褐色橘蚜ABCG4基因及其dsRNA的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及昆蟲的生長發育調控和基因工程領域，特別涉及一種褐色橘蚜ABCG4 基因及其dsRNA。
【背景技術】
[0002] 褐色橘姐(Toxopteracitricida)是一種世界性的柑橘害蟲，同時是柑橘衰退病 病毒的主要傳播媒介，對柑橘產量和品質影響較大，目前化學防治仍是控制褐色橘蚜的重 要措施。化學農藥施用不當，不僅影響果品安全，同時還會導致嚴重的抗藥性。
[0003] RNA干擾(RNAinterference，RNAi)是近年來發現的一種重要基因沉默手段，是指 在進化過程中高度保守的、由雙鏈RNA(dsRNA，Double-strandedRNA，雙鏈核糖核酸)誘發 的、同源RNA高效特異性降解的現象，是通過dsRNA的介導特異性的降解對應序列的mRNA。由 于使用RNAi技術可以特異性抑制特定基因的表達，所以該技術已被廣泛用于探索基因功能 和基因治療領域。
[0004] ABCG4(ATPbindingcassettetransporterG4)是ABC轉運蛋白G亞家族4號基 因，ABC轉運蛋白又稱腺苷三磷酸結合盒轉運蛋白，是一類重要的跨膜蛋白超家族，其中大 多數ABC轉運蛋白是初級主動運輸轉運體。ABC轉運蛋白需要ATP的結合與水解產生的能量 將底物進行跨膜運輸。ABC轉運蛋白輸送的分析包括糖類，脂質，肽和氨基酸，重金屬離子及 其共輒物，以及有毒的代謝產物和化學藥物，ABC轉運蛋白的生理功能在細菌和脊椎動物中 已進行了廣泛的研究，但是目前針對褐色橘姐ABC轉運蛋白的相關研究較少，也未見針對褐 色橘姐ABC轉運蛋白基因的dsRNA的報道。

【發明內容】

[0005]本發明所要解決的技術問題在于克服已有技術的缺陷，提供一種褐色橘蚜ABCG4 基因及其dsRNA。
[0006]本發明的技術方案如下：
[0007] 一種褐色橘!i!牙ABCG4基因，其序列如SEQIDN0:3所示。
[0008] 一種褐色橘姐ABCG4基因的dsRNA，其序列如SEQIDN0:6所示。
[0009] 一種褐色橘蚜ABCG4基因的dsRNA的合成方法，包括如下步驟:提取褐色橘蚜的總 RNA，反轉錄成為cDNA作為擴增模板，以序列為SEQIDN0:4的上游引物和以序列為SEQID NO: 5的下游引物進行PCR擴增，PCR擴增產物進行電泳后回收產物，以膠回收產物為模板合 成得到褐色橘姐ABCG4基因的dsRNA。
[0010] 在上述技術方案中，PCR擴增時25μ1的PCR反應體系包括:濃度為800-1200ngAU的 cDNA模板0·5μ1，濃度為0·15-0·25μΜ的上、下游引物各lyl，PrimeSTARMaxPremix12·5μ1 以及去核酸酶水?〇μ1。
[0011] 在上述技術方案中，PCR反應條件為：95°C預變性3min;95°C變性30s、60°C退火 10s、72°C延伸2min，共35個循環;72°C條件下延伸lOmin。
[0012] 本發明的有益效果是:本發明鑒定得到褐色橘姐ABCG4基因序列，并根據該序列得 到ABCG4基因的dsRNA，可以應用于對褐色橘蚜進行RNA干擾從而起到防治褐色橘蚜的效果。 通過實驗驗證，該dsRNA基因沉默效率高，基因干擾后褐色橘蚜有明顯表型變化，解決了褐 色橘蚜目前沒有有效的ABCG4基因的dsRNA的問題，在研發新型殺蟲劑方面有很好的應用前 景。
【附圖說明】
[0013] 圖1為褐色橘姐ABCG4基因在NCBI中ProteinBlast比對圖。
[0014]圖2為褐色橘姐ABCG4基因氨基酸序列與其它昆蟲ABC轉運蛋白系統發育樹圖。
[0015]圖3為本發明實施例中的飼喂dsRNA的裝置。
[0016] 圖4為褐色橘蚜飼喂ABCG4基因的dsRNA后的ABCG4基因相對表達量，其中GFP表示 對照組，dsABCG4表示實驗組。
[0017] 圖5為褐色橘蚜飼喂ABCG4基因的dsRNA后表型表現圖；其中1為對照組的正常褐色 橘蚜，2為實驗組的翅發育不正常的褐色橘蚜。
【具體實施方式】
[0018]本發明實施例所用化學試劑來源如下：
[0019]LATaqMIX(Takara公司，日本）
[0020] TRIzol kit(Invitrogen公司，美國）
[0021] RNeasy Plus Micro Kit(QIAGEN公司，德國）
[0022] PrimeSTAR Max Premix(Takara公司，日本）
[0023]膠回收純化試劑盒(Takara公司，日本）
[0024] Transcript Aid T7 High Yield Transcription Kit(Thermo fisher Scientific公司，美國）
[0025] Perfect real time RT reagent(Takara公司，日本）
[0026](j:〇Tkq?qPCR Master Mix(Promega公司，美國）
[0027]TranscriptAid Enzyme Mix(Thermo fisher Scientific公司，美國）
[0028] ATP/CTP/GTP/UTP Mix(Thermo fisher Scientific公司，美國）
[0029]PrimeScriptRTEnzymeMixI(ThermofisherScientific公司，美國）
[0030] Oligo dT Primer(The;rmo fisher Scientific公司，美國）
[0031]Random6mers(ThermofisherScientific公司，美國）
[0032]實施例一、褐色橘姐ABCG4基因序列鑒定
[0033]1)從褐色橘蚜轉錄組數據（西南大學昆蟲學與害蟲控制重點實驗室提供）中查找 可能的ABCG4Unigene序列，通過tBlastn，在轉錄組當中查找到一條unigene序列。
[0034] 2)利用RNA提取試劑盒RNeasyPlusMicroKit按照使用說明提取褐色橘蚜的總 RNA，然后利用反轉錄試劑盒PerfectrealtimeRTreagent按照使用說明將lyg總RNA反 轉錄成為cDNA。
[0035] 3)以上述得到的cDNA為模板，設計全長擴增引物，利用上下游引物ABCG4-A和 ABCG4-S進行PCR擴增;PCR條件為:95°C預變性3min; 95°C變性30s、60°C退火10s、72°C延伸 2min，共35個循環;72°C條件下延伸lOminJCR反應體系共25μ1，包括:濃度為lOOOng/μΙ的cDNA模板ΙμL，濃度為0·15-0·25μΜ的上下游引物各lyl，LATaqMIX0.25yl，10XBuffer (Mg2+plus)3yl，dNTP4μ1 以及去核酸酶水 14·75μ1;引物ABCG4-A(如SEQIDNO:l所示）和 ABCG4-S(如SEQIDNO:2所示）的序列如下：
[0036] ABCG4-A:TATGGAGCCGAAAGATGA，
[0037] ABCG4-S：CCGTCTATTTATACAACGAAAC〇
[0038] 4)將PCR產物在1 %瓊脂糖凝膠電泳中進行分離，得到1830bp左右的條帶，將PCR產 物送測序公司進行測序。
[0039] 5)將測序結果通過手工校對，序列拼接，并在NCBI中進行Protein Blast相似性比 對，比對結果如圖1所示，可見褐色橘姐ABCG4基因與豌豆姐(Acyrthosiphon pisum)ABCG4基因同源性最高，高達95%。與其他昆蟲比對結果也發現，可與其他昆蟲的ABCG4基因比對 上，說明本克隆獲得的基因為褐色橘姐ABCG4基因。
[0040] 6)通過氨基酸系統發育樹的構建，如圖2所示，褐色橘蚜ABCG4基因與豌豆蚜基因 聚到一枝，此外與半翅目的獵蝽與木虱同源性也較高，確定得到的序列為褐色橘蚜ABCG4基 因序列（如SEQID從):3所示）。
[0041 ] 實施例二、褐色橘姐ABCG4基因的dsRNA的合成
[0042] 1)根據褐色橘蚜轉錄組數據(西南大學昆蟲學與害蟲控制重點實驗室提供），設計 擴增ABCG4基因的上下游引物T7-ABCG4-S1(如SEQIDN0:4所示）、T7-ABCG4-A1(如SEQID N0:5所示），合成引物，引物序列分別為：
[0043] T7-ABCG4-S1：
[0044] TAATACGACTCACTATAGGGATGGGAAGTGTTTAACATG；
[0045] T7-ABCG4-A1：
[0046] TAATACGACTCACTATAGGGACATGCCAAATCTATTCCA。
[0047] 2)利用RNA提取試劑盒RNeasy Plus Micro Kit按照使用說明提取褐色橘蚜的總 RNA，然后利用反轉錄試劑盒Perfect real time RT reagent按照使用