用于藥物發現的單分子平臺用于包括抗癌和抗病毒劑的發現的藥物發現的方法和裝置的制作方法

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專利名稱：用于藥物發現的單分子平臺用于包括抗癌和抗病毒劑的發現的藥物發現的方法和裝置的制作方法
技術領域：
本發明涉及耙向包括DNA聚合酶、RNA聚合酶和逆轉錄酶的酶的藥物候選物的篩選和驗證。
背景技術：
在臨床使用中，大約百分之三十的藥物抑制疾病相關酶促過程(瑞.艾.科普蘭(Copeland，R.A.),藥物發現中的酶抑制劑的評估藥物化學家和藥理學家指南(Evaluation of enzyme inhibitors in drug discovery: a guide for medicinal chemists and pharmacologists).(威立國際-牛學公司 (^Wiley-Interscience )， 2005))。因此，新穎酶抑制劑的發現是生物化學和藥理學中的重要研究領域。
聚合酶抑制劑在臨床和研究設定中具有價值。這些抑制劑有助于闡明轉錄和DNA復制的機理方面，有助于繪制結構-功能關系，且有助于表征蛋白質活性。聚合酶抑制劑還是最吸引人的藥物靶之一。關于這些抑制劑、其結構和其機制的知識使得能夠設計將有效抵抗新病原體和已知病原體的抗生素抗性突變體的新藥物，諸如抗癌劑、抗病毒劑和抗生素。因為已報道這些抑制劑中的一些誘導和/或抑制細胞凋亡，所以其也提供用于研究細胞凋亡的有價值工具。同樣，因為這些藥劑中的一些阻斷DNA轉錄的特定步驟，所以聚合酶抑制劑可有助于闡明在各種健康和疾病狀態下轉錄控制在調控靶基因表達中的作用。
靶向特定疾病路徑所涉及的聚合酶蛋白質的藥物為本領域所熟知。舉例來說，逆轉錄酶抑制劑(reverse transcriptase inhibitors, RTI)是一種通過抑制逆轉錄酶的活性而耙向病毒DNA的構建的抗逆轉錄酶病毒藥物。存在兩種具有不同作用機制的RTI亞型核苷和核苷酸類似物RTI被并入病毒DNA中，從
4而導致鏈終止，而非核苷類似物RTI則充當逆轉錄酶的竟爭性抑制劑。當前通過抑制fflV逆轉錄酶而起作用的AIDS治療劑在本領域中有所描述(參見例如，賓(Bean)等人，應用與環境微生物學(Appl Environ Microbiol) 72:5670-5672
(2005 ))，且包括依發韋侖(Efavirenz)(商標名稱SUSTIVA⑧和STOCRIN ) 和奈韋拉平(Nevirapine)(也以商品名稱VIRAMUNE辦肖售)。耙向聚合酶蛋白質(例如利福平(rifampin))的抗生素和耙向聚合酶蛋白質(例如順柏
(cisplatin ))的癌癥藥物也為本領域中所已知。
已發現許多藥物有效治療癌癥。這些藥物包括不同化合物，諸如抗代謝物
(例如，曱氨蝶呤(methotrexate)和氟尿嘧吱(fluorouracil))、 DNA損傷劑
(例如，環磷酰胺(cyclophosphamide )、順鉑和阿霉素(doxorubicin))、有絲分裂抑制劑(例如，長春新堿(vincristine ))、核苷酸類似物(例如，6-巰基噪呤)、DNA修復所涉及的拓樸異構酶的抑制劑(例如，依托泊苷(etoposide))、 DNA聚合酶的抑制劑(例如，博萊霉素(bleomycin))和嵌入劑(intercalating agent, ^口米4乇'蒽酉昆(mitoxantrone))。
目前，正在研究數種靶向哺乳動物DNA復制的酶的藥物來作為用于癌癥化學療法的有前途候選物或作為用于了解特定酶在DNA復制和修復中的作用的探針。這些潛在藥物候選物包括補骨脂曱素(corylifolin)、補骨脂酚
(bakuchiol)、白藜聲醇(resveratrol )、新補骨脂異黃酮(Neobavaisoflavone) 和黃豆苦元(daidzein)(參見孫(Sun)等人，天然產物化學雜志(J. Nat. Prod.) 61,362-366 ( 1998))。
DNA和RNA聚合酶抑制劑的其它實例包括放線菌素D( Actinomycin D )、鏈霉菌屬的種(浙e/7tom戸s sp.); a-鶴膏毒肽(a-Amanitin )、我鳥膏屬(爿應w'to sp.);阿非迪霉素(Aphidicolin)、 HSV復制抑制劑、BP5; a-鵝膏毒肽油酸曱酯；新生霉素(Novobiocin).鈉鹽；利福平；RNA聚合酶III抑制劑；和7-氨基-放線菌素D。目前在II期試驗中用于抵抗丙型肝炎病毒的三種聚合酶抑制劑是艾德尼克斯公司/諾華公司(Idenix/Novartis )的瓦洛他濱(valopicitabine )
(NM283 );維諾公司(ViroPharma)的HCV-796;和羅氏公司(Roche)的 R1626。羅氏公司(Roche)/艾德尼克斯公司(Idenix)也在作為HBV治療初始成功后的II期HCV試驗中研究伐托他濱(valtorcitabine， val-LdC )，第一鏈病毒DNA合成抑制劑。
DNA損傷劑提供一些用于癌癥的最成功治療。多聚(ADP-核糖)聚合酶 (即PARP)可有助于修復由用于治療癌癥的DNA損傷劑引起的DNA損傷。因為PARP活性常常在癌細胞中增加，所以其提供這些細胞的存活機制。舉例來說，ABT-888 (雅培腫瘤學公司(Abott Oncology ))是由雅培公司(Abbott) 開發用于防止癌細胞中的DNA修復且增加常見癌癥療法(諸如放射和烷基化劑)的有效性的口服PARP抑制劑。此外，臨床前數據表明ABT-888改善放射和許多類型的化學療法在動物癌癥模型中的有效性。
這些選自最近5年的公開出版物說明關于聚合酶抑制劑的活性、機制和生物化學的當前技術水平
杰艾布朗(Brown JA),威瓦.杜姆(DuymWW),杰德福勒 (Fowler JD )，佐.索(Suo， Z.) . (2007)"在由人類DNA聚合酶X和卩催化的縫隙填補合成期間8-氧代-7，8-二氫-2'-脫氧烏苷的誘變潛力的單轉換動力學分才斤 (Single-turnover Kinetic Analysis of the Mutagenic Potential of 8國Oxo-7，8-dihydro-2'-deoxyguanosine during Gap-filling Synthesis Catalyzed by Human DNA Polymerases lambda and beta)."分子生物學雜志(J Mol Biol.)[電子出版先于印刷]。
佐.索(Suo，Z.),瑪艾阿卜杜拉(AbdullahMA) . (2007)"丙型肝炎病毒NS2-3蛋白酶的獨特復合活性位點抗病毒藥物設計的新時機(Unique Composite Active Site of the Hepatitis C Virus NS2- 3 Protease: a New Opportunity for Antiviral Drug Design).，，化學與醫藥化學(ChemMedChem.) 2(3), 283-284。
瑪.普.勒特格(RoettgerMP),卡.瑪費埃拉(FialaKA),斯.桑帕理(Sompalli S )，伊.東(Dong Y)，佐索(Suo Z) . (2004)"人類DNA 聚合酶mu的保真度的穩態前動力學研究(Pre-steady-state kinetic studies of the fidelity of human DNA polymerase mu)"，生物化學(Biochemistry) 43(43)， 13827-38。
卡.瑪.費埃拉(FialaKA)，威.阿布戴爾-加瓦德(Abdel-Gawad W), 佐.索(SuoZ) . (2004)"由截短人類DNA聚合酶人催化的聚合的保真度和
6機制的穩態前動力學研究(Pre隱steady-state kinetic studies of the fidelity and mechanism of polymerization catalyzed by truncated human DNA polymerase lambda).，，，生物化學(Biochemistry) 43(21), 6751-62。
卡.瑪費埃拉(Fiala,K. A)和佐索(SuoZ) .* (2004)疏磺礦疏化葉菌P2 DNA聚合酶IV的保真度的穩態前動力學研究(Pre-Steady State Kinetic
學(Biochemistry) 43,2106-2115。
卡瑪.費埃拉(Fiala，K.A)和佐索(Suo Z ) .* (2004)由碌u^礦硫化葉菌P2 DNA聚合酶IV催化的DNA聚合的4幾制(Mechanism of DNA
物化學(Biochemistry ) 43,2116-2125。
卡.瑪.費埃拉(Fiala,K.A),威.阿布戴爾-加瓦德(Abdel-Gawad, W.) 和佐.索(Suo Z) * ( 2004 )由截短人類DNA聚合酶X催化的聚合的保真度和機制的穩態前動力學研究(Pre-Steady國State Kinetic Studies of the Fidelity and Mechanism of Polymerization Catalyzed by Truncated Human DNA Polymerase Lambda).生物化學(Biochemistry),已接收和付印。
阿杰艾力森(Allison, A. J.)，艾'雷(Ray,A.)，佐索(SuoZ..), 杰.瑪.哥拉仙奴(Colacino, J. M.)，卡.斯.安德森(Andeson, K. S.)，卡'艾'約翰遜(Johnson, KA.) (2001 )"抗病毒核苷類似物和人類線粒體聚合酶的毒性 (Toxicity of Antiviral Nucleoside Analogs and the Human Mitochondrial DNA Polymerase)",生物化學雜志(J. Biol. Chem.) 276,40847-40857。
新藥物是長期且復雜的藥物開發工藝的產物，其中第一步是發現具備有前途活性的化合物。新穎酶抑制劑可通過篩選抵抗靶酶的藥物候選化合物的文庫來發現。常規藥物篩選和驗證方法利用微米級到毫米級生物化學或細胞測定來檢測酶促干擾的下游生物化學或細胞特征。鑒于常規藥物篩選方法的局限性，本領域中仍需要用于^r測有前途的藥物候選物的方法和裝置。

發明內容
本申請揭示了用于單分子藥物篩選、發現和驗證的方法和裝置。這些方法和裝置允許使用者使用單分子的觀察結果快速檢測藥物候選物是否和如何干擾特定疾病路徑所涉及的靶酶。本文所述的方法和裝置利用單分子操縱和檢測技術(例如，光4聶或磁4聶)來直接檢測靶酶-底物相互作用的特征動力學或"機
械特征(mechinal signature )"是否實質上由藥物候選物改變或調節。此外，所述方法和裝置適用于分析機械特征的調節以便鑒別藥物候選物的潛在干擾機制。
本發明的一方面中，本文所揭示的方法和裝置涉及監測在抑制或者調節聚合過程的藥物候選物存在下個別聚合酶分子(例如DNA聚合酶、RNA聚合酶和逆轉錄酶)沿多核苦酸底物的實時動力學機械特征。所述藥物候選物的鑒別和分析對于抗病毒、抗癌和抗生素藥物的發展至關重要。

圖1說明本發明的用于篩選多種靶向特定酶的藥物候選物的方法方面的示例性流程圖。
圖2說明在各種藥物候選物(諸如聚合酶抑制劑)存在下DNA聚合酶的示例性機械特征。圖2的A板(panel)展示預期來自不存在聚合酶抑制劑的對照樣品的代表信號。在這種情況下，聚合酶結合單鏈(ss) DNA且將這個模板轉化為雙鏈(ds)DNA，從而穩定地隨時間縮短總模板長度。B板展示預期來自將指示藥物候選物已減慢復制過程的光鑷裝置的示例性機械特征。應注意，對應于聚合速度的模板長度圖(plot)的總斜率已變小。C板展示來自指示藥物候選物已誘導失敗轉錄/提前終止的光鑷裝置的示例性機械特征，其中所述藥物候選物在其正常完成點前突然中止或停止復制過程。D板展示來自指示DNA復制起始由藥物候選物抑制的光鑷裝置的示例性機械特征。E板展示來自指示藥物候選物誘導聚合酶以核外溶解(exonucleolysis )模式操作的光鑷裝置的示例性機械特征，其中其切去堿基而不是使堿基對聚合。這個特征將僅可能出現于具有活性核外溶解或"校對"位點的聚合酶中。
圖3說明本發明的用于篩選多種靶向特定聚合酶的藥物候選物(包括DNA 和RNA聚合酶抑制劑以及逆轉錄酶抑制劑)的方法方面的示例性流程圖。
圖4a說明用于通過基于光鑷的單分子測量系統獲得對聚合酶沿核酸模板的位置的測量的示例性實驗幾何形狀。此時，DNA分子保持固定且當聚合酶沿DNA模板移動時，所迷分子在兩個塑料膠乳珠粒之間延伸。在DNA復制
8的情況下，兩個珠粒之間的距離在特定力下減小，因為模板DNA從單鏈轉化為雙鏈DNA。將核酸附著于珠粒的方法可通過抗生蛋白鏈菌素-生物素或地高辛(dig) -抗-dig或其它共價鍵進行。
圖4b說明用于通過基于光鑷的單分子測量系統獲得在由聚合酶加工核酸時核酸的長度的另外示例性實驗幾何形狀。此時，DNA分子保持固定且在塑料膠乳珠粒與抗生蛋白鏈菌素包被的(三角形)玻璃表面之間延伸。當在DNA 復制中聚合酶沿DNA模板移動時，DNA范圍的長度在特定力下減小，因為固定的模板DNA從單鏈轉化為雙鏈DNA。
圖4c說明本發明的一個實施方式，其中核酸模板附著于通過左側所示的第二固定光阱(optical trap)固持的電介質珠粒，所述光阱發揮比聚合酶對核酸模板所施加的力大得多的強捕獲力。此時，通過相關親和力化學使聚合酶附著于另一珠粒。圖4-d證明核酸如何可通過核酸模板與剛性表面的互補功能化作用而固定于諸如蓋玻片或微孔板的剛性表面上，同時再次使聚合酶附著于第二個珠粒。
圖5a示意地說明單分子檢測系統，其包括包含捕獲、力檢測、波束控制 (beam steering)和等張力能力的代表性光鑷裝置和維持所捕獲的珠粒上的恒力(甚至當珠粒由于聚合酶的酶促活性而經受其它力時)的力反饋光學捕獲子系統。
圖5b說明單分子跟蹤系統中的檢測系統,通過所述系統利用四象限光電二極管來檢測電介質球距離光阱中心的位移。將珠粒相對于光阱的位置記錄在這個四象限光檢測器上。 -使用從這個光井(optical well)中心產生的偏移來量化作用于珠粒的皮牛頓(picoNewton)大小的力。
圖6a和圖6b說明證明用光鑷裝置觀察DNA聚合酶馬達在沿DNA模板向前(聚合，圖6a)和向后(核酸外切酶活性，圖6b)移動時的動力學的能力的數據。約0.5微米/分鐘的速度對應于約25個聚合的堿基對/秒。在所述圖中，聚合酶沿DNA的位置是以時間函數展示。斜率給出在特定力下DNA模板在復制時的長度的變化速率。這正是聚合酶馬達的單分子速度。
圖7說明探測DNA聚合的更精細結構動力學的能力。為達到這個分辨率程度，優選利用聲光偏轉器系統來達到在聚合期間沿DNA鏈的等張力條件。在所述圖中，展示DNA的延長(pm)與時間(min)的關系。在左圖中，黑線展示完整數據集，包括在收縮(右側方框區域)開始前由流動引起的松弛(左方框區域)。在右圖中，展示收縮區域的延長與時間的關系。原始數據線展示原始長度-時間數據，而平滑線展示這個數據的100-pt鄰近平均值。直線表示這個收縮區域中的平均斜率，約300個堿基對/秒。圖8說明藥物篩選和發現的常規方法的關鍵特點。圖9說明本文所述的新穎藥物篩選和發現技術的關鍵特點。圖10說明本文所述的新穎藥物篩選和發現技術與藥物篩選和發現的常規方法相比的一些優點。
具體實施例方式
DNA和RNA聚合酶和逆轉錄酶(RT)抑制劑在臨床和研究設定中具有價值。這些抑制劑有助于闡明轉錄和DNA復制的機理方面，有助于繪制結構-功能關系，且有助于表征蛋白質活性。這些聚合酶和RT抑制劑還是最吸引人的藥物靶之一。關于這些抑制劑、其結構和其機制的知識使得能夠設計將有效抵抗新病原體和已知病原體的抗生素抗性突變體的新藥物，諸如抗癌劑和抗生素。因為已報道這些抑制劑中的一些誘導和/或抑制細胞凋亡，所以其也提供用于研究細胞凋亡的有價值工具。同樣，因為這些藥劑中的一些阻斷DNA轉錄的特定步驟，所以聚合酶抑制劑可有助于闡明在各種健康和疾病狀態下轉錄控制在調控把基因表達中的作用。
靶向特定疾病路徑所涉及的聚合酶蛋白質的藥物為本領域所熟知。舉例來說，逆轉錄酶抑制劑(RTI)是一種通過抑制逆轉錄酶的活性而靶向病毒DNA的構建的抗逆轉錄酶病毒藥物。存在兩種具有不同作用機制的RTI亞型核苷和核苷酸類似物RTI被并入病毒DNA中，從而導致鏈終止，而非核苷類似物RTI則充當逆轉錄酶的竟爭性抑制劑。當前通過抑制HIV逆轉錄酶而起作用的AIDS治療劑在本領域中有所描述(參見例如，賓(Bean)等人，應用與環境微生物學(Appl Environ Microbiol) 72:5670-5672 (2005 )),且包括依發韋侖(商標名稱SUSTIVA⑧和STOCRIN )和奈韋拉平(也以商品名稱VIRAMUNE⑧銷售)。
已發現許多藥物有效治療癌癥。這些藥物包括不同化合物，諸如抗代謝物
10(例如，曱氨蝶呤和氟尿嘧啶)、DNA損傷劑(例如，環磷酰胺、順鉑和阿霉素)、有絲分裂抑制劑(例如，長春新堿)、核苷酸類似物(例如，6-巰基噪呤)、 DNA修復所涉及的拓樸異構酶的抑制劑(例如，依托泊芬)、DNA聚合酶的抑制劑(例如，博萊霉素)或嵌入劑(如米托蒽醌)。
目前，正在研究數種靶向哺乳動物DNA復制的酶的藥物來作為用于癌癥化學療法的有前途候選物或作為用于了解特定酶在DNA復制和修復中的作用的探針。這些潛在藥物候選物包括但不限于補骨脂曱素、補骨脂酚、白藜,醇、新補骨脂異黃酮和黃豆苷元。(引用孫(Sun)等人)
DNA和RNA聚合酶抑制劑的其它實例包括放線菌素D,鏈霉菌屬；a-鵝膏毒肽，鵝膏屬；阿非迪霉素;HSV復制抑制劑，BP5; a-鵝膏毒肽油酸曱酯；新生霉素，鈉鹽；利福平；RNA聚合酶III抑制劑；7-氨基-放線菌素D。目前在II期試驗中用于抵抗丙型肝炎病毒的三種聚合酶抑制劑是艾德尼克斯公司/諾華公司(Idenix/Novartis)的瓦洛他濱(NM283 );維諾公司(ViroPharma) 的HCV-796;和羅氏公司(Roche )的Rl626。
羅氏公司(Roche)/艾德尼克斯公司(Idenix)也在作為HBV治療初始成功后的II期HCV試驗中研究伐托他濱(val-LdC ),第一鏈病毒DNA合成抑制劑。
DNA損傷劑提供一些用于癌癥的最成功治療。多聚(ADP-核糖)聚合酶 (即PARP )可有助于修復由用于治療癌癥的DNA損傷劑所引起的DNA損傷。因為PARP活性常常在癌細胞中增加，所以其提供這些細胞的存活機制。舉例來說，ABT-888是由雅培腫瘤學公司(Abott Oncology )開發用于防止癌細胞中的DNA修復且增加常見癌癥療法(諸如放射和烷基化劑)的有效性的口服 PARP抑制劑。此外，臨床前數據表明ABT-888改善放射和許多類型的化學療法在動物癌癥模型中的有效性。
新藥物是長期且復雜的藥物開發工藝的產物，其中第一步是發現具備有前途活性的化合物。新穎酶抑制劑可通過篩選抵抗靶酶的藥物候選化合物的文庫來發現。藥物候選物包括自然界中所見的化合物，通過組合化學方法合成的化合物，以及通過合理的藥物設計形成的化合物。常規藥物篩選和驗證方法利用微米級到毫米級生物化學或細胞測定來檢測酶促干擾的下游生物化學或細胞特征。舉例來說，測定可通過放射性標記來測量通過靶酶催化合成的反應產物的量的任何變化。
單分子技術提供相對于用于藥物篩選的常規試管內測定方法的數種關鍵益處，因為其使用較少試劑且提供較多關于藥物作用于靶的機制的斧清。舉例來說，單分子技術使得能夠觀察到瞬時狀態，從而使分離這些步驟的化合物的選擇性篩選成為可能。因此，單分子方法使得能夠鑒別、檢驗和驗證靶向生物化學過程中的關鍵階段(例如，轉錄或復制起始)的聚合酶或酶抑制劑。許多生物化學過程由多個瞬時步驟組成，諸如轉錄中的啟動子結合、起始、延伸和終止。因為潛在藥物靶的總數可能極高，所以單分子方法提供通過在早期僅致力于藥物篩選和發現工藝中受藥物候選物影響最大的那些步驟來加速所述工藝的關鍵優點。
通過闡明DNA/RNA復制、修復所涉及的酶的動力學機制，可基于合理的
藥物設計來鑒別抗病毒和抗癌藥物候選物。動力學研究使用各種穩態前動力學
方法，包括快速化學中止流動(quench-flow)和停流(stopped-flow)技術。
這些方法允許反應中止幾毫秒，iU是供比傳統穩態動力學方法更多的動力學信息。單分子技術闡明在酶的活性位點處進行的反應的基本步驟且可顯著增強合
理的藥物設計。
每個人體細胞中的DNA每天自發地受損10,000次以上。DNA修復對維持細胞中的基因組完整性起主要作用。
對于生物恐怖分子有可能釋放天花的擔心已導致密集地努力尋找有效抑制尚不存在的病毒感染的分子。因為天花病毒(smallpox virus/variola virus )和天花疫苗(牛痘病毒)高度同源，所以后者已用作極好的代替模型。舉例來說，牛痘病毒DNA聚合酶與天花病毒中的聚合酶約99%—致。
丙型肝炎病毒已感染至少2-3°/。的人口。已集中研究病毒基因組復制。RNA依賴性RNA聚合酶NS5B是病毒復制的核心，且是主要抗病毒藥物靶。盡管存在對這個聚合酶的廣泛生物化學和穩態動力學研究，但由NS5B催化的核苷酸合并的基本步驟仍然不明確。這些研究調查使核苷抑制劑的合理設計成為可能。 -
在最近十年中，已開發出新工具(例如光鑷、原子力顯微術和小玻璃纖維)
12來操縱小物體以及研究所研究的系統所涉及的力(參見例如，史密斯(Smith)等人，科學(Science )271:795 ( 1996 )和克魯澤爾(Cluzel )等人，科學(Science)271,795 ( 1996))。尤其，光或磁"鑷"或"阱"用通過光強梯度所產生的力捕獲粒子，且可用于在單分子水平上操縱和研究顯微鏡可見的分子。強到足以形成三維阱的用光學方法所產生的力可通過用高數值孔徑透鏡使具有適當成形波陣面的激光束達到緊密焦點來獲得。光學捕獲的原理為本領域所熟知且總結于(例如)諾埃曼(Neuman)和布洛克(Block),科學儀器研究(Rev. Sci.Instr.) 75:2787-2809 ( 2004)中。
在生物科學中，已使用光鑷來測量在尺寸范圍為lOnm到超過lOOmm的分子的nm范圍內的位移。為大多數光鑷生物物理學實驗所通用的是電介質珠粒附著于生物分子(例如底物和/或酶)，以致所述生物分子可由光阱操縱且可進行機械測量。各種生物化學和分子生物學方法為用于將核酸、其它底物、酶和其它生物大分子附著于功能化表面和珠粒的技術所已知。舉例來說，DNA可用將結合市售的包被抗生蛋白鏈菌素、微米涂層的電介質球(例如，來自邦斯實驗室(Bangs'Laboratories))的生物素部分進行標記。
如DNA和RNA聚合酶的分子馬達的研究(參見例如，達文波特(Davenport)等人，科學(Science) 287:2497-2500 (2000);馬耶爾(Maier)等人，PNAS97:12002-12007 ( 2000 );王(Wang)等人，科學(Science ) 283:902-907 ( 1998 );懷特(White)等人，自然(Nature) 404:103-106 (2000);和殷(Yin)等人，科學(Science) 270:1653-1656- ( 1995 ))。舉例來說，研究人員已能夠測量"拉開"雙鏈DNA所必需的力的序列依賴性(沃爾伽拉基斯(Voulgarakis)等人，納米通訊(Nano Letters) 6,1483-1486 (2006))。另外，使用光鑷來闡明運動蛋白沿微管移動的機制(郭(Kuo)和希茲(Sheetz),科學(Science) 260, 232(1993)和布洛克(Block)等人，自然(Nature) 348， 348-352 ( 1990))。最近，研究人員以單堿基對分辨率檢測RNA聚合酶沿DNA分子的步進動作(阿邦丹謝里(Abbondanzieri)等人，自然(Nature) 438,460-465 (2005))。在納米生物公司(Nanobiosym)，已利用高分辨率光鑷在實驗上證明各種環境因素對聚合酶的動力學的作用(高爾(God)等人，自然(Nature),已付印的納
13米技術綜述文章(Nanotechnology review article in press ))。
在所有所述研究中，都利用光^l聶直接測量底物-酶相互作用的機械動力學。在這些研究中，所采用的實驗設置和測量的詳情取決于所涉及的酶和/或底物的生物功能。舉例來說，所關注的機械測量可包括底物聚合物的彈性，包括拉伸和松弛動力學；酶(諸如結合核酸的聚合酶)"加工"線性底物的時間依賴性速度；由酶促結合引起的底物的變形；和/或底物結合和加工的效率或準確度。通過將位置和/或力感應子系統整合到光鑷裝置中，使所有所述測量成為可能。
本文揭示用于單分子藥物篩選、發現和驗證的新穎方法和裝置。這些方法和裝置允許使用者在單分子水平上快速^f企測藥物候選物是否和如何千擾特定疾病路徑所涉及的酶-底物相互作用。尤其是，可觀察到候選物藥物與單靶酶分子之間的相互作用。本文所述的方法和裝置利用單分子操縱技術(例如光或磁鑷或阱)在單分子水平上直接檢測藥物候選物是否可用機械方法或用化學方法改變酶-底物相互作用。
在一優選實施例中，可利用本發明的方法和裝置來快速篩選、檢驗和驗證修飾、抑制或者干擾諸如DNA聚合酶、RNA聚合酶和RNA逆轉錄酶等聚合酶的新藥物候選物且較好地闡明抑制聚合酶/底物相互作用的機制。
對底物的正常酶促活性產生動力學"機械特征(mechanical signature )，，。如本文所使用，術語"機械特征"指的是酶的單分子在與其底物相互作用時的生物機械痕跡。所述生物機械痕跡可使用可檢測nm范圍內的位移的儀器(諸如光鑷)來測量。如上文所述，這個動力學機械特征可通過進行"機械測量"，例如通過測量以下變化來確定底物聚合物的彈性，包括拉伸和松弛動力學；酶(諸如結合核酸的聚合酶)"加工，，線性底物的時間依賴性速度；由酶促結合引起的底物的變形；和/或底物結合和加工的效率或準確度。
如本文所使用，術語"機械測量"意指對底物-酶相互作用的機械動力學的測量，其中所述機械測量檢測靶酶的單分子和/或所述靶酶的底物的單分子的機械特征。"進行機械測量"包括(例如)測量以下變化底物聚合物的彈性，包括拉伸和松弛動力學；酶(諸如結合核酸的聚合酶)"加工，'線性底物的時間依賴性速度；由酶促結合引起的底物的變形；和/或底物結合和加工的效率或準確度。
優選"機械測量"是對逆轉錄酶、DNA聚合酶或RNA聚合酶沿多核苷酸 (例如DNA或RNA )底物的移動的測量。因此，在下文更詳細i侖述的所述方法的特定實施例中，通過光學捕獲技術來監測在藥物候選物存在和不存在下聚合酶沿核S吏序列的實時單分子動力學。本文未明確描述、但也可通過單分子枱r 測技術(例如光鑷)測量的聚合酶/底物相互作用的其它機械測量也是有可能的。
機械測量可在藥物候選物存在或不存在下進行。"基線機械特征"是通過在藥物候選物不存在下進行的機械測量確定的機械特征。
如本文所使用，術語"耙"或"藥物耙"指的是疾病路徑所涉及的生物分子。抑制或者千擾所述靶的活性可有益于治療和/或預防所述疾病。如本文所使用，術語"靶酶"指的是疾病路徑所涉及的酶。通常，靶酶是對疾病狀況或
所涉及的關鍵酶。"耙酶的活性"意指所述耙酶與靶酶的底物的相互作用。
適合于本發明的靶酶包括結合DNA和/或RNA且與DNA和/或RNA相互作用的酶。實例包括聚合酶，諸如DNA聚合酶、RNA聚合酶和逆轉錄酶；拓樸異構酶；促旋酶；核酸外切酶；和解旋酶。靶酶可為人類酶，舉例來說，諸如癌癥的疾病路徑所涉及的人類酶。在另一實施方式中，靶酶可為病毒或細菌酶，諸如病毒和/或細菌介導的疾病所涉及的病毒或細菌酶。也涵蓋其它4效生物酶作為適合于本發明的輩巴酶。
優選把酶為聚合酶，諸如DNA聚合酶、RNA聚合酶或逆轉錄酶。癌癥路
徑所涉及的聚合酶，特別是人類癌癥路徑所涉及的人類DNA聚合酶尤其優選。病毒介導的疾病路徑所涉及的聚合酶，特別是人類的病毒介導的疾病路徑所涉
及的病毒逆轉錄酶(例如嗜肝DNA病毒(hepadnaviral)逆轉錄酶，諸如乙型肝炎逆轉錄酶，和逆轉錄酶病毒逆轉錄酶，諸如HIV-1逆轉錄酶)也尤其優選。
本發明也適合于篩選可與疾病路徑所涉及的非酶靶相互作用的藥物候選物。非酶靶的代表性實例為微管和核糖酶(諸如核糖體)。尤其是，核糖體使用RNA作為模板來構造多肽鏈，且因此可被視為巨酶。
如本文所使用，術語"靶酶的底物"(或"酶底物"或"底物")指的是靶酶產生作用的分子。酶催化涉及一種或一種以上底物的化學反應。酶底物為本領域所熟知。
優選底物包括聚合酶底物，諸如多核香酸(例如DNA和RNA )。多核苷酸底物在本文中又稱為多核苷酸或核酸"模板"。多核苦酸底物可為雙鏈或單鏈DNA或RNA序列。
如本文所使用，術語"藥物候選物"或"候選物"指的是可抑制或者干擾靶(尤其是靶酶)的活性的化合物。藥物候選物包括自然界中所見的化合物，通過組合化學方法合成的化合物，以及通過合理的藥物設計形成的化合物。藥物候選物的實例包括與多核苷酸(例如DNA和/或RNA)相互作用或可與其相互作用的化合物，和/或干擾或可干擾與多核苦酸相互作用的酶的活性的化合物。所述化合物可為已知或潛在DNA改性劑，包括DNA損傷劑(例如干擾核酸結構的嵌入劑)；DNA彎曲劑；錯配結合蛋白；和/或烷基化劑。
在另一實施例中，藥物候選物可為與疾病路徑所涉及的非酶耙相互作用或可與其相互作用的化合物。實例包括與微管和/或核糖體相互作用或可與其相互作用的化合物。
接著描述可通過本發明方法探測的藥物候選物的一些示例性種類。第一，數種抗生素藥物適合于由本發明方法進行詢問，包括抑制或者干擾細菌聚合酶
(諸如細菌DNA聚合酶、細菌RNA聚合酶(例如利福平)和/或細菌逆轉錄酶)的活性的藥物。第二，本發明方法也可用于快速篩選、4企驗和-驗證抑制或以某種方式干擾病毒聚合酶(特別是病毒逆轉錄酶)的新穎抗病毒藥物候選物
(例如依發韋侖和奈韋拉平)，且較好地闡明抑制RNA-逆轉錄酶相互作用的機制。第三，數種抗癌藥物也適合于由我們的方法進行詢問。這些藥物包括抑制或者干擾DNA聚合酶、RNA聚合酶、拓樸異構酶、核糖體和/或微管的活性的藥物(例如微管拮抗劑，諸如長春新堿和紫杉醇(taxol))。另外，也可通過本文所述的我們的方法來發現和闡明迄今未知的完全新穎的藥物機制。
如本文所使用，術語"單分子檢測裝置"(或"單分子檢測設備")指的是可用于在單分子水平上進行酶-底物相互作用的機械測量的裝置。適合于本發明的單分子檢測裝置包括用于磁性或光學捕獲(例如光鑷)、高分辨率熒光成像聯合量子點標記和原子力顯微術的裝置。可容易設想其它裝置和本文所揭示
16的裝置的變型。
優選單分子檢測裝置為包含光阱或光鑷的裝置。
本文所述的方法，雙NANO-VALIDTM通過直接的單分子觀察結果來確定藥物候選物是否改變靶酶的正常"機械特征"，從而代替用于酶促干擾的下游效應的篩選。此外，本文所述的方法使得能夠分析和確定影響酶促動力學的機制。所述方法利用單分子操縱、檢測和分析裝置來確定藥物候選物是否和如何以指示酶促抑制的方式調節這個"機械特征"。
NANO-VALIDTM篩選工藝中的第一步是選擇捕捉把酶的功能且可在單分子水平上可靠地測量的機械特征。下文中，我們更詳細論述適合于可用單分子檢測和操縱技術提取的特定種類的酶的示例性特征。NANO-VALIDtm方法中的第二步是用實驗方法確定在任何抑制劑(包括藥物候選物)不存在下靶酶的正常基線機械特征。如上文所討論，通過使用單分子檢測裝置進行機械測量來確定所述基線機械特征。由于所述方法的單分子性質，這可涉及采用數個實驗的總平均值。下文中，我們論述使得能夠單分子機械測量數種酶的動力學的示例性技術和裝置。
為篩選各藥物候選物，用相同實驗技術和裝置且在與用于確定基線機械特征的條件相同的條件下進行耙酶的所選機械測量，但在單分子測定中存在所述藥物候選物。視靶酶的性質而定，可能需要首先將靶、靶的底物或兩者與藥物候選物一起培養一段受控時期，隨后進行此測量。
接著，進行廣泛信號處理以比較候選物特異性機械特征與基線機械特征。下文中，我們詳細論述這種適合于各種酶的分析的示例性變型。如果檢測到與所述特征并無明顯偏差，那么排除候選物而不必使其經受進一步篩選。這一特點徹底地減少與藥物候選物篩選、檢驗和驗證相關的時間和成本，因為可在工藝中更早地，在昂貴臨床試驗開始前更長時間即將失敗的藥物候選物從檢驗中排除。這導致在更早期選擇更多特定藥物候選物，以致僅使那些更有可能成功的候選物進入臨床試驗。在藥物發現工藝早期的這個增加的選擇性標準與常規藥物驗證和發現方法相比顯著減少單分子藥物發現工藝的成本和時間。
然而，如果檢測到與基線機械特征存在明顯偏差，那么進行進一步分析和加工以鑒別干擾的潛在機制。下文中，我們詳細論述這種適合于各種酶的二次
17分析的特定實施例。如果所鑒別的機制不是疾病路徑所需的，那么排除候選物而不必使其經受進一步篩選。否則，認為候選物可用于進一步篩選和驗證。
圖1中總結了這種NANO-VALIDtm工藝。用于聚合酶耙的NANO-VALIDTM
這里我們描述NANO-VALID方法的優選實施例，其適合于篩選耙向聚合酶的藥物候選物。圖3中總結了所述實施例。在這個方法實施例中，始終在步驟1中選擇聚合酶沿核酸模板的時間依賴性位置以便隨后在步驟2和步驟3a 中進行測量。
聚合酶主要以線性方式加工核酸模板。因此，所有聚合酶所通用的機械特征是聚合酶沿這個底物的線性進程。當所述核酸模板與固定線對準且保持恒定張力時，接著聚合酶的進程僅與聚合酶沿這個作為時間函數的固定線的位置有關。
在抑制劑不存在下，聚合酶通常在起始點處結合，以相對恒定速度繼續進行且接著終止聚合。一些次要的隨機行為通常在正常聚合的過程中出現。這些異常可包括大約幾毫秒或更短時間的短暫中止、大約小于100個堿基(20-55 納米，取決于實驗條件)的短暫換向，和大約每秒幾百個堿基對的聚合速度變化。
圖6中展示證明用光鑷裝置觀察DNA聚合酶馬達在沿DNA模板向前(聚合)和向后(核酸外切酶活性)移動時的動力學的能力的數據。約0.5微米/ 分鐘的速度對應于約25個聚合的堿基對/秒。在不希望受理論束縛的情況下，推測聚合酶抑制劑通過數種機制中的一種沖擊DNA聚合酶(DNAp ),每一機制在模板長度-時間圖和/或聚合速度-時間圖中具有不同"機械特征"。可分析所述圖以鑒別所述機制。另外，可能存在到此為止未預見到的其它完全新穎的機制，其也可能通過本文所述的我們的方法來發現。
圖2說明哪種聚合可能看來像存在或不存在藥物候選物。應注意對于所示的圖，起始點是y = 200 pm且假定聚合酶在約200分鐘內從右側(y = 200 pm ) 移動到左側(y = 0 iam)。當藥物候選物干擾聚合酶靶時，明顯以數種方式中的一種影響所述聚合酶沿核酸模板的動力學，所述方式可包括調節聚合速率，使酶不能結合或聚合，改變酶的連續性，改變酶對所述模板的結合親和力，或改變酶的序列依賴性保真度。這些情況的每一種都產生不同于正常聚合的機械
特征。因此，用于聚合酶靶的NANO-VALIDTM方法的這一優選實施例使用酶的時間依賴性位置作為步驟2和步驟3a中的機械特征(參見圖3， NANO-VALIDTM藥物篩選和驗證工藝圖)。圖2b展示將指示藥物候選物已減慢聚合過程的示例性機械特征。應注意，對應于平均聚合速度的圖的平均斜率已變小。一些DNA聚合酶抑制劑可(例如)僅通過減慢DNA復制的總速度來起作用。這個痕跡將指示通過這種機制起作用的聚合酶抑制劑藥物候選物。圖2c展示指示藥物候選物已誘導提前終止的示例性機械特征，其中所述藥物候選物已在其正常完成點之前突然中止或停止聚合過程。一些DNA聚合酶抑制劑候選物可通過所述機制來起作用。這個痕跡將指示通過這種機制起作用的聚合酶抑制劑藥物候選物。圖2d展示指示聚合酶的起始受藥物候選物抑制的示例性機械特征。這個痕跡將指示通過這種機制起作用的聚合酶抑制劑藥物候選物。圖2e展示指示藥物候選物誘導聚合酶以核外溶解模式操作的示例性機械特征，其中其切去堿基而不是使堿基對聚合。這個標記將僅可能出現于具有活性核外溶解或"校對"位點的聚合酶中。這個痕跡將指示通過這種機制起作用的聚合酶抑制劑藥物候選物。
為避免錯誤的篩選結果，用于NANO-VALIDTM方法的這一實施例的機械特征應按照遠超過正常聚合的隨機事件的尺度的長度和時間尺度。通常，對于大多數聚合酶來說，應在所選實驗條件下在使靶穿越至少5000個堿基或堿基對的核酸模板的時間窗口上采集機械特征。
在優選實施例中，我們利用軟件算法來實施步驟3b,以致我們可在步驟 3c中以高準確度確定是否應排除藥物候選物。
正常聚合的隨機性質要求我們在步驟2和3a中選取聚合酶動力學的顯著特點，而不是使用或比較原始數據痕跡。靶酶的性質以及所需干擾機制將決定選取和分析哪些顯著特點。這些特點可包括馬達暫停的總時間、終點聚合速度、終止效率、平均速度。通常，對于所有聚合酶來說，截止頻率為100-1000 Hz的低通濾波器也將應用于原始信號以濾除酶的動力學中隨機波動的效應。
使用模板長度測量的用于DNA聚合酶靶的NANO-VALID
這里，我們描述先前所述的適合于作用于單鏈DNA模板的DNA聚合酶靶的NANO-VALIDtm方法的變型實施例。單鏈DNA模板中的每一堿基在標準環境條件下和約0-1 pN的恒定模板張力下具有約0.7 nm的長度。DNA聚合酶將模板上的每一未配對的堿基轉化為在相同環境和恒定張力條件下具有約 0.34 nm長度的堿基對。因此，在等張力條件下，當DNA聚合酶復制線性模板，從而使單鏈DNA轉化為雙鏈DNA時，兩種狀態的彈性的差異引起DNA 鏈中每一在特定力下聚合的堿基對縮短約0.36nm。因此，在聚合期間在恒定 DNA模板張力下跟蹤DNA鏈的長度類似于跟蹤聚合酶沿固定模板的位置。因此，在這種方法變型的步驟2和步驟3a中，直接通過單分子測量裝置所獲得的機械特征是DNA模板隨時間的長度。先前對于分析步驟3b和步驟3d中聚合酶的位置和速度所述的信號處理方法可再次用于這種變型方法中。
用于執行藥物候選物的NANO-VALIDTM篩選的裝置
這里，我們描述本發明的用于執行NANO-VALIDtm方法的裝置方面，所述裝置方面包含通過快速端口 (例如USB端口 )與個人計算機連接的單分子測量系統，所述個人計算機允許接近實時數據采集和控制所述單分子裝置系統。參見圖9a和步驟9b。通過軟件驅動器，控制這個裝置且通過具有圖形使用者界面(graphical user interface, GUI)的常規軟件程序來詢問。在這一實施例中，單分子測量系統將具有用于在單個板(例如96孔微板)上裝載和處理數個個別樣品的容器。所述測量系統將整合溫度控制以確保可靠和可再現的環境條件。測量系統可包含下列中的一個或一個以上原子力顯微鏡、掃描電子顯微鏡等。
為利用所述裝置，使用者將所述板裝入單分子測量中。通過GUI,其將初始化單分子測量系統，包括任何必需校準。接著，使用者將選擇機械特征，和任何關于所述特征的控制參數(例如，測量特征的時間長度)。接著，通過GUl, 其將指導單分子測量系統詢問對照樣品以獲得靶酶的基線機械特征。這種測量的精確執行可能需要一些人工控制和人類使用者通過鍵盤、操縱桿或其它計算機輸入設備來輸入。接著，常規軟件程序將獲得這個特征，且通過信號處理慣例，選取和存儲所述信號的顯著特點。GUI將顯示顯著特點，或許包括原始機械特征痕跡。
接著，GUI將允許使用者穿越板的其余部分，以獲得來自各候選物的機械信號；這可能需要數次個別測量。如前所述，這個特征采集步驟可能需要使用
者直接輸入。在每一步驟中，將獲得原始機械特征，將通過信號處理選取機械特征的顯著特點，將其存儲于計算機存儲器中且向使用者顯示，并與參照基線信號作比較。
用于執行靶向聚合酶的藥物候選物的NANO-VALIDTM篩選的裝置為執行用于聚合酶靶的NANO-VALIDtm方法，有必要使單分子測量裝置準確地捕捉聚合酶沿核酸模板的實時動力學。數種技術可用于完成這種功能。舉例來說，可利用聚合酶的高分辨率熒光成像聯合量子點標記。或者，可利用原子力顯微術來測量這些聚合酶動力學(這是真的)。磁或光"鑷"或"阱" 也可用于在皮牛頓下控制模板張力和測量聚合酶沿DNA模板的納米級位移。可容易設想其它變型。
用于執行靶向聚合酶的藥物候選物的NANO-VALIDTM篩選的基于光鑷的
裝置
在優選實施例中，用于聚合酶靶的NANO-VALIDtm裝置將利用基于光鑷的單分子測量子系統。光鑷用通過光強梯度所產生的力捕獲粒子。強到足以形成三維阱的用光學方法所產生的力可通過用高數值孔徑透鏡使具有適當成形
波陣面的激光束達到緊密焦點來獲得。光鑷技術已廣泛地用于DNA的聚合物特性的單分子研究和生物分子馬達(包括聚合酶)的力依賴性動力學。由于這些廣泛的生物物理學研究，使用光鑷沿等張力核酸模板跟蹤聚合酶的實驗方案已相當成熟且為本領域所熟知(布洛克(Block )等人，自然(Nature )348, 348-352 (1990))。
為沿模板跟蹤聚合酶，有效固定核酸模板的一端，同時將聚合酶分子附著于可電子操縱光鑷裝置中所捕獲的珠粒上。當聚合進行時，設計光阱使其自動移動以維持聚合酶珠粒上的恒力。接著，阱在這些等張力條件下的動力學位置與在聚合期間聚合酶沿模板的動力學相關。這種"力反饋光學捕獲子系統"的優選實施例在下文中廣泛地詳細描述。可容易設想數種其它變型。
圖4展示這一實施例的實驗變型；其在其核酸固定方法方面有變化。在圖 4-C中，使核酸模板附著于通過左側所示的第二固定光阱固持的電介質珠粒，所述光阱發揮比聚合酶對核酸模板所施加的力大得多的強捕獲力。圖4-D證明
21核酸如何可通過核酸模板與剛性表面的互補功能化作用而固定于諸如蓋玻片或微孔板的剛性表面上。
用于使核酸和聚合酶附著于珠粒或其它表面的方法為本領域所熟知；下文給出的一些實例說明完成這種任務的示例性方法。一種所述方法通過標準方法生物素標記核酸或聚合酶，以致其可附著于包被抗生蛋白鏈菌素的微珠(例如，邦斯實驗室(Bang's Laboratories))或包被抗生蛋白鏈菌素的蓋玻片(例如，塞諾泊公司(Xenopore Corporation))上。
用于通過核酸模板長度的單分子測量執行NANO-VALIDTM篩選的基于光鑷的裝置
先前所述的優選裝置實施例可用于執行用于DNA聚合酶沿單鏈DNA模板的變型NANO-VALIDTM方法。如先前所論述，這種方法變型測量DNA模板的長度，從而代替直接跟蹤聚合酶移動。為進行這種方法變型，必須如前所述固定DNA的一端；然而，現在使DNA模板的另一端附著于通過可操縱的恒力光阱詢問的電介質珠粒上。酶仍游離在溶液中。
在這種變型方法中，甚至當模板分子由于聚合而縮短時，阱也將移動以維持DNA模板上的恒力，從而代替阱響應聚合酶沿模板移動的力而移動。如先前所論述，這是幾乎類似的測量。雖然所述方法變型需要樣品制備的微小差異，但這種方法變型既不需要裝置的差異，也不需要控制軟件的差異。圖4a-b概括了用于執行這種方法變型的實驗變型。
力反饋光學捕獲子系統
圖5A說明甚至當所捕獲珠粒由于聚合酶的酶促活性而經受其它力時也會維持所述珠粒上的恒力的光學捕獲系統的示例性設計。通過一系列透鏡和鏡面 (B)使IR激光源(A)聚焦于樣品平面中的位置(xo， yo)。通過雙軸聲光偏轉器(AOD) (L)的偏轉角來確定這個聚焦位置(xo, yo )。樣品載玻片(C ) 上的高斯光束(Gaussian beam)分布捕獲附著于聚合酶(未圖示)或核酸模板 (如圖所示)上的珠粒。
四象限光電二極管或QPD(D)檢測從珠粒散射出的IR信號的干擾圖案，且輸出這個信號的x和y擾動。將這些信號擴增(E),通過數據采集卡(data acquistion card, DAQ)獲得，與個人計算機(G)連接。隨后，以數據采集和分析程序(例如在來自國家儀器公司(National Instruments )的Labview⑧中編程)處理這個數據，以在近納米分辨率下確定珠粒相對于光阱中心的位置和測量珠粒上的以皮牛頓計的捕獲力。(也參見圖5B)
通過靈敏CCD相機(例如，庫克(Cooke)的PixelFly )聯合光學顯微鏡 (F)來捕捉珠粒的直接圖像。常規數據分析計算機程序提供珠粒的納米級位置檢測；圖像分析程序提供樣品平面的圖像，包括所捕獲的珠粒。
在力反饋系統操作(L， K)下，激光對珠粒所施加的力甚至在作用于珠粒的酶促力存在下也保持恒定，從而在阱內移動其位置。這通過確定珠粒相對于激光阱中心的瞬時位置且比較其與參照位置(對應于所捕獲珠粒上的特定力)的軟件程序來完成。將這個當前位置與所需珠粒位置之間的差異轉化為射頻(RF )驅動器(K)輸入到雙軸AOD晶體中的雙通道頻率信號(△&， Afy )。這個射頻在晶體中形成駐波，接著衍射入射的激光束。一級衍射光束的位置隨射頻而變。
因此，激光束可通過控制輸入到AOD晶體中的RF來準確且快速地調向。數據采集程序計算應由射頻驅動器(K)產生以偏轉足以補償珠粒位置的酶促驅動移動的光束的新反饋頻率。可對這個輸出頻率的記錄進行后處理以輸出阱位置隨聚合時間的時間演化。
NANO-VALID 藥物驗證工藝與常規方法相比的獨特特點是 NANO-VALIDTM系統使得能夠高分辨率實時跟蹤藥物候選物如何改變或干擾聚合酶沿核酸模板的移動。進一步將這個系統高度整合和自動化，從而使其容易升級用于高通量藥物篩選應用。
本文所述的方法和裝置還提供許多相對于常規藥物篩選和驗證技術的成本相關優點。如圖8至圖10所說明，本發明方法和裝置使得能夠快速篩選，從而使勞動時間減少約115倍。另夕卜，本發明的單分子方法使試劑體積減少約 130倍，且減少的儀器循環時間導致處理時間減少約10到50倍。因此，總之，本發明使得總成本改進約20到100倍。
實施例
使用模板長度的動力學來檢測DNA復制的抑制的方法和裝置
在本實例中，我們說明通過DNA模板長度的單分子測量來檢測DNA復
23制的抑制的方法和裝置。在本實例中，我們設法篩選通過以下兩種機制中的一
種來抑制DNA聚合的藥物干擾聚合酶結合或超低連續性。圖2-A展示預期的正常特征，而2-B展示預期來自有效藥物候選物的結果。用于單分子測量的裝置包含如先前所述的力反饋光學捕獲子系統。用于此機械特征測量的實驗設置在圖5a和5b中展示。
根據標準方法，用抗生蛋白鏈菌素涂覆光學透明多孔微板的內表面。制備長度超過5 kb的生物素標記ssDNA模板的樣品(羅森伯格(Rothenberg)-全文引用)且使其懸浮于緩沖溶液中。也設計可起始聚合的DNA引物。制備包被抗生蛋白鏈菌素的0.5-1微米珠粒(可得自邦斯實驗室(Bang's Laboratories )) 的懸浮液且將其分配到各孔中；隨后，也將ssDNA模板的溶液分配到各孔中。為了發生抗生蛋白鏈菌素-生物素結合，將所述板培養約30分鐘，以致形成 DNA范圍的足夠群體，其使核酸的一端附著于微板，另一端附著于包被抗生蛋白鏈菌素的珠粒。將藥物候選物如下分配到各孔中各孔含有至多一種候選物；將各候選物加入N個孔中以提供冗余度。一組C孔并未添加有任何候選物以致其可用作對照樣品。
啟動光鑷裝置且根據圖形使用者界面進行校準。將微孔板裝入光鑷裝置，以致其底部與光阱的聚焦平面齊平。使用GUI來設定詢問時間且將捕獲力設定為0-35 pN的所需值。也使用GUI來鑒別哪些候選物(如果有)存在于各微孔中。
向GUI提供輸入數據以驅動微孔板，使得光鑷光束詢問第一對照微孔。使用操縱桿和樣品平面的CCD圖像，手動捕獲合適的珠粒。嚙合力反饋系統且隨后立即將DNA引物、dNTP混合物和靶DNA聚合酶的緩沖懸浮液加入這個單微孔中。這同樣可應用于RNA聚合酶和逆轉錄酶。使力反饋系統運行以便在所選時間間隔期間跟蹤阱的位置；將這些結果存儲于存儲器中以致其可通過孔位址和作為對照結果來定址和識別。對于對照孔的其余部分重復這個過程。從GUI可見，運行程序以分析多個對照樣品，以便選取數個為聚合酶靶所共有的顯著特點。首先，對這些對照組應用截止頻率在100-1000 Hz范圍內的不同低通濾波器的選擇，且顯示結果以致使用者可選擇產生最高信號平滑程度、同時維持靶聚合酶的總動力學的完整性的具有截止頻率coc的濾波器。一旦過濾，數值微分方案確定每一點的瞬時速度。接著，對于范圍為整個
采集窗口 (即，t=
)到大致對應于100個堿基對(約二分之一長度的窗口，這取決于聚合酶的速度)的窗口的不同窗口尺寸確定速度的最鄰近平均值。
向GUI提供輸入數據以驅動微孔板，以致光鑷光束詢問第一非對照微孑L。使用操縱桿和樣品平面的CCD圖像，手動捕獲合適的珠粒。嚙合力反饋系統且隨后立即將DNA引物、dNTP混合物和靶DNA聚合酶的緩沖懸浮液加入這個單微孔中。力反饋系統繼續在所選時間間隔期間跟蹤阱的位置；將這些結果存儲于存儲器中以致其可通過孔位址以及存在的藥物候選物來定址和識別。對于對照孔的其余部分重復這個過程。
用具有截止頻率coc的低通濾波器過濾所有獲得的結果。用GUI對結果進行數值微分，且關于與對照組相同的時間尺度來計算最鄰近速度圖。依次考慮各藥物候選物。對于N個樣品中的任一個來說，在任何時間尺度上的實質上非零速度都將指示藥物候選物并不可靠地或有效地干擾DNA復制過程。為此，排除對于N個樣品中的任一個來說，在任何時間尺度上都顯示實質上非零速度(例如，所有對照組的平均速度為1%)的那些候選物。
使用聚合酶沿DNA鏈的動力學來檢測RNA聚合酶耙的提前終止的方法和設備
在本實例中，我們說明通過RNA聚合酶來檢測RNA轉錄的提前終止的方法和裝置。在本實例中，我們篩選誘導RNA聚合在特定位點起始后提前終止的藥物候選物。圖2-A展示預期的正常特征，而2-B展示預期來自有效藥物候選物的結果。用于單分子測量的裝置是包含力反饋光學捕獲子系統和較高功率可操縱光阱的雙光束光4聶裝置。
通過標準方法來制備雙鏈(ds) DNA的樣品以使其包含停止轉錄復合物
(包含生物素標記)，以及位于DNA的下游端的生物素標簽(卡崔諾埃曼(Neuman，K.C.)等，細胞(Cell) , 115:437-447,2003 )。隨后使轉錄因子標簽附著于包被抗生蛋白鏈菌素的1微米直徑電介質珠粒(例如，邦斯實驗室
(Bang's Laboratories))上，且使DNA標簽附著于包被抗生蛋白鏈菌素的0.5 微米直徑電介質珠粒(例如，邦斯實驗室(Bang's Laboratories ))上。這形成在每一端都具有珠粒"柄，，的DNA "啞鈴體(dumbell)"的樣品一個附著于DNA的末端，另一個附著于RNA聚合酶上。將藥物候選物如下分配到光學透明微孔板的孔中各孔含有至多一種候選物；將各候選物加入N個孔中以提供冗余度。一組C孔并未添加有任何候選物以致其可用作對照樣品。
啟動光鑷裝置且根據圖形使用者界面進行校準。將微孔板裝入光鑷裝置中，以致其底部與光阱的焦點平面齊平。使用GUI來設定詢問時間T，且將力反饋光束的捕獲力設定為0-35 pN的所需值。也使用GUI來鑒別哪些候選物 (如果有)存在于各微孔中，以致微孔隨后可通過其位置和含量來定址。
向GUI提供輸入數據以驅動微孔板，以致光鑷光束詢問第一對照微孔。使用操縱桿和樣品平面的CCD圖像，通過捕獲力反饋光阱中的較大珠粒和強次級阱中的較小珠粒來手動捕獲啞鈴體。嚙合力反饋系統且隨后立即將RNA dNTP混合物的緩沖懸浮液加入這個單微孔中。力反饋系統繼續在所選時間間隔期間跟蹤阱的位置；將這些結果存儲于存儲器中，以致其可通過孔位址和作為對照結果來定址和識別。對于對照孔的其余部分重復這個過程。從GUI可見，運行程序來分析多個對照樣品，以便選取數個為聚合酶靶所共有的顯著特點。首先，對這些對照組應用截止頻率在100-1000 Hz范圍內的不同低通濾波器的選擇，且顯示結果以致使用者可選擇產生最高信號平滑程度、同時維持靶聚合酶的總動力學的完整性的具有截止頻率coc的濾波器。
一旦過濾，數值微分方案確定每一點的瞬時速度。接著，對于范圍為整個采集窗口 (即，t-
)到大致對應于100個堿基對(約二分之一長度的窗口，這取決于聚合酶的平均速度)的窗口的不同窗口尺寸確定速度的最鄰近平均值。接著，使用者通過GUI選擇對應于聚合仍應進行的時間最大值(即，超過后聚合應被有效藥物候選物終止的時間)的時間點，To<T。
向GUI提供輸入數據以驅動微孔板，以致光鑷光束詢問第一非對照微孔。使用操縱桿和樣品平面的CCD圖像，手動捕獲合適的珠粒。嚙合力反饋系統且隨后立即將RNA dNTP混合物的緩沖懸浮液加入這個單微孔中。使力反饋系統運行以在所選時間間隔期間跟蹤阱的位置；將這些結果存儲于存儲器中，以致其可通過孔位址以及存在的藥物候選物來定址和識別。對于對照孔的其余部分重復這個過程。
用具有截止頻率coc的低通濾波器過濾所有獲得的結果。用GUI對結果進
26行數值微分，且關于與對照組相同的時間尺度來計算最鄰近速度圖。依次考慮各藥物候選物。如果藥物候選物可靠地以所需方式干擾轉錄，那么所有相關的
N個樣品都應在時間To后顯示實質上非零速度。因此，排除對于To后的任何時間窗口來說N個樣品中的任一個都顯示實質上非零速度(例如，所有對照組的平均速度為1%)的那些候選物。
雖然本發明已參考其特定實施例進行詳細描述，但對于所屬領域的技術人員將顯而易見的是在不脫離本發明的范圍的情況下可進行各種變化，和利用等效物。
本文所論述的公開出版物僅僅在本申請的申請日期之前提供其揭示內容。本文中無任何內容可解釋為承認本發明無權先于根據先前發明之所述公開內容公開。此外，所提供的
公開日期可能不同于實際
公開日期，這可能需要獨立地加以i正實。
本文所引用的所有^Hf出版物都以全文引用的方式并入。
權利要求
1. 一種用于篩選藥物候選物的方法，其中所述方法包含(a)使靶酶與所述靶酶的底物接觸；(b)通過使用單分子檢測裝置進行機械測量來確定在所述靶酶的所述底物存在下所述靶酶的基線機械特征；(c)使所述靶酶和所述靶酶的所述底物與一種或一種以上藥物候選物接觸；(d)通過使用單分子檢測裝置進行機械測量來確定在所述靶酶的所述底物和一種或一種以上藥物候選物存在下所述靶酶的機械特征；以及(e)比較步驟(b)的所述基線機械特征與步驟(d)的所述機械特征；其中步驟(b)的所述基線機械特征和步驟(d)的所述機械特征使用同一單分子檢測裝置和相同機械測量得以確定。
2. 根據權利要求1所述的方法，其中，所述機械測量選自由下列測量所組成的組中對所述耙酶沿所述把酶的所述底物的時間依賴性速度的測量、對所述把酶的所迷底物的長度的時間依賴性變化的測量、對所述靶酶的所述底物的彈性的變化的測量，以及對通過所述靶酶進行底物結合和加工的效率或準確度的測量。
3. 根據權利要求1所述的方法，其中，所述單分子檢測裝置選自由下列裝置所組成的組中利用磁性或光學捕獲的裝置、利用高分辨率熒光成像聯合量子點標記的裝置和利用原子力顯微術的裝置。
4. 根據權利要求1所述的方法，其中，所述靶酶是聚合酶。
5. 根據權利要求4所述的方法，其中，所述聚合酶選自由下列酶所組成的組中DNA聚合酶、RNA聚合酶和逆轉錄酶。
6. 根據權利要求4所述的方法，其中，所述聚合酶是人類聚合酶。
7. 根據權利要求4所述的方法，其中，所述聚合酶是病毒聚合酶。
8. 根據權利要求7所述的方法，其中，所述病毒聚合酶是病毒逆轉錄酶。
9. 根據權利要求8所述的方法，其中，所述病毒逆轉錄酶是HIV-1逆轉錄酶。
10. 根據權利要求4所述的方法，其中，所述聚合酶是細菌聚合酶。
11. 根據權利要求1所述的方法，其中，所述靶酶是聚合酶，所述靶酶的所述底物是多核苷酸，且所述分子測量是對所述聚合酶沿所述多核香酸底物的移動的測量或對聚合期間所述多核苷酸底物的長度的時間依賴性變化的測量。
12. 根據權利要求11所述的方法，其中，所述分子測量使用利用磁性或光學捕獲的單分子檢測裝置來進行。
13. 根據權利要求1所述的方法，其中，所述方法提供準確地表征所檢驗的藥物候選物的抑制和/或干擾機制的詳細酶促動力學數據。
全文摘要
本申請揭示了用于單分子藥物篩選、發現和驗證的方法和裝置。這些方法和裝置允許使用者使用單分子的觀察結果快速檢測藥物候選物是否和如何干擾特定疾病路徑所涉及的靶酶。本文所述的方法和裝置利用單分子操縱和檢測技術(例如，光鑷或磁鑷)來直接檢測靶酶-底物相互作用的特征動力學或“機械特征(mechinal signature)”是否實質上由藥物候選物改變或調節。此外，所述方法和裝置適用于分析機械特征的調節以便鑒別藥物候選物的潛在干擾機制。本發明的一方面中，本文所揭示的方法和裝置涉及監測在抑制或者調節聚合過程的藥物候選物存在下個別聚合酶分子(例如DNA聚合酶、RNA聚合酶和逆轉錄酶)沿多核苷酸底物的實時動力學機械特征。所述藥物候選物的鑒別和分析對于抗病毒、抗癌和抗生素藥物的開發至關重要。
文檔編號G01N33/567GK101479605SQ200780022986
公開日2009年7月8日申請日期2007年4月23日優先權日2006年4月21日
發明者阿妮塔·高爾申請人:納諾拜希姆公司

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