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技術領域

已經使用細(xi)胞培養程序來生(sheng)產(chan)重(zhong)組(zu)蛋(dan)白，按分(fen)批(pi)或(huo)者按照(zhao)連續的(灌注(zhu))模(mo)式來操作所述細(xi)胞培養程序。因(yin)為相(xiang)較于分(fen)批(pi)模(mo)式的操作而言，灌注(zhu)模(mo)式能夠維(wei)持更高的細(xi)胞密度，因(yin)此(ci)灌注(zhu)模(mo)式產(chan)生(sheng)更高的體(ti)積產(chan)量(liang)(每體(ti)積每天所產(chan)生(sheng)的產(chan)物量(liang))。

背景技術：

在工(gong)業中(zhong)(zhong)，灌注操作已(yi)被用來生(sheng)(sheng)產(chan)(chan)重(zhong)組生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)制品，比如單克隆抗體、血液因子包(bao)括凝血蛋白(bai)、酶和其(qi)他(ta)治療性蛋白(bai)。對(dui)于使用灌注系統的(de)(de)主要(yao)驅動在于在生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)反應器中(zhong)(zhong)保留(liu)細(xi)胞(bao)，從而顯著提高(gao)了每(mei)體積生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)反應器所生(sheng)(sheng)產(chan)(chan)的(de)(de)產(chan)(chan)物(wu)(wu)量(liang)。市場(chang)上有多種(zhong)類型的(de)(de)細(xi)胞(bao)截(jie)(jie)留(liu)裝置，已(yi)成功實現了實驗室和商業規(gui)模的(de)(de)生(sheng)(sheng)產(chan)(chan)。據我們所知，盡管(guan)在文(wen)獻中(zhong)(zhong)已(yi)證實了細(xi)胞(bao)密度的(de)(de)增(zeng)加，卻未曾報道過由于采用了外(wai)部細(xi)胞(bao)截(jie)(jie)留(liu)膜的(de)(de)灌注系統對(dui)細(xi)胞(bao)生(sheng)(sheng)產(chan)(chan)率(lv)的(de)(de)提高(gao)。

這(zhe)方(fang)面值(zhi)得注意的(de)兩篇(pian)文獻是：1)S.S.Ozturk和D.S.Kompala,Optimization of High cell Density Perfusion Bioreactors,in Cell Culture Technology for Pharmaceutical and Cell-Based Therapies,Sadettin S.Ozturk和Wei-Shou Hu主(zhu)編,CRC出(chu)版(ban)社，2005,387-416頁；以及(ji)2)W.M.Woodside、B.D.Bowen和J.M.Piret,Mammalian Cell Retention Devices for Stirred Perfusion Bioreactors,Cytotechnology,1998,November；28(1-3):163-175。

上述第一個文獻，Ozturk等人2005討論了對比恒化(hua)器生物(wu)反(fan)(fan)(fan)應(ying)器，高細(xi)(xi)胞(bao)密度灌注生物(wu)反(fan)(fan)(fan)應(ying)器的好(hao)處，以及(ji)操(cao)作這(zhe)種生物(wu)反(fan)(fan)(fan)應(ying)器的方(fang)(fang)法(fa)(fa)。灌注系統涉及(ji)養(yang)分(fen)的持(chi)續流(liu)(liu)入以及(ji)舊(jiu)介質的流(liu)(liu)出，而細(xi)(xi)胞(bao)完全或者部分(fen)保留(liu)(liu)在生物(wu)反(fan)(fan)(fan)應(ying)器中(zhong)(zhong)。灌注生物(wu)反(fan)(fan)(fan)應(ying)器的主要優點之(zhi)一是(shi)高的蛋白生產率。有許多灌注生物(wu)反(fan)(fan)(fan)應(ying)器的內部和外部的細(xi)(xi)胞(bao)截留(liu)(liu)的方(fang)(fang)法(fa)(fa)。用(yong)(yong)于(yu)(yu)(yu)異源培(pei)(pei)養(yang)的這(zhe)樣(yang)的系統，詳見于(yu)(yu)(yu)這(zhe)篇文獻中(zhong)(zhong)，并且包括固(gu)(gu)定(ding)(固(gu)(gu)定(ding)化(hua)的)床、陶瓷基(ji)(ji)體(matrix)固(gu)(gu)定(ding)、中(zhong)(zhong)空纖維反(fan)(fan)(fan)應(ying)器、微包囊和大(da)孔基(ji)(ji)體流(liu)(liu)化(hua)系統。用(yong)(yong)于(yu)(yu)(yu)均(jun)質培(pei)(pei)養(yang)的細(xi)(xi)胞(bao)截留(liu)(liu)系統常(chang)用(yong)(yong)于(yu)(yu)(yu)工業中(zhong)(zhong)的哺(bu)乳動物(wu)細(xi)(xi)胞(bao)培(pei)(pei)養(yang)，是(shi)因(yin)為由(you)于(yu)(yu)(yu)所用(yong)(yong)懸浮培(pei)(pei)養(yang)中(zhong)(zhong)可(ke)見的一致性環境(jing)，而相(xiang)對容易規(gui)模化(hua)、監(jian)測(ce)和控制。

對用于哺乳動物細(xi)(xi)胞(bao)培養的一些細(xi)(xi)胞(bao)截(jie)留(liu)裝置進行(xing)了討論，包(bao)括(kuo)旋轉過(guo)濾器(qi)(qi)(在生(sheng)物反應器(qi)(qi)內部)和外(wai)部過(guo)濾，比如交(jiao)替(ti)切向流、細(xi)(xi)胞(bao)沉降(包(bao)括(kuo)垂直沉降和傾(qing)斜沉降)、離(li)(li)心、超聲(sheng)波(bo)分離(li)(li)和水力(li)旋流器(qi)(qi)(hydro cyclone)。

平板和中空纖維筒(cartridge)已用(yong)于外部(bu)過濾(lv)。裝置(zhi)的(de)堵塞(sai)可(ke)成為問題(ti)，但是當(dang)堵塞(sai)使流體降低至可(ke)接(jie)受的(de)限度(du)以下時，可(ke)以更換外部(bu)過濾(lv)器，一般在每5至7天之間。

上述第二篇文(wen)獻，Woodside等人(ren)1998，Cytology也(ye)討論了用于攪(jiao)拌型灌(guan)(guan)注(zhu)生物(wu)反應器的(de)(de)哺(bu)乳(ru)動物(wu)細胞(bao)截留裝(zhuang)置(zhi)(zhi)。Woodside指出灌(guan)(guan)注(zhu)反應器設計和操作的(de)(de)顯著(zhu)問題在于細胞(bao)截留裝(zhuang)置(zhi)(zhi)的(de)(de)可靠(kao)性(xing)，因為細胞(bao)培養(yang)系統中(zhong)的(de)(de)變化(hua)會(hui)導致大(da)的(de)(de)治療性(xing)蛋(dan)白中(zhong)不(bu)一致的(de)(de)翻譯后修飾(shi)，這使得有必(bi)要證明工藝性(xing)能和產品(pin)質量的(de)(de)一致性(xing)，以獲得蛋(dan)白上市的(de)(de)監管部門批(pi)準。

中(zhong)(zhong)空纖維和平板(ban)筒(tong)是錯流(liu)(liu)(cross-flow)過濾器類型。在使用中(zhong)(zhong)，懸浮液從(cong)生物反應(ying)(ying)器泵(beng)至(zhi)外部筒(tong)，并且在流(liu)(liu)經(jing)膜時進(jin)行濃縮(suo)。濃縮(suo)的懸浮液流(liu)(liu)循環至(zhi)反應(ying)(ying)器，而無細胞的滲(shen)透液形成(cheng)排放(effluent)流(liu)(liu)(參見Woodside，164-166頁)。

除了上(shang)述那些(xie)文獻被認為和本方法相關(guan)以外，本發(fa)明人還注意到其它的三篇(pian)文獻。1)US2009/0263866，受(shou)讓(rang)(rang)予Novo Nordisk,Inc.的US專利(li)申請，2)WO2011/012727，受(shou)讓(rang)(rang)予Baxter Healthcare SA和Baxter International Inc.的國(guo)際申請，以及3)瑞典FSACT 2001上(shang)WAVE BioTech的陳(chen)述。

USSN'866針對哺乳動物細胞(bao)中重組(zu)FVII的工業規模無血清(qing)生產。該申(shen)(shen)請概述了所用的細胞(bao)培(pei)養的各種方(fang)法，包括分(fen)批、補料分(fen)批和(he)灌注(zhu)。一些細胞(bao)截(jie)留裝(zhuang)置(zhi)(zhi)建議用在培(pei)養容器(qi)中，包括外部(bu)沉頭(settling head)、內部(bu)沉頭、連續(xu)離心(xin)機、內部(bu)或者(zhe)外部(bu)旋轉過濾器(qi)、外部(bu)過濾器(qi)或者(zhe)中空纖維筒、超聲波細胞(bao)分(fen)離裝(zhuang)置(zhi)(zhi)和(he)一段培(pei)養容器(qi)內的管(7頁，0106-0113)。所用細胞(bao)系是(shi)(shi)CHO。該申(shen)(shen)請主要關(guan)注(zhu)的是(shi)(shi)將(jiang)微載體用作細胞(bao)截(jie)留系統。

WO'725針對在(zai)連(lian)續細(xi)胞培(pei)(pei)養中生產感興趣的(de)多肽或者病毒的(de)方法。該(gai)申(shen)請中描述了“恒化器樣”連(lian)續細(xi)胞培(pei)(pei)養系統，其結合了灌注開放系統和(he)恒化器開放系統的(de)優勢。這種混合系統用于(yu)培(pei)(pei)養哺乳動物細(xi)胞。提到的(de)細(xi)胞截(jie)留系統是大孔微(wei)載體，例如纖維素基顆粒。

感(gan)興趣(qu)的具體多肽是解聚素樣的以(yi)及金屬肽酶，和1型血(xue)小板(ban)反應蛋白基序13(ADAMTS 13)蛋白。

WAVE Biotech的(de)(de)陳述(shu)公(gong)開了一次性生物反應(ying)器(qi)中(zhong)的(de)(de)灌(guan)(guan)注細胞(bao)培養，并(bing)尤其涉及“新概念-浮濾器(qi)(floating filter)”。這種灌(guan)(guan)注浮濾器(qi)隨著內部的(de)(de)波動而移動。

在(zai)所有這些文獻中，主要的(de)焦點在(zai)于使(shi)用(yong)灌注(zhu)來提(ti)高(gao)細(xi)(xi)胞密度，因(yin)此達到更高(gao)體積(ji)生(sheng)產率(lv)。還討(tao)論了灌注(zhu)的(de)優(you)勢是為(wei)了更好的(de)產物(wu)質量和一致(zhi)性(xing)。利用(yong)本發明來提(ti)高(gao)細(xi)(xi)胞生(sheng)產率(lv)，這通過采用(yong)并操作聯合了灌注(zhu)細(xi)(xi)胞培養系統的(de)基于膜的(de)外部細(xi)(xi)胞截(jie)留系統而(er)實現。

技術實現要素：

本文提供一(yi)(yi)種提高哺乳動(dong)物細(xi)胞的(de)細(xi)胞表達(da)的(de)方法，其包括使用和(he)灌注生物反應(ying)器聯(lian)合的(de)基(ji)于(yu)膜的(de)外部(bu)細(xi)胞截留系(xi)統。優選(xuan)(xuan)的(de)哺乳動(dong)物細(xi)胞是CHO、BHK以(yi)及人(ren)細(xi)胞。重(zhong)(zhong)(zhong)組(zu)蛋白(bai)(bai)是利用基(ji)于(yu)膜的(de)細(xi)胞截留系(xi)統來(lai)(lai)進行表達(da)的(de)尤其有利的(de)候選(xuan)(xuan)者。這種系(xi)統可用于(yu)灌注細(xi)胞培養來(lai)(lai)生產(chan)凝血蛋白(bai)(bai)，所(suo)述(shu)凝血蛋白(bai)(bai)選(xuan)(xuan)自：重(zhong)(zhong)(zhong)組(zu)因(yin)(yin)(yin)子(zi)IX(rFIX)、重(zhong)(zhong)(zhong)組(zu)因(yin)(yin)(yin)子(zi)VIII(rFVIII)、B結構(gou)域缺失的(de)重(zhong)(zhong)(zhong)組(zu)VIII(BDD rFVIII)、重(zhong)(zhong)(zhong)組(zu)因(yin)(yin)(yin)子(zi)FVII以(yi)及重(zhong)(zhong)(zhong)組(zu)因(yin)(yin)(yin)子(zi)VIIa(rFVII/rFVIIa)。通過應(ying)用一(yi)(yi)次(ci)性灌注系(xi)統來(lai)(lai)優化方法，其中所(suo)述(shu)一(yi)(yi)次(ci)性灌注系(xi)統包含一(yi)(yi)次(ci)性生物反應(ying)器以(yi)及一(yi)(yi)次(ci)性基(ji)于(yu)膜的(de)外部(bu)細(xi)胞截留系(xi)統。優選(xuan)(xuan)的(de)基(ji)于(yu)膜的(de)細(xi)胞截留系(xi)統由中空(kong)纖維(wei)組(zu)成。

附圖說明

圖(tu)1在x軸(zhou)(zhou)(zhou)上(shang)顯示天，以及在y軸(zhou)(zhou)(zhou)上(shang)顯示產(chan)物(wu)BDD rFVIII的(de)相對(歸(gui)一化(hua)的(de))滴度。圖(tu)2在x軸(zhou)(zhou)(zhou)上(shang)顯示天，以及在y軸(zhou)(zhou)(zhou)上(shang)顯示(歸(gui)一化(hua)的(de))特定(ding)的(de)生產(chan)率。

具體實施方式

膜系(xi)(xi)統獲自Refine Technologies(Pine Brook,NJ)。各個圖中(zhong)的(de)(de)(de)(de)實心方塊顯示(shi)常規的(de)(de)(de)(de)、非-基于膜的(de)(de)(de)(de)細(xi)胞(bao)截留(liu)系(xi)(xi)統(獲自Applikon(福(fu)斯特(te)市，CA)的(de)(de)(de)(de)BioSep)的(de)(de)(de)(de)結果(guo)。各個圖中(zhong)的(de)(de)(de)(de)空心圈(quan)顯示(shi)獲自Refine Technologies(Pine Brook,NJ)的(de)(de)(de)(de)基于膜的(de)(de)(de)(de)細(xi)胞(bao)截留(liu)系(xi)(xi)統的(de)(de)(de)(de)結果(guo)。對(dui)于CHO細(xi)胞(bao)系(xi)(xi)，在(zai)相同條件下運行生(sheng)物反應器，CHO細(xi)胞(bao)系(xi)(xi)能夠(gou)產生(sheng)感興趣的(de)(de)(de)(de)重組蛋白，B結構域缺(que)失的(de)(de)(de)(de)rFVIII。

當使用基于(yu)膜(mo)(mo)的(de)截(jie)留(liu)系(xi)統(tong)，并(bing)且和(he)常規(gui)的(de)、非-基于(yu)膜(mo)(mo)的(de)細胞(bao)截(jie)留(liu)系(xi)統(tong)比(bi)較，于(yu)2012年獲得本數(shu)據(ju)。圖顯(xian)(xian)示基于(yu)膜(mo)(mo)的(de)截(jie)留(liu)系(xi)統(tong)中細胞(bao)的(de)滴度和(he)特定生產(chan)率(lv)明(ming)顯(xian)(xian)加(jia)倍。使用相(xiang)同的(de)細胞(bao)、介(jie)質運行這些生物反應器(qi)，并(bing)且使用相(xiang)同的(de)pH、溫度等進行操作。

細(xi)(xi)胞(bao)生(sheng)產(chan)率(每(mei)個細(xi)(xi)胞(bao)每(mei)天產(chan)生(sheng)的(de)產(chan)物(wu)量)是細(xi)(xi)胞(bao)的(de)固有性(xing)質，預期不隨著操作模式而變化(hua)。在此(ci)處(chu)，我們(men)提出了一種灌注(zhu)(zhu)細(xi)(xi)胞(bao)培養系統(tong)，通(tong)過控制(zhi)生(sheng)物(wu)反(fan)應器(qi)中的(de)細(xi)(xi)胞(bao)環境和(he)細(xi)(xi)胞(bao)生(sheng)理狀態，其能夠真正(zheng)地(di)直(zhi)接(jie)影響細(xi)(xi)胞(bao)的(de)蛋白(bai)表(biao)達(da)。通(tong)過利用(yong)外部細(xi)(xi)胞(bao)截(jie)(jie)留(liu)(liu)膜和(he)灌注(zhu)(zhu)系統(tong)的(de)聯合，本(ben)(ben)發(fa)明提供了改善的(de)細(xi)(xi)胞(bao)生(sheng)產(chan)率，尤其在哺乳動(dong)物(wu)細(xi)(xi)胞(bao)中，所述外部細(xi)(xi)胞(bao)截(jie)(jie)留(liu)(liu)膜不僅截(jie)(jie)留(liu)(liu)細(xi)(xi)胞(bao)，還(huan)有培養物(wu)中源自細(xi)(xi)胞(bao)的(de)因(yin)子(zi)。本(ben)(ben)發(fa)明適用(yong)于(yu)很多哺乳動(dong)物(wu)細(xi)(xi)胞(bao)培養，比(bi)如CHO、BHK以(yi)及人細(xi)(xi)胞(bao)系，尤其是CHO，還(huan)適用(yong)于(yu)表(biao)達(da)多種重(zhong)組(zu)(zu)蛋白(bai)，例如抗體和(he)凝(ning)血蛋白(bai)，比(bi)如重(zhong)組(zu)(zu)因(yin)子(zi)IX(rFIX)、重(zhong)組(zu)(zu)因(yin)子(zi)VIII(rFVIII)、B結(jie)構域缺失的(de)重(zhong)組(zu)(zu)FVIII(BDD rFVIII)、重(zhong)組(zu)(zu)因(yin)子(zi)VII以(yi)及重(zhong)組(zu)(zu)因(yin)子(zi)VIIa(rFVII/rFVIIa)。細(xi)(xi)胞(bao)截(jie)(jie)留(liu)(liu)膜可以(yi)是平的(de)膜，或(huo)者(zhe)，優(you)選(xuan)中空纖維(wei)膜。

在(zai)和合作者討(tao)論的(de)(de)(de)過程中，在(zai)2011年提(ti)出(chu)了基于(yu)(yu)膜的(de)(de)(de)細胞(bao)(bao)截(jie)(jie)留系統用于(yu)(yu)重組蛋(dan)白(bai)細胞(bao)(bao)培養的(de)(de)(de)用途。一(yi)些專家不屑于(yu)(yu)這一(yi)想法(fa)，但是對比另(ling)一(yi)種(非-膜)細胞(bao)(bao)截(jie)(jie)留系統進行了測試(shi)，證實基于(yu)(yu)膜的(de)(de)(de)細胞(bao)(bao)截(jie)(jie)留系統提(ti)供了至少50％至高達100％(兩倍)的(de)(de)(de)生(sheng)產率顯著改善。

在(zai)優(you)(you)選(xuan)的(de)模式中(zhong)，生物反(fan)應器以及(ji)細(xi)胞截(jie)留膜(mo)系統(tong)由一(yi)次性材料制(zhi)成，提供了單次的(de)使(shi)用，沒(mei)有(you)清(qing)洗、沒(mei)有(you)蒸汽也沒(mei)有(you)硬(ying)質(zhi)管路系統(tong)。優(you)(you)選(xuan)的(de)細(xi)胞截(jie)留膜(mo)在(zai)生物反(fan)應器外部，并且由中(zhong)空(kong)纖維組成。

能夠用作生物反應(ying)器的(de)適合的(de)一次(ci)性容(rong)器可(ke)購自(zi)一些商(shang)業(ye)來源，比如GE Healthcare，商(shang)品(pin)名為(wei)(wei)Wave或者(zhe)Xcellerex；以(yi)及(ji)來自(zi)ThermoFisher，商(shang)品(pin)名為(wei)(wei)Hyclone SUB；以(yi)及(ji)來自(zi)Sartorius，商(shang)品(pin)名為(wei)(wei)Biostat STR。

平板細胞膜以及中空纖維膜用(yong)于外部細胞截留(liu)筒，可源(yuan)自GE Healthcare(Boston,MA)、Spectrum Labs(Rancho Dominguez,CA)、Refine Technologies(Pine Brook,NJ)或者Pall Corporation(Port Washington,NY)。

實施例

在相(xiang)同條件下(pH、溫(wen)度(du)(du)、細(xi)胞(bao)(bao)密(mi)度(du)(du)、溶解氧、體積流速(volumetric flow rate)、介(jie)質、細(xi)胞(bao)(bao)系等)操作兩套灌注生(sheng)物(wu)(wu)反應(ying)(ying)(ying)器(qi)，一個(ge)用(yong)基(ji)(ji)于(yu)膜(mo)的灌注系統(tong)(生(sheng)物(wu)(wu)反應(ying)(ying)(ying)器(qi)運行3D53)，一個(ge)用(yong)非-膜(mo)系統(tong)(生(sheng)物(wu)(wu)反應(ying)(ying)(ying)器(qi)運行3D51)。這些生(sheng)物(wu)(wu)反應(ying)(ying)(ying)器(qi)中的細(xi)胞(bao)(bao)密(mi)度(du)(du)控制(zhi)在相(xiang)同水平，監測生(sheng)物(wu)(wu)反應(ying)(ying)(ying)器(qi)每(mei)日的生(sheng)產率(lv)，測量滴度(du)(du)(產物(wu)(wu)濃(nong)度(du)(du))。基(ji)(ji)于(yu)細(xi)胞(bao)(bao)密(mi)度(du)(du)和生(sheng)物(wu)(wu)反應(ying)(ying)(ying)器(qi)生(sheng)產率(lv)，計算細(xi)胞(bao)(bao)特定的(細(xi)胞(bao)(bao))生(sheng)產率(lv)。

膜系(xi)統獲自Refine Technologies(Pine Brook,NJ)。常規的(de)非(fei)-膜系(xi)統BIOSEP獲自Applikon(福斯特市，CA)。

圖(tu)顯(xian)示基(ji)(ji)于膜的(de)(de)(de)截留系(xi)統中細(xi)胞(bao)的(de)(de)(de)滴度和特定生(sheng)產率明顯(xian)翻(fan)倍。圖(tu)1和2中的(de)(de)(de)實(shi)心方塊顯(xian)示常規的(de)(de)(de)、非-基(ji)(ji)于膜的(de)(de)(de)細(xi)胞(bao)截留系(xi)統(獲自(zi)Applikon(福(fu)斯(si)特市，CA)的(de)(de)(de)BioSep)的(de)(de)(de)結(jie)果。各(ge)個圖(tu)中的(de)(de)(de)空心圈顯(xian)示獲自(zi)Refine Technologies(Pine Brook,NJ.)的(de)(de)(de)基(ji)(ji)于膜的(de)(de)(de)細(xi)胞(bao)截留系(xi)統的(de)(de)(de)結(jie)果。

考慮(lv)到以上公開(kai)，認為本領域技術人(ren)員(yuan)將進行(xing)眾多變化。因此，意(yi)圖上述公開(kai)和實施(shi)例應當解釋為僅(jin)僅(jin)是示例性(xing)的，并且本發明的范圍應當僅(jin)受限于隨后(hou)的權利(li)要求。