水稻黃綠葉突變基因ygl8及其編碼的蛋白和應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于遺傳學領域，具體涉及一種水稻黃綠葉突變基因YGL8,還涉及該基因 編碼的蛋白和應用。
【背景技術】
[0002] 水稻（OrvzasativaL.)是世界上最重要的糧食作物，在120個國家和地區廣泛 種植，全球一半以上的人口以稻米為主食。我國成功育成雜交水稻，并進行推廣和應用，增 產的糧食為一些國家實現糧食自給創造了條件，對國家乃至世界糧食安全作出了杰出貢 獻。然而由于不育系育性不穩定而造成的雜交種子混雜，嚴重影響雜種純度和雜交水稻的 生產，甚至給農民造成的嚴重損失，制約雜交稻發揮更大作用。在兩系和三系雜交稻育種及 生產實踐中，人們發現不育系不育性表達不穩定現象普遍存在。因此，如何有效提高親本繁 殖制種過程中的除雜效率，快速準確鑒定種子生產過程中因育性波動可能出現的種子純度 問題，已成為雜交水稻研究和應用中的一個重要課題。葉色突變體可作為苗期標記性狀進 行作物雜種一代新品種選育和種子純度鑒定，其優勢是在苗期即可通過觀察標記性狀的存 在或消失與否來識別真假雜種，因此在三系和兩系雜交水稻親本繁殖、雜交制種、雜交種子 純度鑒定等方面得到充分利用。該項技術直觀準確，簡便快速，具有一般的異地種植鑒定和 DNA分子標記鑒定技術無法比擬的優越性。近年來育種家已經選育出多個帶有葉色標記的 不育系，如白化轉綠葉色標記不育系白豐A、淡黃葉不育系標810S、黃葉不育系黃玉A和黃 綠葉不育系黃標A系列。但由于多數苗期標記性狀單系本身性狀不優良、光合效率下降，造 成植株生長發育不正常而減產，使其在育種實踐中的應用受到限制。因而，發現一些穩定遺 傳、葉色變異對其它性狀尤其產量、品質性狀沒有顯著影響的葉色突變非常重要。

【發明內容】

[0003] 有鑒于此，本發明的目的之一在于提供水稻黃綠葉突變基因YGL8,該基因為全生 育期標記性狀，為水稻轉基因研究提供有力的工具，促進雜交稻育種研究；本發明的目的之 二在于提供水稻黃綠葉突變基因YGL8編碼的蛋白質；本發明的目的之三在于提供水稻黃 綠葉突變基因YGL8的應用。
[0004] 為實現上述目的，本發明利用甲基磺酸乙酯（EMS)誘變優良恢復系縉恢10號，獲 得了一個全生育期葉片均表現為黃綠色的突變體（命名為ygl8)，遺傳分析發現該突變性 狀受一對隱性核基因（命名為YGL8)控制。分子標記定位結果顯示，該基因定位于第1染 色體長臂端Indel標記ID-3和SSR標記RM12339之間54kb的區間內。
[0005] 在上述基因定位的基礎上，本發明通過候選基因預測、同源搜索及基因序列差 異比較，初步確定了YGL8為尿苷酸激酶（UMPkinase)基因（L〇C_0s01g73450);隨后，本 發明以水稻黃綠葉突變體ygl8為材料，克隆了該基因的cDNA并進行了測序，具有如SEQ IDNo. 11所示的核苷酸序列，結果顯示，YGL8基因由7個外顯子組成，⑶S編碼框全長為 1056bp，共編碼351個氨基酸，其氨基酸序列如SEQIDNo. 12所示。與縉恢10號野生型基 因相比，YGL8基因在編碼框第671位堿基由C轉換為T，導致第224位的編碼氨基酸由丙氨 酸（Ala)變異為纈氨酸（Val)，該突變位點位于UMP結合位點附近。
[0006] 然后，本發明構建了互補載體并轉化水稻黃綠葉突變體ygl8,性狀分析發現轉基 因陽性植株葉片恢復正常綠色，葉綠素含量分析顯示轉基因陽性植株葉片葉綠素含量恢復 正常水平；構建RNAi載體并轉化縉恢10號，經鑒定轉基因陽性植株葉片變為黃綠色、葉綠 素含量極顯著降低，轉基因陽性植株中YGL8突變基因表達量也明顯下調。因此，確定突變 體黃綠葉性狀是由YGL8基因突變引起的。
[0007] 本發明的有益效果在于：本發明提供了水稻黃綠葉突變基因YGL8,該基因為苗期 標記性狀，對千粒重等主要農藝性狀無顯著影響，為水稻遺傳育種研究提供了有力的工具， 為選育純種不育系奠定基礎。
【附圖說明】
[0008] 為了使本發明的目的、技術方案和有益效果更加清楚，本發明提供如下附圖：
[0009] 圖1為野生型縉恢10號和水稻黃綠葉突變體ygl8形態學觀察結果（A:苗期野生 型縉恢10號與ygl8突變體植株和葉片；B:分蘗期野生型縉恢10號與ygl8突變體植株和 葉片；C:成熟期野生型縉恢10號與ygl8突變體植株）
[0010] 圖2為野生型縉恢10號和水稻黃綠葉突變體ygl8的細胞超微結構分析（A-B:野 生型縉恢10號的細胞超微結構分析；C-D:ygl8突變體的細胞超微結構分析）。
[0011] 圖3為野生型縉恢10號與ygl8突變體主要農藝性狀分析（A:株高；B:單株有效 穗數；C:每穗粒數；D:每穗實粒數；E:結實率；F:千粒重）。
[0012] 圖4為水稻黃綠葉突變基因YGL8基因的遺傳和物理圖譜，其中A為YGL8的初步 定位，在第1染色體長臂SSR標記RM6141和RM6321之間；B為YGL8基因的精細定位，在 InDel標記ID-3和SSR標記RM12339之間54kb的范圍內；C為突變基因所在的BAC克隆 AP0023263;D為突變體ygl8的候選基因0s01g73450的結構及突變位置。
[0013] 圖5為ygl8突變體的互補表型及RNAi鑒定分析，其中A為野生型WT和互補轉基 因陽性植株（ygl8-C) ;B為野生型WT和互補轉基因陽性植株（ygl8-C)的總葉綠素含量分 析；C為野生型WT和RNAi轉基因陽性植株；D為野生型WT和RNAi轉基因陽性植株的總葉 綠素含量分析；F為YGL8基因在野生型WT和RNAi轉基因陽性植株中的表達分析。
[0014] 圖6為YGL8基因與野生型基因的序列比對圖，YGL8基因cDNA在第671位發生了 c-τ的轉變。
[0015] 圖7為YGL8基因編碼蛋白與野生型基因編碼蛋白的序列比對圖，YGL8基因編碼 蛋白在第224位發生了A-V的變異。
【具體實施方式】
[0016] 下面將結合附圖，對本發明的優選實施例進行詳細的描述。實施例中未注明具體 條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如分子克隆實驗指南（第三版，J.薩姆布魯克等 著）中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0017] 本發明實施例中使用的材料：野生型水稻材料縉恢10號（WT)和水稻黃綠葉突變 體ygl8均由西南大學水稻研究所培育；M-MLV逆轉錄酶、高保真DNA聚合酶PFU、TaqDNA 聚合酶、T4DNA連接酶、限制性內切酶、pMD19-T載體、Trizol試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、 質粒提取試劑盒、λ-HindIIIDNAMarker及DL5000DNAMarker購自TaKaRa公司；DNA MarkerIII購自天根生化科技（北京）有限公司；氨節青霉素（Ampicillin，Amp)和卡拉 霉素（Kanamycin，Kan)為Sigma公司產品；引物合成和DNA測序由上海英俊生物技術有 限公司完成；其它化學試劑購自北京鼎國生物技術有限責任公司；大腸桿菌DH5a、農桿菌 LBA4404由本實驗室保存。
[0018] 實施例1、水稻黃綠葉突變體ygl8的獲得和形態學觀察
[0019] 在西南大學水稻研究所水稻EMS突變體庫中發現了一個全生育期表現為黃綠葉 突變體，根據表型特征命名為ygl8(圖1)。該性狀經過多代觀察，表現穩定遺傳，透射電鏡 觀察苗期野生型縉恢10號和ygl8突變體葉片細胞超微結構，突變體細胞結構完整，葉綠體 基粒片層結構受到破壞（圖2);主要農藝性狀如穗長和每穗粒數顯著減少，然而千粒重沒 有顯著差異（圖3)。
[0020] 實施例2、突變ygl8基因遺傳分析與定位
[0021] 以表型正常的不育系西農lA(XinonglA)與ygl8突變體雜交，所有匕植株均表型 正常。F2群體出現明顯的雙親性狀分離現象，在9473株群體中正常單株7095株、黃綠葉突 變單株2378株，經卡平方測驗，符合3:1分離比，表明該突變性狀受一對隱性基因控制。
[0022] 初步定位：選取均勻分布于水稻12條染色體上的400對SSR標記擴增親本和基 因池DNA，結果發現位于第1染色體的標記RM6141、RM12233和RM6321可能與YGL8連鎖。 進一步用連鎖標記RM614URM12233和RM6321分析F2代群體452個隱性突變單株，初步將 該基因定位于第1染色體長臂端與標記RM6141與RM6321之間，遺傳距離分別為0. 43cM和 1. 7cM(圖 4 中A)。
[0023] 精細定位：根據已公布的秈稻品種93-11序列，在標記RM6141與RM6321之間進一 步篩選和開發了 14對In/Del標記和40對SSR標記，其中ID-3,ID-8