一種重組蛋白a及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術領域。具體地，本發明涉及一種新型重組金黃色葡萄球菌蛋 白A及其在蛋白分離純化中的應用。
【背景技術】
[0002] 金黃色葡萄球菌蛋白A(Staphylococal Protein A, SpA)包括5個結構域，分別為 E、D、A、B、C，其中B結構域（B片段）對結合免疫球蛋白結合力最強。野生型葡萄球菌蛋白 A以及重組葡萄球菌蛋白A(rPA)和改良型蛋白已經被廣泛用于親和層析領域，由葡萄球菌 蛋白A制成的親和層析介質被廣泛地用于捕獲抗體，去除宿主蛋白和殘留DNA。
[0003] 親和層析介質往往需要清洗，目的是為保留親和配基的選擇性和高度特異性以及 防止細菌污染，通常采用0.1~0.5M NaOH溶液進行沖洗，其pH范圍在12~14之間。由 于蛋白在此堿性條件下易發生變性，失去活性功能。因此，將親和層析介質進行堿液原位清 洗，多次循環后，介質對靶分子的結合力將顯著喪失，不僅加重了純化成本，而且，由于蛋白 A的脫落，也降低了目標產物的純度。
[0004] 金黃色葡萄球菌蛋白A的B片段經改造成Z片段，其氨基酸序列第29位的甘氨酸 被替換為丙氨酸（Stahl 等，1999. Affinity fusions in biotechnology:focus on protein A and protein G, in The Encyclopedia of Bioprocess Technology:Fermentation, Bioc atalysis and Bioseparation· M. C. Fleckinger 和 S. W. Drew,編輯· John Wiley and Sons Inc.，紐約，8-22)。Z片段被用作親和層析中的配基，相較于B片段，Z片段顯示出對除了 NaOH之外的某些化學試劑增強的穩定性，但是在較高的堿性條件下，仍然是不穩定的，不能 滿足于工業上在線清洗（Cleaning In Place，CIP)再生的需要。因此，本領域仍然需要開 發一種更穩定，尤其是耐堿性更強的蛋白A。

【發明內容】

[0005] 本發明的目的是提供一種新型重組金黃色葡萄球菌蛋白A聚體，其功能包括但不 限于作為一種配基特異性地結合免疫球蛋白。
[0006] 在本發明的第一方面中，提供了 一種重組蛋白A聚體，所述重組蛋白A聚體是兩個 或多個金黃色葡萄球菌蛋白A的Z片段串聯形成的多聚體，并且各Z片段中的至少一個為 具有以下氨基酸突變的Z片段突變體：Asn3Asp、Asn6Leu和Asn23Thr。
[0007] 在另一優選例中，所述的Z片段中的每一個為具有以下氨基酸突變的Z片段突變 體：Asn 3Asp、Asn6Leu 和 Asn23Thr。
[0008] 在另一優選例中，所述的重組蛋白A聚體為2-20聚體，較佳地4-10聚體。
[0009] 在另一優選例中，所述的重組蛋白A聚體為4聚體、6聚體、8聚體、10聚體。
[0010] 在另一優選例中，所述的重組蛋白A聚體中相鄰的兩個Z片段直接相連，或通過連 接肽相連。
[0011] 在另一優選例中，所述重組蛋白A聚體由Z片段和連接肽構成；所述連接肽存在 于Z片段之間，并且所述Z片段全部是具有以下氨基酸突變的Z片段突變體：Asn3Asp、 Asn6Leu 和 Asn23Thr。
[0012] 在另一優選例中，所述的重組蛋白A聚體具有式（I)所示的結構：
[0013] Pa-(Za_L) n-Za-Pb (I)
[0014] 式中，
[0015] Pa為無、Met、前導序列、分泌肽序列、用于純化的標簽序列或其組合；
[0016] 各Za獨立地為金黃色葡萄球菌蛋白A的Z片段的氨基酸序列，并且至少一個Za 為具有以下氨基酸突變的Z片段突變體：Asn3Asp、Asn6Leu和Asn23Thr ;
[0017] L獨立地為無、或連接肽序列；
[0018] η為彡1的正整數；
[0019] Pb為無、Cys、純化的標簽序列或其組合。
[0020] 在另一優選例中，η為1-50的正整數，較佳地2-20的正整數，較佳地2、3、4、5、6、 7或8。
[0021] 在另一優選例中，所有的Za為具有以下氨基酸突變的Ζ片段突變體:Asn3Asp、 Asn6Leu 和 Asn23Thr。
[0022] 在另一優選例中，所述的Za的序列如SEQ ID No. :3所示。
[0023] 在另一優選例中，所述的L為長度3-50個（較佳地3-20個）氨基酸的連接肽序 列。
[0024] 在另一優選例中，所述的L選自下組：QKDAVFP、ASTKGP。
[0025] 在另一優選例中，所述的重組蛋白A聚體具有式（II)所示結構：
[0026] Met-Za-L-Za-L-Za-L-Za-Cys (II)
[0027] 其中，Za、L定義同上。
[0028] 在另一優選例中，所述重組蛋白A聚體為具抗體結合能力的蛋白。
[0029] 在另一優選例中，所述的抗體包括IgG抗體、IgM抗體、IgA抗體。
[0030] 在另一優選例中，所述重組蛋白A聚體的C末端還含有氨基酸殘基Cys。
[0031] 在另一優選例中，所述重組蛋白A聚體具有如SEQ ID No. :5所示的氨基酸序列。
[0032] 本發明在第二方面提供了一種多核苷酸，所述多核苷酸編碼本發明第一方面項所 述重組蛋白A聚體。
[0033] 在已知蛋白質氨基酸序列的情況下，本領域技術人員可以根據需要設計合適的編 碼所述氨基酸序列的多核苷酸序列，并將其表達。
[0034] 在另一優選例中，所述的多核苷酸的序列如SEQ ID N0. :1所示。
[0035] 本發明的第三方面提供了一種載體，所述載體含有本發明第二方面所述的多核苷 酸。
[0036] 本發明的第四方面提供了一種宿主細胞，所述的宿主細胞含有本發明第三方面所 述的載體或其基因組中整合有本發明第二方面所述的多核苷酸。
[0037] 本發明的第五方面提供了一種生產本發明第一方面所述重組蛋白A聚體的方法， 包括步驟：
[0038] (a)培養本發明第四方面所述的宿主細胞，從而表達本發明第一方面所述的重組 蛋白A聚體；和
[0039] (b)從培養體系中分離或純化所述的重組蛋白A聚體。
[0040] 本發明的第六方面提供了一種親和層析介質，所述親和層析介質含有本發明第一 方面所述的重組蛋白A聚體。
[0041] 在另一優選例中，在所述親和層析介質中，所述的重組蛋白A聚體被固定于或結 合于載體。
[0042] 在另一優選例中，所述的重組蛋白A聚體通過硫醚鍵偶聯結合于載體。
[0043] 本發明的第七方面提供了一種純化方法，包括步驟：對于待純化的原料，用本發明 第六方面所述的親和層析介質進行親和層析。
[0044] 在另一優選例中，所述的純化是用于純化抗體。
[0045] 在另一優選例中，所述的待純化的原料是含有待純化抗體的液態原料（如培養 液、發酵液等）。
[0046] 本發明的重組蛋白A具有較高的耐堿性，采用所述的重組蛋白A可提高親和層析 過程中蛋白的穩定性和最大載量。
[0047] 應理解，在本發明范圍內中，本發明的上述各技術特征和在下文（如實施例）中具 體描述的各技術特征之間都可以互相組合，從而構成新的或優選的技術方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附圖說明】
[0048] 圖1為表達質粒pET30a_4Z'的圖譜。
[0049] 圖2為含有質粒pET30a-4Z'的大腸桿菌BL21 (DE3)經IPTG誘導表達重組蛋白A 聚體的SDS-PAGE電泳圖，其中各泳道分別為：1 :誘導前，2 :誘導后2h