一種重組靶向蛋白及其制備方法與應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術領域，具體設及一種重組祀向蛋白及其制備方法與應用。
【背景技術】
[0002] 惡性腫瘤可分為癌和肉瘤，類型超過100種，幾乎可W發生在人體任何部位，且預 后差、極易復發，死亡率和患病率逐年上升，已成為人類疾病死亡的最主要病因。目前，針對 惡性腫瘤患者的臨床治療方法W手術治療結合放療、化療為主，而晚期惡性腫瘤確診時手 術時機往往喪失，放療、化療又不甚敏感。并且放療、化療不僅對腫瘤細胞具有殺傷作用，對 正常細胞也會產生不可逆的損傷。殘酷的現實直接導致全世界惡性腫瘤患者5年平均生存 率僅為30%~40%，發達國家W不計成本的方式治療也只能將個別惡性腫瘤類型患者的5 年平均生存率提高至50%~60%。因此，探索和開發高效、安全、廉價的抗腫瘤藥物依然是 當前全球腫瘤研究和治療機構的迫切任務和重要努力方向。
[0003] 由于具有特異、高效和免疫重建等功能，基于腫瘤特異性抗體和特異性抑癌基因 的腫瘤免疫導向治療漸受關注，將其作為惡性腫瘤藥物治療和手術輔助治療的手段正成為 惡性腫瘤新型治療策略而倍受推崇。抗體介導的腫瘤祀向治療是腫瘤生物治療領域的主要 研究內容之一。但該領域的研究仍有一些問題有待于解決。首先，作為導向工具的腫瘤特 異性抗體存在分子量大、穿透力弱、穩定性差等不足，而且大多為鼠源性抗體，應用于人體 易產生人抗小鼠抗體，既影響治療效果，又可能誘發過敏反應。其次，多數導向藥物只考慮 了對腫瘤細胞的特異性識別并一味追求殺傷效果，而忽略了腫瘤特異性殺傷的重要性，從 而致使導向藥物存在損傷正常組織或細胞的潛在隱患。運些在很大程度上限制了腫瘤免疫 導向治療制劑的研究步伐。

【發明內容】

[0004] 為了解決現有技術存在的問題，本發明提供一種重組祀向蛋白及其制備方法與應 用。
[0005] 本發明為解決技術問題所采用的技術方案如下：
[0006] 本發明的一種重組祀向蛋白，包括修飾的CEAscFvT84. 66片段和Apoptin蛋白 片段。
[0007] 優選的，本發明的一種重組祀向蛋白具有如SEQIDNO: 1所示的氨基酸序列。
[0008] 進一步的，所述修飾的CEAscFvT84.66片段為CEAscFv骨架區中空間距離最近 的化第106位的精氨酸和VH第43位的谷氨酷胺分別替換為半脫氨酸。
[0009] 本發明還提供了編碼所述重組祀向蛋白的DNA分子。
[0010] 本發明還提供了編碼SEQIDNO: 1所示氨基酸序列的DNA分子，其具有如SEQID NO:2所示的核巧酸序列。
[0011] 本發明還提供了上述重組祀向蛋白的制備方法，包括：
[0012] 步驟1 :獲取編碼Apoptin蛋白片段的DNA分子和編碼修飾的CEAscFvT84. 66片 段的DM分子；
[0013] 步驟2:將步驟1所獲得的編碼Apoptin蛋白片段的DM分子與編碼修飾的CEA scFvT84. 66片段的DM分子連接，與表達載體融合后，轉化宿主細胞；
[0014] 步驟3:誘導含重組表達載體的宿主細胞表達融合蛋白，分離后純化復性。
[0015] 進一步的，步驟1中，所述獲取編碼Apoptin蛋白片段的DNA分子具體為：W pVAXl-Apoptin為模板，用具有SEQIDN0:3所示的核巧酸序列的上游引物和具有SEQID N0:4所示的核巧酸序列的下游引物擴增編碼Apoptin蛋白片段的DM分子。
[0016] 進一步的，步驟1中，所述獲取編碼修飾的CEA scFv T84. 66片段的DNA分子為人 工合成包含修飾的CEA scFv T84. 66片段的DNA分子的質粒，酶切后獲得編碼修飾的CEA scFvT84. 66片段的DNA分子。
[0017] 進一步的，步驟2中，所述表達載體為祀T28a，所述宿主細胞為大腸桿菌化21。 [001引本發明還提供了上述重組祀向蛋白在制備抗腫瘤的藥物中的應用。
[0019] 本發明的有益效果是：
[0020] 1、本發明所述重組祀向蛋白包括修飾的CEAscFvT84. 66片段和Apoptin蛋白片 段，W修飾的CEAscFvT84.66片段作為腫瘤特異性識別單元，WApoptin作為腫瘤特異性 殺傷單元，形成高效、安全和廉價的特異性抗腫瘤重組祀向蛋白。
[0021] 2、本發明結合生物信息學方法與已知癌胚抗原特異性單鏈抗體核巧酸序列，經分 子設計和密碼子優化后，通過化學方法合成CEA二硫鍵穩定性單鏈抗體基因片段，將腫瘤 特異性調亡誘導基因Apoptin通過一段柔性連接膚連接在單鏈抗體基因CEA scdsFv片段 下游，并克隆入大腸桿菌表達載體，轉化宿主細胞，經IPTG誘導后表達獲得本發明所述特 異性抗腫瘤重組祀向蛋白。SDS-PAGE和Western Blot分析表明，本發明所述重組祀向蛋白 得到良好表達，經條件優化后表達量最高可達44.Img/L。
[0022] 3、本發明所述重組祀向蛋白經分步洗涂法初步純化和谷脫甘膚復性后，利用人肝 癌細胞對所制備重組祀向蛋白進行親和力測定、細胞結合活性測定和特異性細胞殺傷活性 分析。結果顯示，所制備的重組祀向蛋白能夠有效的與上述腫瘤細胞結合，并對其具有明顯 的殺傷活性。表明本發明所述重組祀向蛋白可用于制備抗腫瘤的藥物。
【附圖說明】
[0023] 圖1為實施例1中CEAscdsFv的分子模擬結果。
[0024] 圖2為實施例1中重組祀向蛋白CAtinWesternBlot檢測及純化分析的結果圖；其 中圖A為重組祀向蛋白CAtin和CEA dsFv純化前的Western Blot檢測結果圖，圖B為重 組祀向蛋白CAtin和CEA dsFv純化前的SDS-PAGE結果圖，圖C為重組祀向蛋白CAtin和 CEA dsFv純化后的Western Blot檢測結果圖，圖D為重組祀向蛋白CAtin和CEA dsFv純 化后的SDS-PAGE結果圖；各圖中：1為原核表達的CAtin ;2為原核表達的CEA dsFv ;3為蛋 白marker ;4為純化的的CAtin ;5為純化的CEA dsFv。
[00對圖3為實施例2中重組祀向蛋白CAtin結合活性檢測結果圖；其中圖A為重組祀 向蛋白CAtin,圖B為陰性細胞。
[0026]圖4為實施例4中重組祀向蛋白CAtin殺傷活性檢測結果圖。
【具體實施方式】
[0027] W下結合附圖和實施例對本發明作進一步詳細說明。
[0028] CEA是一種分子量約180-200kDa的高度糖基化癌胚蛋白，普遍存在于結腸癌、乳 腺癌、肺癌等多種腫瘤細胞表面。人源化CEA scFv T84. 66具有良好的結合活性，并具有穿 透力強、廓清快、異源性低等優點，但有時scFv比其親本抗體的親和力明顯降低，并常常顯 示聚集傾向，尤其在37°C時scFv的穩定性較差。
[0029] 而Apoptin可特異性地誘導腫瘤細胞發生調亡，而對正常細胞無作用。在正常細 胞內Apoptin主要定位在細胞漿，而在腫瘤細胞內Apoptin主要集中于細胞核，并且其第 108位蘇氨酸在腫瘤細胞內特異性的憐酸化。此外，部分應用于腫瘤治療的化療藥物和放射 性同位素是通過野生型P53誘導腫瘤細胞調亡而發揮作用的，但大多數腫瘤在其發展中往 往發生P53突變，從而影響放化療效果，而ApoptinW非p53依賴性途徑誘導細胞調亡，也 不受bd-2的抑制，且bcl-2還能增強其調亡誘導作用。
[0030] 本發明所說的重組祀向蛋白包括修飾的CEAscFvT84. 66片段和Apoptin蛋白片 段，W修飾的CEAscFvT84. 66片段作為腫瘤特異性識別單元，WApoptin蛋白片段作為腫 瘤特異性殺傷單元，形成特異性抗腫瘤重組祀向蛋白，命名為CAtin。
[0031] 其中，所說的修飾的CEAscFvT84. 66片段為CEAscFv骨架區中空間距離最近的 化第106位的精氨酸和VH第43位的谷氨酷胺分別替換為半脫氨酸。本發明通過分子模 擬和氨基酸序列分析，在不改變CEAscFv互補決定區的條件下，將CEAscFv骨架區中空間 距離最近的化第106位的精氨酸和VH第43位的谷氨酷胺分別替換為半脫氨酸，在VH和 化之間導入鏈間二硫鍵將scFv改構為scdsFv，形成CEA二硫鍵穩定性單鏈抗體基因片段 即CEAscdsFv，顯著提高其穩定性。 陽03引本實施方式中，所說的重組祀向蛋白CAtin其具有如SEQ ID NO: 1所示的氨基酸 序列。本發明也提供了編碼所述重組祀向蛋白CAtin的DNA分子。由于密碼子的簡并性， 可W存在很多種能夠編碼本發明所說的特定多膚的核巧酸序列。本發明提供了編碼SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列的DM分子，其具有如SEQ ID NO: 2所示的核巧酸序列。
[0033] 為了制備本發明所述重組祀向蛋白CAtin,本發明也提供了所述重組祀向蛋白 CAtin的制備方法，包括：
[0034] 步驟1:獲取編碼Apoptin蛋白片段的DNA分子：W pVAXl-Apoptin為模板，用具 有SEQ ID NO: 3所示的核巧酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO: 4所示的核巧酸序列的下 游引物擴增編碼Apoptin蛋白片段的DNA分子；
[0035] 獲取編碼修飾的CEA scFvT84. 66片段的DNA分子：人工合成包含修飾的CEA scFv T84. 66片段的DM分子的質粒，酶切后獲得編碼修飾的CEA scFv T84. 66片段的DM分子。
[0036] 目前利用基因工程技術獲得目的DM分子的方法有很多種，包括利用限制性內切 酶酶切具有編碼目的DNA分子的載體或W具有編碼所述目的DNA分子的cDNA為模板PCR 擴增。
[0037] 步驟2:將步驟1所獲得的編碼Apoptin蛋白片段的DNA分子與編碼修飾的CEA scFv T84. 66片段的DNA分子連接，連接后，通過凝膠電泳回收和雙酶切插入表達載體，與 表達載體融合后，構建重組表達載體，并轉化宿主細胞。
[0038] 本領域技術人員可W理解本發明中所選用的表達載體可W為pGEX系列、pET系 列、PQE系列和pMAL系列等表達載體。在一些優選實施方案中，本發明所述表達載體為祀Τ系列中的祀T28a。
[0039] 本發明的轉化宿主細胞為大腸桿菌表達菌株，包括Rosetta系列和化21系列菌 株。優選的，宿主細胞為化21菌株。
[0040] 步驟3 :IPTG誘導培養含重組表達載體的宿主細胞，收集菌體超聲波破碎，取上清 經純化復性后，獲取重組祀向蛋白CAtin。SDS-PAGE和WesternBlot分析表明，本發明所 述重組祀向蛋白得到良好表達，表達量最高可達44.Img/L。
[0041] 純化：分離后采用分步洗涂法純化目的重組祀向蛋白：采用8M至0M脈素對目的 重組祀向蛋白進行梯度洗脫。
[0042] 復性：采用谷脫甘膚對目的重組祀向蛋白進行復性：目的重組祀向蛋白加入氧化 型谷脫甘膚和還原性谷脫甘膚4°C放置8~1化后，用PBS透析。氧化型谷脫甘膚的終濃度 為ImM，還原性谷脫甘膚的終濃度為2mM。
[0043] 本發明結合生物信息學方法與已知癌