag cag gac 5949

Thr Gly Ser Cys Ser Tyr Val Leu Phe Gln Asn Lys Glu Gln Asp

1970  1975 1980

ctg gag gtg att ctc cat aat ggt gcc tgc agc cct gga gca agg 5994

Leu Glu Val Ile Leu His Asn Gly Ala Cys Ser Pro Gly Ala Arg

1985  1990 1995

cag ggc tgc atg aaa tcc atc gag gtg aag cac agt gcc ctc tcc 6039

Gln Gly Cys Met Lys Ser Ile Glu Val Lys His Ser Ala Leu Ser

2000 2005 2010

gtc gag ctg cac agt gac atg gag gtg acg gtg aat ggg aga ctg 6084

Val Glu Leu His Ser Asp Met Glu Val Thr Val Asn Gly Arg Leu

2015 2020 2025

gtc tct gtt cct tac gtg ggt ggg aac atg gaa gtc aac gtt tat 6129

Val Ser Val Pro Tyr Val Gly Gly Asn Met Glu Val Asn Val Tyr

2030 2035  2040

ggt gcc atc atg cat gag gtc aga ttc aat cac ctt ggt cac atc 6174

Gly Ala Ile Met His Glu Val Arg Phe Asn His Leu Gly His Ile

2045 2050  2055

ttc aca ttc act cca caa aac aat gag ttc caa ctg cag ctc agc 6219

Phe Thr Phe Thr Pro Gln Asn Asn Glu Phe Gln Leu Gln Leu Ser

2060 2065 2070

ccc aag act ttt gct tca aag acg tat ggt ctg tgt ggg atc tgt 6264

Pro Lys Thr Phe Ala Ser Lys Thr Tyr Gly Leu Cys Gly Ile Cys

2075 2080 2085

gat gag aac gga gcc aat gac ttc atg ctg agg gat ggc aca gtc 6309

Asp Glu Asn Gly Ala Asn Asp Phe Met Leu Arg Asp Gly Thr Val

2090 2095   2100

acc aca gac tgg aaa aca ctt gtt cag gaa tgg act gtg cag cgg 6354

Thr Thr Asp Trp Lys Thr Leu Val Gln Glu Trp Thr Val Gln Arg

 2105 2110 2115

cca ggg cag acg tgc cag ccc atc ctg gag gag cag tgt ctt gtc 6399

Pro Gly Gln Thr Cys Gln Pro Ile Leu Glu Glu Gln Cys Leu Val

2120 2125  2130

ccc gac agc tcc cac tgc cag gtc ctc ctc tta cca ctg ttt gct 6444

Pro Asp Ser Ser His Cys Gln Val Leu Leu Leu Pro Leu Phe Ala

2135 2140 2145

gaa tgc cac aag gtc ctg gct cca gcc aca ttc tat gcc atc tgc 6489

Glu Cys His Lys Val Leu Ala Pro Ala Thr Phe Tyr Ala Ile Cys

2150 2155  2160

cag cag gac agt tgc cac cag gag caa gtg tgt gag gtg atc gcc 6534

Gln Gln Asp Ser Cys His Gln Glu Gln Val Cys Glu Val Ile Ala

2165 2170 2175

tct tat gcc cac ctc tgt cgg acc aac ggg gtc tgc gtt gac tgg 6579

Ser Tyr Ala His Leu Cys Arg Thr Asn Gly Val Cys Val Asp Trp

2180 2185 2190

agg aca cct gat ttc tgt gct atg tca tgc cca cca tct ctg gtt 6624

Arg Thr Pro Asp Phe Cys Ala Met Ser Cys Pro Pro Ser Leu Val

2195 2200  2205

tat aac cac tgt gag cat ggc tgt ccc cgg cac tgt gat ggc aac 6669

Tyr Asn His Cys Glu His Gly Cys Pro Arg His Cys Asp Gly Asn

2210  2215 2220

gtg agc tcc tgt ggg gac cat ccc tcc gaa ggc tgt ttc tgc cct 6714

Val Ser Ser Cys Gly Asp His Pro Ser Glu Gly Cys Phe Cys Pro

2225 2230  2235

cca gat aaa gtc atg ttg gaa ggc agc tgt gtc cct gaa gag gcc 6759

Pro Asp Lys Val Met Leu Glu Gly Ser Cys Val Pro Glu Glu Ala

2240 2245 2250

tgc act cag tgc att ggt gag gat gga gtc cag cac cag ttc ctg 6804

Cys Thr Gln Cys Ile Gly Glu Asp Gly Val Gln His Gln Phe Leu

2255 2260 2265

gaa gcc tgg gtc ccg gac cac cag ccc tgt cag atc tgc aca tgc 6849

Glu Ala Trp Val Pro Asp His Gln Pro Cys Gln Ile Cys Thr Cys

2270  2275 2280

ctc agc ggg cgg aag gtc aac tgc aca acg cag ccc tgc ccc acg 6894

Leu Ser Gly Arg Lys Val Asn Cys Thr Thr Gln Pro Cys Pro Thr

2285  2290 2295

gcc aaa gct ccc acg tgt ggc ctg tgt gaa gta gcc cgc ctc cgc 6939

Ala Lys Ala Pro Thr Cys Gly Leu Cys Glu Val Ala Arg Leu Arg

2300 2305 2310

cag aat gca gac cag tgc tgc ccc gag tat gag tgt gtg tgt gac 6984

Gln Asn Ala Asp Gln Cys Cys Pro Glu Tyr Glu Cys Val Cys Asp

2315 2320 2325

cca gtg agc tgt gac ctg ccc cca gtg cct cac tgt gaa cgt ggc 7029

Pro Val Ser Cys Asp Leu Pro Pro Val Pro His Cys Glu Arg Gly

2330 2335 2340

ctc cag ccc aca ctg acc aac cct ggc gag tgc aga ccc aac ttc 7074

Leu Gln Pro Thr Leu Thr Asn Pro Gly Glu Cys Arg Pro Asn Phe

2345 2350 2355

acc tgc gcc tgc agg aag gag gag tgc aaa aga gtg tcc cca ccc 7119

Thr Cys Ala Cys Arg Lys Glu Glu Cys Lys Arg Val Ser Pro Pro

 2360 2365 2370

tcc tgc ccc ccg cac cgt ttg ccc acc ctt cgg aag acc cag tgc 7164

Ser Cys Pro Pro His Arg Leu Pro Thr Leu Arg Lys Thr Gln Cys

2375 2380 2385

tgt gat gag tat gag tgt gcc tgc aac tgt gtc aac tcc aca gtg 7209

Cys Asp Glu Tyr Glu Cys Ala Cys Asn Cys Val Asn Ser Thr Val

2390  2395 2400

agc tgt ccc ctt ggg tac ttg gcc tca acc gcc acc aat gac tgt 7254

Ser Cys Pro Leu Gly Tyr Leu Ala Ser Thr Ala Thr Asn Asp Cys

2405 2410 2415

ggc tgt acc aca acc acc tgc ctt ccc gac aag gtg tgt gtc cac 7299

Gly Cys Thr Thr Thr Thr Cys Leu Pro Asp Lys Val Cys Val His

2420  2425 2430

cga agc acc atc tac cct gtg ggc cag ttc tgg gag gag ggc tgc 7344

Arg Ser Thr Ile Tyr Pro Val Gly Gln Phe Trp Glu Glu Gly Cys

2435  2440 2445

gat gtg tgc acc tgc acc gac atg gag gat gcc gtg atg ggc ctc 7389

Asp Val Cys Thr Cys Thr Asp Met Glu Asp Ala Val Met Gly Leu

2450 2455 246

cgc gtg gcc cag tgc tcc cag aag ccc tgt gag gac agc tgt cgg 7434

Arg Val Ala Gln Cys Ser Gln Lys Pro Cys Glu Asp Ser Cys Arg

 2465 2470 2475

tcg ggc ttc act tac gtt ctg cat gaa ggc gag tgc tgt gga agg 7479

Ser Gly Phe Thr Tyr Val Leu His Glu Gly Glu Cys Cys Gly Arg

2480 2485  2490

tgc ctg cca tct gcc tgt gag gtg gtg act ggc tca ccg cgg ggg 7524

Cys Leu Pro Ser Ala Cys Glu Val Val Thr Gly Ser Pro Arg Gly

2495 2500 2505

gac tcc cag tct tcc tgg aag agt gtc ggc tcc cag tgg gcc tcc 7569

Asp Ser Gln Ser Ser Trp Lys Ser Val Gly Ser Gln Trp Ala Ser

2510  2515 2520

ccg gag aac ccc tgc ctc atc aat gag tgt gtc cga gtg aag gag 7614

Pro Glu Asn Pro Cys Leu Ile Asn Glu Cys Val Arg Val Lys Glu

2525  2530 2535

gag gtc ttt ata caa caa agg aac gtc tcc tgc ccc cag ctg gag 7659

Glu Val Phe Ile Gln Gln Arg Asn Val Ser Cys Pro Gln Leu Glu

2540 2545 2550

gtc cct gtc tgc ccc tcg ggc ttt cag ctg agc tgt aag acc tca 7704

Val Pro Val Cys Pro Ser Gly Phe Gln Leu Ser Cys Lys Thr Ser

2555  2560 2565

gcg tgc tgc cca agc tgt cgc tgt gag cgc atg gag gcc tgc atg 7749

Ala Cys Cys Pro Ser Cys Arg Cys Glu Arg Met Glu Ala Cys Met

2570 2575 2580

ctc aat ggc act gtc att ggg ccc ggg aag act gtg atg atc gat 7794

Leu Asn Gly Thr Val Ile Gly Pro Gly Lys Thr Val Met Ile Asp

2585  2590 2595

gtg tgc acg acc tgc cgc tgc atg gtg cag gtg ggg gtc atc tct 7839

Val Cys Thr Thr Cys Arg Cys Met Val Gln Val Gly Val Ile Ser

2600  2605 2610

gga ttc aag ctg gag tgc agg aag acc acc tgc aac ccc tgc ccc 7884

Gly Phe Lys Leu Glu Cys Arg Lys Thr Thr Cys Asn Pro Cys Pro

2615  2620 2625

ctg ggt tac aag gaa gaa aat aac aca ggt gaa tgt tgt ggg aga 7929

Leu Gly Tyr Lys Glu Glu Asn Asn Thr Gly Glu Cys Cys Gly Arg

2630  2635 2640

tgt ttg cct acg gct tgc acc att cag cta aga gga gga cag atc 7974

Cys Leu Pro Thr Ala Cys Thr Ile Gln Leu Arg Gly Gly Gln Ile

2645 2650 2655

atg aca ctg aag cgt gat gag acg ctc cag gat ggc tgt gat act 8019

Met Thr Leu Lys Arg Asp Glu Thr Leu Gln Asp Gly Cys Asp Thr

2660  2665 2670

cac ttc tgc aag gtc aat gag aga gga gag tac ttc tgg gag aag 8064

His Phe Cys Lys Val Asn Glu Arg Gly Glu Tyr Phe Trp Glu Lys

2675 2680 2685

agg gtc aca ggc tgc cca ccc ttt gat gaa cac aag tgt ctg gct 8109

Arg Val Thr Gly Cys Pro Pro Phe Asp Glu His Lys Cys Leu Ala

2690  2695 2700

gag gga ggt aaa att atg aaa att cca ggc acc tgc tgt gac aca 8154

Glu Gly Gly Lys Ile Met Lys Ile Pro Gly Thr Cys Cys Asp Thr

2705 2710  2715

tgt gag gag cct gag tgc aac gac atc act gcc agg ctg cag tat 8199

Cys Glu Glu Pro Glu Cys Asn Asp Ile Thr Ala Arg Leu Gln Tyr

2720 2725 2730

gtc aag gtg gga agc tgt aag tct gaa gta gag gtg gat atc cac 8244

Val Lys Val Gly Ser Cys Lys Ser Glu Val Glu Val Asp Ile His

2735 2740 2745

tac tgc cag ggc aaa tgt gcc agc aaa gcc atg tac tcc att gac 8289

Tyr Cys Gln Gly Lys Cys Ala Ser Lys Ala Met Tyr Ser Ile Asp

2750 2755  2760

atc aac gat gtg cag gac cag tgc tcc tgc tgc tct ccg aca cgg 8334

Ile Asn Asp Val Gln Asp Gln Cys Ser Cys Cys Ser Pro Thr Arg

2765 2770 2775

acg gag ccc atg cag gtg gcc ctg cac tgc acc aat ggc tct gtt 8379

Thr Glu Pro Met Gln Val Ala Leu His Cys Thr Asn Gly Ser Val

2780 2785  2790

gtg tac cat gag gtt ctc aat gcc atg gag tgc aaa tgc tcc ccc 8424

Val Tyr His Glu Val Leu Asn Ala Met Glu Cys Lys Cys Ser Pro

2795 2800  2805

agg aag tgc agc aag tga 8442

Arg Lys Cys Ser Lys

2810

<210> 2

<211> 2813

<212> PRT

<213> 智人(ren)

<400> 2

Met Ile Pro Ala Arg Phe Ala Gly Val Leu Leu Ala Leu Ala Leu Ile

1 5  10 15

Leu Pro Gly Thr Leu Cys Ala Glu Gly Thr Arg Gly Arg Ser Ser Thr

20   25 30

Ala Arg Cys Ser Leu Phe Gly Ser Asp Phe Val Asn Thr Phe Asp Gly

35  40 45

Ser Met Tyr Ser Phe Ala Gly Tyr Cys Ser Tyr Leu Leu Ala Gly Gly

50 55 60

Cys Gln Lys Arg Ser Phe Ser Ile Ile Gly Asp Phe Gln Asn Gly Lys

65 70 75   80

Arg Val Ser Leu Ser Val Tyr Leu Gly Glu Phe Phe Asp Ile His Leu

 85 90 95

Phe Val Asn Gly Thr Val Thr Gln Gly Asp Gln Arg Val Ser Met Pro

100 105 110

Tyr Ala Ser Lys Gly Leu Tyr Leu Glu Thr Glu Ala Gly Tyr Tyr Lys

 115 120 125

Leu Ser Gly Glu Ala Tyr Gly Phe Val Ala Arg Ile Asp Gly Ser Gly

130 135 140

Asn Phe Gln Val Leu Leu Ser Asp Arg Tyr Phe Asn Lys Thr Cys Gly

145  150  155 160

Leu Cys Gly Asn Phe Asn Ile Phe Ala Glu Asp Asp Phe Met Thr Gln

165  170 175

Glu Gly Thr Leu Thr Ser Asp Pro Tyr Asp Phe Ala Asn Ser Trp Ala

 180  185 190

Leu Ser Ser Gly Glu Gln Trp Cys Glu Arg Ala Ser Pro Pro Ser Ser

195  200  205

Ser Cys Asn Ile Ser Ser Gly Glu Met Gln Lys Gly Leu Trp Glu Gln

210 215 220

Cys Gln Leu Leu Lys Ser Thr Ser Val Phe Ala Arg Cys His Pro Leu

225  230  235 240

Val Asp Pro Glu Pro Phe Val Ala Leu Cys Glu Lys Thr Leu Cys Glu

245  250 255

Cys Ala Gly Gly Leu Glu Cys Ala Cys Pro Ala Leu Leu Glu Tyr Ala

 260 265 270

Arg Thr Cys Ala Gln Glu Gly Met Val Leu Tyr Gly Trp Thr Asp His

275 280   285

Ser Ala Cys Ser Pro Val Cys Pro Ala Gly Met Glu Tyr Arg Gln Cys

290 295 300

Val Ser Pro Cys Ala Arg Thr Cys Gln Ser Leu His Ile Asn Glu Met

305   310 315 320

Cys Gln Glu Arg Cys Val Asp Gly Cys Ser Cys Pro Glu Gly Gln Leu

325  330 335

Leu Asp Glu Gly Leu Cys Val Glu Ser Thr Glu Cys Pro Cys Val His

340  345 350

Ser Gly Lys Arg Tyr Pro Pro Gly Thr Ser Leu Ser Arg Asp Cys Asn

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Thr Cys Ile Cys Arg Asn Ser Gln Trp Ile Cys Ser Asn Glu Glu Cys

370 375 380

Pro Gly Glu Cys Leu Val Thr Gly Gln Ser His Phe Lys Ser Phe Asp

385  390 395 400

Asn Arg Tyr Phe Thr Phe Ser Gly Ile Cys Gln Tyr Leu Leu Ala Arg

 405 410 415

Asp Cys Gln Asp His Ser Phe Ser Ile Val Ile Glu Thr Val Gln Cys

420 425  430

Ala Asp Asp Arg Asp Ala Val Cys Thr Arg Ser Val Thr Val Arg Leu

435 440  445

Pro Gly Leu His Asn Ser Leu Val Lys Leu Lys His Gly Ala Gly Val

450 455 460

Ala Met Asp Gly Gln Asp Val Gln Leu Pro Leu Leu Lys Gly Asp Leu

465  470 475 480

Arg Ile Gln His Thr Val Thr Ala Ser Val Arg Leu Ser Tyr Gly Glu

485  490 495

Asp Leu Gln Met Asp Trp Asp Gly Arg Gly Arg Leu Leu Val Lys Leu

500  505 510

Ser Pro Val Tyr Ala Gly Lys Thr Cys Gly Leu Cys Gly Asn Tyr Asn

515  520 525

Gly Asn Gln Gly Asp Asp Phe Leu Thr Pro Ser Gly Leu Ala Glu Pro

530 535 540

Arg Val Glu Asp Phe Gly Asn Ala Trp Lys Leu His Gly Asp Cys Gln

545 550  555 560

Asp Leu Gln Lys Gln His Ser Asp Pro Cys Ala Leu Asn Pro Arg Met

 565 570 575

Thr Arg Phe Ser Glu Glu Ala Cys Ala Val Leu Thr Ser Pro Thr Phe

580  585 590

Glu Ala Cys His Arg Ala Val Ser Pro Leu Pro Tyr Leu Arg Asn Cys

595  600 605

Arg Tyr Asp Val Cys Ser Cys Ser Asp Gly Arg Glu Cys Leu Cys Gly

610 615 620

Ala Leu Ala Ser Tyr Ala Ala Ala Cys Ala Gly Arg Gly Val Arg Val

625 630 635   640

Ala Trp Arg Glu Pro Gly Arg Cys Glu Leu Asn Cys Pro Lys Gly Gln

 645 650 655

Val Tyr Leu Gln Cys Gly Thr Pro Cys Asn Leu Thr Cys Arg Ser Leu

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Ser Tyr Pro Asp Glu Glu Cys Asn Glu Ala Cys Leu Glu Gly Cys Phe

675  680 685

Cys Pro Pro Gly Leu Tyr Met Asp Glu Arg Gly Asp Cys Val Pro Lys

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Ala Gln Cys Pro Cys Tyr Tyr Asp Gly Glu Ile Phe Gln Pro Glu Asp

705 710 715 720

Ile Phe Ser Asp His His Thr Met Cys Tyr Cys Glu Asp Gly Phe Met

 725 730 735

His Cys Thr Met Ser Gly Val Pro Gly Ser Leu Leu Pro Asp Ala Val

740  745 750

Leu Ser Ser Pro Leu Ser His Arg Ser Lys Arg Ser Leu Ser Cys Arg

755 760 765

Pro Pro Met Val Lys Leu Val Cys Pro Ala Asp Asn Leu Arg Ala Glu

770 775 780

Gly Leu Glu Cys Thr Lys Thr Cys Gln Asn Tyr Asp Leu Glu Cys Met

785 790  795 800

Ser Met Gly Cys Val Ser Gly Cys Leu Cys Pro Pro Gly Met Val Arg

 805 810  815

His Glu Asn Arg Cys Val Ala Leu Glu Arg Cys Pro Cys Phe His Gln

 820 825 830

Gly Lys Glu Tyr Ala Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Gly Cys Asn Thr

835 840  845

Cys Val Cys Arg Asp Arg Lys Trp Asn Cys Thr Asp His Val Cys Asp

850 855 860

Ala Thr Cys Ser Thr Ile Gly Met Ala His Tyr Leu Thr Phe Asp Gly

865 870 875 880

Leu Lys Tyr Leu Phe Pro Gly Glu Cys Gln Tyr Val Leu Val Gln Asp

885 890  895

Tyr Cys Gly Ser Asn Pro Gly Thr Phe Arg Ile Leu Val Gly Asn Lys

900  905  910

Gly Cys Ser His Pro Ser Val Lys Cys Lys Lys Arg Val Thr Ile Leu

915  920  925

Val Glu Gly Gly Glu Ile Glu Leu Phe Asp Gly Glu Val Asn Val Lys

930 935 940

Arg Pro Met Lys Asp Glu Thr His Phe Glu Val Val Glu Ser Gly Arg

945 950 955 960

Tyr Ile Ile Leu Leu Leu Gly Lys Ala Leu Ser Val Val Trp Asp Arg

 965 970 975

His Leu Ser Ile Ser Val Val Leu Lys Gln Thr Tyr Gln Glu Lys Val

980 985  990

Cys Gly Leu Cys Gly Asn Phe Asp Gly Ile Gln Asn Asn Asp Leu Thr

995 1000  1005

Ser Ser Asn Leu Gln Val Glu Glu Asp Pro Val Asp Phe Gly Asn

1010 1015 1020

Ser Trp Lys Val Ser Ser Gln Cys Ala Asp Thr Arg Lys Val Pro

1025  1030 1035

Leu Asp Ser Ser Pro Ala Thr Cys His Asn Asn Ile Met Lys Gln

1040  1045 1050

Thr Met Val Asp Ser Ser Cys Arg Ile Leu Thr Ser Asp Val Phe

1055 1060  1065

Gln Asp Cys Asn Lys Leu Val Asp Pro Glu Pro Tyr Leu Asp Val

 1070 1075 1080

Cys Ile Tyr Asp Thr Cys Ser Cys Glu Ser Ile Gly Asp Cys Ala

1085 1090  1095

Cys Phe Cys Asp Thr Ile Ala Ala Tyr Ala His Val Cys Ala Gln

 1100 1105 1110

His Gly Lys Val Val Thr Trp Arg Thr Ala Thr Leu Cys Pro Gln

1115  1120 1125

Ser Cys Glu Glu Arg Asn Leu Arg Glu Asn Gly Tyr Glu Cys Glu

1130 1135  1140

Trp Arg Tyr Asn Ser Cys Ala Pro Ala Cys Gln Val Thr Cys Gln

1145 1150 1155

His Pro Glu Pro Leu Ala Cys Pro Val Gln Cys Val Glu Gly Cys

1160  1165 1170

His Ala His Cys Pro Pro Gly Lys Ile Leu Asp Glu Leu Leu Gln

1175 1180 1185

Thr Cys Val Asp Pro Glu Asp Cys Pro Val Cys Glu Val Ala Gly

1190  1195 1200

Arg Arg Phe Ala Ser Gly Lys Lys Val Thr Leu Asn Pro Ser Asp

1205 1210 1215

Pro Glu His Cys Gln Ile Cys His Cys Asp Val Val Asn Leu Thr

1220  1225 1230

Cys Glu Ala Cys Gln Glu Pro Gly Gly Leu Val Val Pro Pro Thr

1235  1240 1245

Asp Ala Pro Val Ser Pro Thr Thr Leu Tyr Val Glu Asp Ile Ser

1250 1255  1260

Glu Pro Pro Leu His Asp Phe Tyr Cys Ser Arg Leu Leu Asp Leu

1265 1270  1275

Val Phe Leu Leu Asp Gly Ser Ser Arg Leu Ser Glu Ala Glu Phe

1280 1285  1290

Glu Val Leu Lys Ala Phe Val Val Asp Met Met Glu Arg Leu Arg

 1295 1300 1305

Ile Ser Gln Lys Trp Val Arg Val Ala Val Val Glu Tyr His Asp

1310 1315 1320

Gly Ser His Ala Tyr Ile Gly Leu Lys Asp Arg Lys Arg Pro Ser

1325 1330 1335

Glu Leu Arg Arg Ile Ala Ser Gln Val Lys Tyr Ala Gly Ser Gln

1340 1345 1350

Val Ala Ser Thr Ser Glu Val Leu Lys Tyr Thr Leu Phe Gln Ile

1355 1360 1365

Phe Ser Lys Ile Asp Arg Pro Glu Ala Ser Arg Ile Ala Leu Leu

1370 1375 1380

Leu Met Ala Ser Gln Glu Pro Gln Arg Met Ser Arg Asn Phe Val

1385 1390 1395

Arg Tyr Val Gln Gly Leu Lys Lys Lys Lys Val Ile Val Ile Pro

1400 1405  1410

Val Gly Ile Gly Pro His Ala Asn Leu Lys Gln Ile Arg Leu Ile

 1415 1420 1425

Glu Lys Gln Ala Pro Glu Asn Lys Ala Phe Val Leu Ser Ser Val

1430  1435 1440

Asp Glu Leu Glu Gln Gln Arg Asp Glu Ile Val Ser Tyr Leu Cys

1445 1450  1455

Asp Leu Ala Pro Glu Ala Pro Pro Pro Thr Leu Pro Pro His Met

 1460 1465 1470

Ala Gln Val Thr Val Gly Pro Gly Leu Leu Gly Val Ser Thr Leu

1475 1480  1485

Gly Pro Lys Arg Asn Ser Met Val Leu Asp Val Ala Phe Val Leu

1490 1495 1500

Glu Gly Ser Asp Lys Ile Gly Glu Ala Asp Phe Asn Arg Ser Lys

1505  1510 1515

Glu Phe Met Glu Glu Val Ile Gln Arg Met Asp Val Gly Gln Asp

1520 1525 1530

Ser Ile His Val Thr Val Leu Gln Tyr Ser Tyr Met Val Thr Val

1535 1540  1545

Glu Tyr Pro Phe Ser Glu Ala Gln Ser Lys Gly Asp Ile Leu Gln

1550 1555 1560

Arg Val Arg Glu Ile Arg Tyr Gln Gly Gly Asn Arg Thr Asn Thr

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Gly Leu Ala Leu Arg Tyr Leu Ser Asp His Ser Phe Leu Val Ser

1580  1585 1590

Gln Gly Asp Arg Glu Gln Ala Pro Asn Leu Val Tyr Met Val Thr

1595 1600  1605

Gly Asn Pro Ala Ser Asp Glu Ile Lys Arg Leu Pro Gly Asp Ile

1610  1615 1620

Gln Val Val Pro Ile Gly Val Gly Pro Asn Ala Asn Val Gln Glu

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 1670 1675 1680

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Ser Ser Ser Phe Pro Ala Ser Tyr Phe Asp Glu Met Lys Ser Phe

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Ala Lys Ala Phe Ile Ser Lys Ala Asn Ile Gly Pro Arg Leu Thr

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Gln Val Ser Val Leu Gln Tyr Gly Ser Ile Thr Thr Ile Asp Val

1730  1735 1740

Pro Trp Asn Val Val Pro Glu Lys Ala His Leu Leu Ser Leu Val

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Asp Val Met Gln Arg Glu Gly Gly Pro Ser Gln Ile Gly Asp Ala

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Leu Gly Phe Ala Val Arg Tyr Leu Thr Ser Glu Met His Gly Ala

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Arg Pro Gly Ala Ser Lys Ala Val Val Ile Leu Val Thr Asp Val

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Arg Val Thr Val Phe Pro Ile Gly Ile Gly Asp Arg Tyr Asp Ala

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Gly Asn Ser Phe Leu His Lys Leu Cys Ser Gly Phe Val Arg Ile

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2000  2005 2010

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2015  2020 2025

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2045 2050 2055

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2075  2080 2085

Asp Glu Asn Gly Ala Asn Asp Phe Met Leu Arg Asp Gly Thr Val

2090  2095 2100

Thr Thr Asp Trp Lys Thr Leu Val Gln Glu Trp Thr Val Gln Arg

2105  2110 2115

Pro Gly Gln Thr Cys Gln Pro Ile Leu Glu Glu Gln Cys Leu Val

2120 2125  2130

Pro Asp Ser Ser His Cys Gln Val Leu Leu Leu Pro Leu Phe Ala

2135  2140 2145

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2150 2155 2160

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2210 2215  2220

Val Ser Ser Cys Gly Asp His Pro Ser Glu Gly Cys Phe Cys Pro

 2225 2230 2235

Pro Asp Lys Val Met Leu Glu Gly Ser Cys Val Pro Glu Glu Ala

2240  2245 2250

Cys Thr Gln Cys Ile Gly Glu Asp Gly Val Gln His Gln Phe Leu

2255  2260 2265

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2270 2275 2280

Leu Ser Gly Arg Lys Val Asn Cys Thr Thr Gln Pro Cys Pro Thr

2285  2290 2295

Ala Lys Ala Pro Thr Cys Gly Leu Cys Glu Val Ala Arg Leu Arg

2300  2305 2310

Gln Asn Ala Asp Gln Cys Cys Pro Glu Tyr Glu Cys Val Cys Asp

2315  2320 2325

Pro Val Ser Cys Asp Leu Pro Pro Val Pro His Cys Glu Arg Gly

2330 2335 2340

Leu Gln Pro Thr Leu Thr Asn Pro Gly Glu Cys Arg Pro Asn Phe

2345 2350 2355

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2360 2365  2370

Ser Cys Pro Pro His Arg Leu Pro Thr Leu Arg Lys Thr Gln Cys

2375 2380 2385

Cys Asp Glu Tyr Glu Cys Ala Cys Asn Cys Val Asn Ser Thr Val

 2390 2395 2400

Ser Cys Pro Leu Gly Tyr Leu Ala Ser Thr Ala Thr Asn Asp Cys

2405 2410  2415

Gly Cys Thr Thr Thr Thr Cys Leu Pro Asp Lys Val Cys Val His

2420 2425 2430

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2435 2440 2445

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2450  2455 2460

Arg Val Ala Gln Cys Ser Gln Lys Pro Cys Glu Asp Ser Cys Arg

2465 2470  2475

Ser Gly Phe Thr Tyr Val Leu His Glu Gly Glu Cys Cys Gly Arg

2480 2485 2490

Cys Leu Pro Ser Ala Cys Glu Val Val Thr Gly Ser Pro Arg Gly

2495 2500 2505

Asp Ser Gln Ser Ser Trp Lys Ser Val Gly Ser Gln Trp Ala Ser

2510 2515  2520

Pro Glu Asn Pro Cys Leu Ile Asn Glu Cys Val Arg Val Lys Glu

2525  2530 2535

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Val Lys Val Gly Ser Cys Lys Ser Glu Val Glu Val Asp Ile His

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