專利名稱：檢測膜通道蛋白與靶向藥物的相互作用的方法及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測膜通道蛋白與靶向藥物的相互作用的方法及其應用。
背景技術：
細胞電壓門控鈉通道(VGSCs)在神經元和其他可興奮性細胞動作電位形成和傳導過程中有非常重要的作用，其細微變化或表達異常都會導致功能改變，是導致癲癇、疼痛、 先天性肌肉強直癥、周期性癱瘓等各種疾病的關鍵因素，一直是研究的熱點。但是在長期的進化和演變中，鈉通道形成了一系列亞型，廣泛分布在生物體各個組織中。其亞型的多樣性使得研究過程中針對亞型的區分和鑒定尤為重要，而特異性通道靶向藥物則成為不可或缺的工具。鈉通道靶向藥物能夠針對鈉通道不同的亞型，具有各種不同的結合位點和作用方式，使得能夠通過兩者之間相互的結合和作用，成為鈉通道亞型區分和鑒定的探針，同時也是研究鈉通道功能的工具。BmK I是由東亞短鉗蝎中提取分離得到的鈉通道特異性靶向藥物，是一個由60-70 個氨基酸組成的長鏈肽類，能夠作用于鈉通道，改變鈉通道的電生理特征，顯著延緩其失活過程。其機理是由于鈉通道由一個形成孔道的功能性α亞基，一個或數個輔助β亞基組成。α亞基是鈉通道行使功能的關鍵亞基，由四個高度同源的結構域(D I -D IV)組成，每個結構域含有六個跨膜α螺旋片段(S1-S6)。在其結構上目前已經鑒定了至少七個通道靶向藥物的受體位點。sra技術可以觀測生物分子的動態結合，實驗時將一種生物分子固定在特殊的芯片上，利用液體傳送系統將溶解有另一種生物分子的結合緩沖液流經芯片，當溶液中的分子與固定在芯片上的分子相互結合時會改變芯片表明的溶液折射率(Resonance Unit, RU)，折射率的變化與結合在芯片表面的生物分子質量成正比。儀器通過跟蹤檢測折光率的變化，進而分析出生物分子之間結合、解離的整個過程。sra技術能夠實時檢測生物分子間的相互作用，不必使用任何標記，能夠保證生物分子的天然活性。全細胞膜片鉗能夠進行單個細胞的電生理記錄，通過給予單個細胞電刺激(一定閾值的電壓或電流刺激)，或化學刺激(特異性靶向藥物等)可以記錄到由離子通道開放關閉所引起的電流或電壓信號，這一信號即可反映離子通道的電生理學性質，是研究離子通道性質的重要指標。而膜通道靶向藥物作用于通道之后，可以引起通道電生理學性質的改變，從而為研究離子通道提供依據。鈉通道作為一個大分子量的膜蛋白(260KD)，如何能夠分離純化而不影響其活性， 保證其完整的結構，是目前尚未解決的難題，而sra技術檢測動態結合，往往是需要能夠獲得待研究的生物分子樣本，因此膜通道蛋白分離純化的難題，在某種程度上就制約了它的使用，本發明利用人工合成關鍵結合序列肽鏈的方法，克服了此類限制，并成功驗證了其可行性，使得利用sra技術研究膜通道蛋白與其靶向藥物結合成為可能。

發明內容
本發明的目的之一在于提供一種檢測膜通道蛋白與靶向藥物相互作用的方法。本發明的目的之二在于提供該檢測方法的應用。為達到上述目的，本發明采用如下實驗方案
一種檢測膜通道蛋白與靶向藥物相互作用的方法，其特征在于該方法的具體步驟為
a.根據膜通道蛋白上與其靶向藥物相互作用位點上的關鍵氨基酸序列，合成肽鏈；
b.采用表面等離子共振技術檢測步驟a所得的肽鏈與靶向藥物的相互作用。上述的膜通道為細胞電壓門控鈉通道，該通道的位點3與其靶向藥物相互作用的關鍵氨基酸序列為D IV /S3-S4胞外環，根據該關鍵氨基酸序列設計的兩段肽鏈為
rNavl. 5 SIVGTVLSDIIQKYFFSPTL rNavl. 8 SIGSLLFSAILKSLENYFSPTL ； 所述的靶向藥物為鈉通道靶向藥物BmK I。上述的步驟b的具體方法為
a.靶向藥物的芯片固化
注 Λ 40OmM 的 N-ethyl-N-(dimethylaminepropyl)-carbodiimid 禾口 IOOmM 的 N-hydroxy-succimide的按1: 1的體積比混合成的混合液，激活CM5傳感器芯片上的偶聯基團-COOH ；將靶向藥物以23 μ g/ml的配置濃度置于pH5. OUOmM醋酸鈉溶液中，取30 μ 1 注入芯片；
b.取一系列結合反應終濃度下的肽鏈分別以20ul/min的流速通過步驟a所得的固化有靶向藥物的傳感器芯片；所有反應在4°C進行；使用的結合反應液為NaCl 150 mM, CaCl2 1.2 mM, MgCl2 1 mM, KCl 3.5 mM, HEPES 10，D-glucose 20 mM，用 NaOH 調至 ρΗ7· 4。上述的肽鏈為
rNavl. 5 SIVGTVLSDIIQKYFFSPTL
rNavl. 8 SIGSLLFSAILKSLENYFSPTL ；所述的靴向藥物為鈉通道靴向藥物BmK I。本發明選取鼠源鈉通道亞型1.5 (rNavl. 5)作為陽性對照，SI3R能觀察到明顯結合信號，其電生理性質能夠被Bmk I顯著影響。以鼠源鈉通道亞型1.8 (rNavl. 8)與其對照， 發現通過Sra技術能觀察到結合信號，但Bmk I與其結合后，rNavl. 8的電生理性質未有顯著變化，由此發現BmK I對于rNavl. 8的新特性。BmK I作為特異性鈉通道靶向藥物，能夠結合rNavl. 8卻不影響其功能。本發明經人工合成膜通道蛋白相關的關鍵性氨基酸序列肽鏈，同時運用表面等離子共振(Surface Plasmon Resonance，SPR)技術實時檢測合成的膜通道蛋白肽鏈與其靶向藥物相互作用的動態結合，再經電生理記錄，來檢測膜通道的功能變化。本發明運用該方法，驗證了鈉通道亞型1. 8對其靶向藥物BmK I的選擇敏感性，即BmK I能夠結合鈉通道亞型1.8，但是不影響其功能，而本發明的鈉通道靶向藥物BmK I能夠與鈉通道上受體位點3 結合。受體位點3由VGSCs的D I /S5-S6、D IV /S5-S6、以及D IV /S3-S4組成，其中D IV / S3-S4這段序列中的氨基酸對通道與位點3靶向藥物結合至關重要。由此證明本發明從技術層面為研究研究膜通道蛋白生理/病理功能及其與靶向藥物相互作用開拓了新思路，提供了新的可行檢測方法。


圖1為Bmk I影響鈉通道(rNavl. 5，rNavl. 8)功能的電生理記錄。其中，(A)300nM BmK I 施加前后，rNavl. 5 電流的變化；(B) I5ms/Ipeak (rNavl. 5) ； (C) 300nM BmK I 給藥 rNavl. 8 的影響；(D) I5ms/Ipeak (rNavl. 8)。圖2為位于鈉通道(rNavl. 5，rNavl. 8)位點3的關鍵氨基酸序列肽鏈與鈉通道靶向藥物(BmK I)的相互作用結果。其中，(A)和(B)分別為rNavl. 5和rNavl. 8位點3上關鍵氨基酸序列合成肽鏈與BmK I結合情況(一系列濃度分別為1X10_9，2.5X10_9，5X10_9， 7. 5X10_9，1X10_8 mol/L)。
具體實施例方式實施例一表面等離子共振(SH ，BIACore 3000)檢測位于鈉通道 (rNavl. 5，rNavl. 8)位點3的關鍵氨基酸序列肽鏈與鈉通道靶向藥物(BmK I)的相互作用。1.定位鈉通道位點3的關鍵氨基酸序列，并工人合成肽鏈。根據先前的文獻報道和研究，位點3靶向藥物通過結合鈉通道位點3影響其功能， 其中D IV /S3-S4胞外環是重要組成部分，這段氨基酸序列對通道與位點3靶向藥物的結合至關重要。因此，通過檢索比對鈉通道氨基酸序列，列出rNavl. 5和rNavl. 8的該段序列
rNavl. 5 SIVGTVLSDIIQKYFFSPTL rNavl. 8 SIGSLLFSAILKSLENYFSPTL
人工合成兩段多肽(由吉爾生化有限公司合成)，分子量分別為2228. 63和2400. 82，純度分別為95. 75%和96. 41%，液相色譜和質譜報告由公司提供。(本說明書中未列出)
以細胞外液(mM :NaCl 150，CaCl2 1.2，MgCl2 1,KC1 3. 5，HEPES 10，D_glucose 20，用 NaOH 調至 ρΗ7· 4)溶解為 1 X l(T8mol/L，-20° 保存。2. SI3R檢測多肽鏈與BmK I結合
采用全自動生物傳感器BIACore -3000 (Pharmacia公司)實時分析兩段多肽鏈與BmK I的結合效應。丨I)BmK I的芯片固化
注入 40 μ 1 的 400mM 的 N-ethyl-N-(dimethylaminepropyl)-carbodiimid 禾口 IOOmM 的N-hydroxy-succimide的按1:1的體積比混合而成的混合液，激活CM5傳感器芯片上的偶聯基團-C00H。將BmK I以23 μ g/ml的配置濃度置于IOmM醋酸鈉溶液中(pH5. 0)，取 30μ1注入芯片。實際觀測到的芯片結合量為1020共振單位(RU)。芯片表面上過量的偶聯基團可被!35μ1的IM ethanolamine hydrochloride (pH 8. 0)去活化。整個過程使用 BIACore -3000 專用的 HBS 緩沖液150Mm NaCl ；3. 5mM EDTA ；0. 05% BIACore _3000 表面活性劑 P-20 禾口 IOmM HEPES, pH 調至 7. 4. U與多肽的結合
一系列不同濃度的多肽以20ul/min的流速通過固化有BmK I的傳感器芯片。所有反應均在 4°C進行。使用的結合反應液NaCl 150 mM, CaCl2 1.2 mM, MgCl2 1 mM, KCl 3.5 mM, HEPES 10，D-glucose 20 mM，用 NaOH 調至 ρΗ7· 4。結合反應實驗程序完成后，繼續在結合緩沖液的使用環境下，等待二者解離，解離程序完成后，固化芯片以5mM NaOH再生。實驗過程中與BIACore -3000相連接的計算機實時記錄反應信號，并使用BIA Evaluation軟件包分析數據。
結果顯示一系列濃度(1X10-9，2.5X10-9，5X10-9，7.5X10-9，1X10_8)的多肽與 BmK I均有顯著的快速結合，并且具有濃度依賴性，結合量RU值隨著多肽濃度的增加而上升。參見圖2。結果表明rNavl. 5上肽鏈能夠與BmK I顯著結合，KA值為1. 61 X IO8 (1/M)，KD 值為6. 23 X KT9(M)，在芯片上的最大結合量為92. 6 (RU)。而rNavl. 8上肽鏈同樣觀察到了與BmK I的結合，KA值為6. 71 XlO8(1/M)，KD值為1. 49X 10_9(M)，芯片最大結合量為 40. 3 (RU)。通過SI3R檢測表明，BmK I能夠與rNavl. 5，rNavl. 8顯著性結合。實施例二 Bmk I影響鈉通道(rNavl. 5，rNavl. 8)功能的電生理記錄 1外源表達rNavl. 5和rNavl. 8
EI ]制備 rNavl. 5 (pCDNA3. 1+rNavl. 5)和 rNavl. 8 (pEGFP-N2+rNavl. 8)質粒，以兩種質粒分別轉化大腸桿菌DH5 α，用氨芐青霉素(50mg/L)篩選rNavl. 5陽性菌落，用卡那霉素(50mg/L)篩選rNavl. 8陽性菌落。用LB培養基擴大培養菌株，使用質粒大提試劑盒 (TianGen公司)進行質粒大量抽提。(具體步驟見試劑盒說明書)。(2)培養HEK293T細胞系和ND7/23細胞系并轉染。HEK293T細胞用含10%胎牛血清(FBS)，4mM Glutamine的DMEM培養基培養；ND7/23細胞用含10%胎牛血清(FBS)，2mM Glutamine的DMEM培養基培養。兩種細胞均置于含5% CO2的37°培養箱中培養，采用胰蛋白酶(0.025%)消化法進行細胞傳代。在轉染前M小時傳代，接種于35mm培養皿。待細胞長滿平皿的60%左右，進行轉染。細胞轉染采用脂質體Lipoefectamin 2000( Invitrogen, he)轉染試劑，嚴格按照轉染試劑說明書進行操作。rNavl. 5轉染于HEK293T細胞；rNavl. 8 轉染于ND7/23細胞。以8μ 1脂質體攜帶3μ g質粒轉染細胞(具體步驟見轉染試劑說明書)。2全細胞膜片鉗記錄鈉通道電流轉染后24-48小時的細胞用于膜片鉗實驗。膜片鉗記錄均在室溫下(20-22°C)進行。記錄玻璃微電極(內徑1.5mm，武漢微探款科學儀器有限公司，中國)經兩步拉制儀(Narishige，PC-10, Japan)垂直拉制而成，充灌電極內液 (mM, CsF 140，CsCl 10，MgCl2 2，EGTA 10，HEPES 10 ；用 CsOH 調節至 ρΗ7· 3)后，電極阻抗為2ΜΩ左右。在倒置顯微鏡下，通過微操縱儀將充灌電極內液的記錄電極輕輕壓向細胞表面。當封接阻抗增加時，再使電極稍稍下降，并迅速通過記錄電極內部施加適當負壓，使電極和細胞表面形成緊密封接。在此基礎上繼續施加負壓破膜，即形成全細胞記錄方式。采用Axopatch 200Β膜片鉗放大器采集電流信號，電流信號經AD/DA轉換器進入計算機后， 由pCLAMPS. 2軟件的Clampex采樣程序采入，采樣頻率為20ΚΗζ。電流信號經膜片鉗放大器低通貝塞爾濾波(low-pass Bessel filter)，_3dB頻率為2KHz。串聯電阻補償為85-95%。 均采用Clampex采樣程序提供的P/N漏減功能(P/N leak Subtraction)消除漏電流，N=_4 (P/-4，施加4個與階躍脈沖時程相同、極性相反的漏減脈沖，幅度為階躍脈沖的1/4)。全細胞記錄形成至少10分鐘待電流穩定后再進行實驗觀察。BmK I 溶解于細胞外液(mM :NaCl 150，CaCl2 1. 2，MgCl2 1，KCl 3. 5，HEPES 10， D-glucose 20，用NaOH調至pH7. 4)。加藥管直徑約為100 μ m，距離細胞約100 μ m，給藥速度為 200-300 μ 1/min。
本發明表達rNavl. 5的載體為HEK293T細胞系，非轉染的HEK293T細胞的平均本底電流密度為D=5.53 士0.21 pA/pF(n=15)，這些本底電流與在轉染細胞中激活的電流相比要小得多，因此在分析時可以忽略不計。參見圖1，將細胞鉗制于-140mv時，給予_20mv 躍階刺激，比較300nM BmK I施加前后，rNavl. 5電流的變化(如圖IA所示)。為了定量描述 BmK I對rNavl. 5失活的影響，將去極化刺激開始后4. 5ms到5ms間的電流平均值與此電壓下峰值的比值定義為IaiisAprak作為BmK I對通道失活過程影響的指標。統計分析發現， 加藥前，rNavl. 5失活較快，IaisApeak僅占峰鈉電流的0. 14士0. 01 (n=32)；施加300 nM BmK I后，rNavl. 5失活化過程極其顯著地被延緩，此比值變為0. 62士0. 02(n=21)(如圖IB所示)。表達rNavl. 8的載體為ND7/23細胞系。據已有研究表明，ND7/23具有內源性本底電流，但是可以被500nM TTX (河豚魚毒素)完全阻斷，而rNavl. 8是TTX不敏感型鈉通道 (TTX-R通道，IC50彡100yM)，500nm TTX不會阻斷rNavl. 8的電流。在記錄rNavl. 8電流時，在細胞外液中添加500nM TTX，可記錄到單獨的rNavl. 8通道電流。圖IC所示，鉗制電位為_80mv，給予細胞+IOmv刺激時，施加300nM BmK I前后(施加時間為IOmin)的rNavl. 8 電流，同樣使用I5msApeak作為量化指標，施加300nM BmK I前后rNavl. 8電流的失活沒有顯著性差異:I5fflS/Ipeak加藥前后分別為0. 62士0. 02 (n=8)和0. 61 + 0. 01 (n=4)。(圖ID所示)
結果可發現，300nM BmK I能夠影響rNavl. 5，顯著延緩其失活過程，而對rNavl. 8則無明顯效果。通過電生理記錄，檢測出通道靶向藥物(BmK I)對于通道(rNavl. 5，rNavl. 8)功能的影響。兩種檢測結果對比發現，BmK I對于rNavl. 5來說，功能影響和動態結合具有一致性，但是對于rNavl. 8來說，二者存在差異，BmK I能夠結合rNavl. 8，實際上卻并不顯著影響其功能。由此證明本方法能夠從技術層面為研究研究膜通道蛋白生理/病理功能及其與靶向藥物相互作用開拓新思路，是具備可行性的檢測方法。
權利要求
1.一種檢測膜通道蛋白與靶向藥物相互作用的方法，其特征在于該方法的具體步驟為a.根據膜通道蛋白上與其靶向藥物相互作用位點上的關鍵氨基酸序列，合成肽鏈；b.采用表面等離子共振技術檢測步驟a所得的肽鏈與靶向藥物的相互作用。
2.根據權利要求1中所述的檢測膜通道蛋白與靶向藥物相互作用的方法，其特征在于所述的膜通道為細胞電壓門控鈉通道，該通道的位點3與其靶向藥物相互作用的關鍵氨基酸序列為D IV /S3-S4胞外環，根據該關鍵氨基酸序列設計的兩段肽鏈為rNavl. 5 SIVGTVLSDIIQKYFFSPTL rNavl. 8 SIGSLLFSAILKSLENYFSPTL ； 所述的靶向藥物為鈉通道靶向藥物BmK I。
3.根據權利要求1所述的檢測膜通道蛋白與靶向藥物相互作用的方法，其特征在于所述的步驟b的具體方法為a.靶向藥物的芯片固化注 Λ 400mM 的 N-ethyl-N-(dimethylaminepropyl)-carbodiimid 禾口 IOOmM 的 N-hydroxy-succimide的按1: 1的體積比混合成的混合液，激活CM5傳感器芯片上的偶聯基團-COOH ；將靶向藥物以23μβ/πι1的配置濃度置于pH5. OUOmM醋酸鈉溶液中，取30 μ 1 注入芯片；b.取一系列結合反應終濃度下的肽鏈分別以20ul/min的流速通過步驟a所得的固化有靶向藥物的傳感器芯片；所有反應在4°C進行；使用的結合反應液為NaCl 150 mM, CaCl2 1.2 mM, MgCl2 1 mM, KCl 3.5 mM, HEPES 10，D-glucose 20 mM，用 NaOH 調至 ρΗ7· 4。
4.根據權利要求3所述的檢測膜通道蛋白與靶向藥物相互作用的方法，其特征在于所述的肽鏈為rNavl. 5 SIVGTVLSDIIQKYFFSPTLrNavl. 8 SIGSLLFSAILKSLENYFSPTL ；所述的靴向藥物為鈉通道靴向藥物BmK I。
全文摘要
本發明涉及一種檢測膜通道蛋白與靶向藥物的相互作用的方法及其應用。該方法的具體步驟為根據膜通道蛋白上與其靶向藥物相互作用位點上的關鍵氨基酸序列，合成肽鏈；采用表面等離子共振技術檢測步驟a所得的肽鏈與靶向藥物的相互作用。發明從技術層面為研究研究膜通道蛋白生理/病理功能及其與靶向藥物相互作用開拓了新思路，提供了新的可行檢測方法。
文檔編號C07K14/00GK102565006SQ20121000805
公開日2012年7月11日 申請日期2012年1月12日 優先權日2011年5月19日
發明者馮興華, 葉品, 吉永華, 楊宏天, 董邦乾 申請人:上海大學