HNP-1-Fc重組蛋白的制備方法及應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及HNP蛋白，具體涉及一種HNP-1-Fc重組蛋白的制備方法及應用。
【背景技術】
[0002] 感染性疾病，包括細菌，病毒和真菌感染，是世界各國臨床病人死亡的主要原因之 一。特別是在包括中國在內的發展中國家中尤為嚴重，是全球公共健康最嚴重的威脅之一。 另一方面，盡管作為抗感染的主要工具的抗生素已廣泛應用，但細菌感染的發病率和死亡 率仍然居高不下。抗生素在臨床實踐和其他領域如農業和糧食生產中的濫用更導致大量多 重耐藥微生物的出現。據報道，在美國70%的感染至少對一種抗生素藥物有抗藥性。感染 及傳染性疾病不僅是一個嚴重的醫療問題，同時也造成了沉重巨大的經濟負擔，進而對全 球的政治，經濟和社會產生了巨大的影響。顯然，探索新的具有不同殺菌機制的抗菌藥物來 治療感染性疾病有著巨大而迫切的需求。近年來，人類的天然抗菌肽（AMPS)作為一類新型 抗生素，備受關注。
[0003] 防御素是富含半胱氨酸的小陽離子蛋白和人類的主要天然抗菌肽（AMPS)之一。 作為宿主防御肽，它們的功能在人類先天免疫中發揮了關鍵作用。a-防御素是人類防御素 的一種主要類型，人類嗜中性粒細胞肽（Human neutrophil peptides 1，HNP-1)是a-防 御素主要組成成分。HNP-1是人類最豐富而重要的防御肽儲備，主要表達在人類中性粒細 胞中，占細胞中總蛋白的5%，嗜天青顆粒細胞內總蛋白50%以上。a-防御素具有廣譜的 殺滅革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌、真菌和許多有包膜病毒和非包膜病毒效果。與其他類 抗生素相比，a-防御素代表了一類新的抗生素。a-防御素的優勢是采取了完全不同的 殺菌機制，直接攻擊微生物胞壁，并導致微生物死亡。因此，對于這類抗生素，目標微生物不 太可能產生耐藥性。a-防御素水平在健康受試者體內是相當低的。已知局部和循環水平 a _防御素的顯著增加與肺中性粒細胞的數目升高及病原體局部浸入有關聯。常常出現在 感染和炎癥性疾病中，如急性呼吸窘迫綜合征（ARDS)，敗血癥，肺炎，肺結核，肺移植和慢性 阻塞性肺疾病（C0PD)等，表明a-防御素在炎癥性疾病的發病機理中起著重要作用。有新 的證據表明a-防御素可作為新的生物標志物用于感染和炎癥性疾病診斷和預后判斷。
[0004]目前HNP主要靠天然純化，化學合成或者細菌表達獲取。天然純化因其來源有限， 無法商品化大量應用。化學合成則價格昂貴且生物活性很低。細菌表達的重組蛋白，雖然具 有天然多肽的氨基酸序列，但由于缺乏適當的哺乳細胞內表達翻譯后的蛋白折疊與修飾， 所以其活性均不及天然蛋白，而且生產成本高，產量低，易污染。
[0005] 在過去幾十年里，人類對動物細胞的培養技術進行了大量的研究開發，取得了很 大進展，但是利用CH0-K1細胞表達外源基因的技術水平尚不能滿足生物藥品的開發和生 產的要求，目前上游工作中主要存在以下問題：
[0006] ①構建的重組CH0-K1細胞生產效率低，產物濃度亦低；
[0007] ②某些糖基化表達產物不穩定，不易純化；
[0008] ③重組CH0-K1細胞上游構建與下游分離純化脫節，主要表現在上游構建時著重 考慮它的高效表達，而對高效表達的產物是否能有效地提取出來，即分離純化過程考慮較 少；
[0009] ④重組細胞培養費用昂貴，自動化水平低下。

【發明內容】

[0010] 本發明的一個目的是提供一種具有抗菌活性的HNP-1-Fc重組蛋白結構構成。
[0011] 本發明還有一個目的是提供一種具有高產出率的HNP-1-Fc重組蛋白的制備方 法。
[0012] 本發明構建的哺乳動物細胞表達載體中含有全長HNP-lcDNA和部分人類IgG2_Fc cDNA片段，所表達的為重組的HNP-1-Fc蛋白。
[0013] 為了實現本發明的這些目的和其它優點，提供了一種HNP-1-Fc重組蛋白的制備 方法，所述方法包括以下步驟：
[0014]S1、從人的單克隆抗體細胞中提取攜帶hlgG2_Fc蛋白翻譯信息的mRNA，以所述 mRNA為模板合成cDNA;
[0015]S2、合成攜帶hGHRH蛋白翻譯信息的cDNA片段，并與步驟S1合成的cDNA連接，形 成hGHRH/hIgG2-Fc基因克隆片段；
[0016]S3、合成包含Flag的HNP-1的cDNA片段：Flag/HNP-1，與步驟S2合成的基因克隆 片段連接，形成hGHRH/hIgG2-Fc/Flag/HNP-l基因克隆片段，將其定向克隆至真核細胞重組 載體PMPGCR5B上，構建表達載體；
[0017]S4、將所述表達載體轉化至大腸桿菌中，用含有氨芐青霉素培養基篩選出陽性轉 化菌落，擴增陽性轉化菌落并提取表達載體，并對表達載體進行酶切和測序鑒定，對測序后 的表達載體進行純化；
[0018]S5、以純化后的表達載體轉染哺乳細胞CH0-K1中以得到表達細胞；
[0019]S6、從所述表達細胞的培養基中純化出HNP-1-Fc重組蛋白。
[0020] 優選地，步驟S5中將所述重組載體轉染所述目標細胞之前還包括以下步驟：
[0021 ] 在轉染前7天，將所述目標細胞用添加有體積分數為10 %的胎牛血清的F-12培養 基培養于24孔板中；
[0022] 在轉染前6天至轉染前1天的期間，每天更換培養基的同時丟棄一半數目的所述 目標細胞，并用〇10-3-3?1111培養基與含有10%的胎牛血清的？-12培養基組成的混合培 養基培養，在轉染前1天將所述目標細胞轉移至6孔培養板中，應用CHO-S-SFMII作無血 清培養，其中所述6孔板的每孔裝有2mLCHO-S-SFMII培養基。
[0023] 優選地，在轉染前6天至轉染前1天的期間，所述混合培養基中的含有10%的胎牛 血清的F-12培養基的比重由100 %每天遞減20%，直至0。
[0024] 優選地，所述步驟S6中純化HNP-1-Fc重組蛋白的具體步驟包括：
[0025]S61、將表達細胞的上清液加入親和層析柱，置靜音混勻器翻轉混勻反應2-4小 時，收集穿透液；
[0026]S62、使用沖洗液沖洗所述上清液中未結合組分，以G250蛋白染色液檢測直至將 柱床沖洗干凈；
[0027]S63、向所述層析柱內加入洗脫液洗脫，用G250蛋白染色液鑒定是否有蛋白洗脫 下來，當出現蛋白時，用5mL離心管收集蛋白，直到G250蛋白染色液顯示為無色，說明無HNP-1-Fc重組蛋白流出時為止，其中每根離心管加250yL1MTris?HC1緩沖液中和；
[0028]S64、根據洗脫時G250蛋白染色液的顏色確定HNP-1-Fc重組蛋白所在的離心管， 合并這些離心管內的重組蛋白。
[0029] -種HNP-1-Fc重組蛋白在制備抗肺炎藥物中的應用。
[0030] 本發明的有益效果：
[0031] 1、構建了能在哺乳動物細胞中穩定高表達目的蛋白的基因質粒。
[0032] 2、通過重組表達載體的大腸桿菌轉化，氨芐青霉素培養基篩選擴增陽性菌落，可 以迅速提取純化表達載體，并對表達載體進行酶切和測序鑒定。
[0033] 3、敲除促凋亡因子bax和bak基因改造過的CH0-K1細胞，持續存活時間延長，細 胞培養密度增高，有利于重組蛋白的積累，產量增高。通過抗生素篩選以及培養基條件的改 進，建立起產量高，表達穩定，適合懸浮培養的細胞株儲備庫。初選出來的細胞株的HNP蛋 白產量>l〇mg/L。
[0034] 4、引入hIgG2_Fc片段的HNP-1重組蛋白具有與天然蛋白同等的生物活性，不受引 入的hIgG2-Fc片段影響。初試結果顯示，與純化的天然蛋白對比，HNP-1-Fc重組蛋白對細 菌的殺滅與對人類上皮細胞粘附性的增強作用均無明顯差異。
[0035] 5、HNP-1-Fc重組蛋白具有如下優勢：a、增強蛋白穩定性，延長循環時間；b、增強 與靶細胞（病原菌等）的親和力，提高殺菌效果；c、降低產物的免疫原性；d、便于產物提取 純化，適用于大批量重組蛋白粗產品的一步性提取純化。利用HNP-1-Fc重組蛋白Fc片段， 通過ProteinA親和層析柱一步法使融合有hIgG2-Fc的HNP-1重組蛋白掛柱洗脫，可以一 次大批量地提取純化重組蛋白產物。初試顯示，應用該法重組蛋白回收率達到72%，純度達 到 95%。
【附圖說明】
[0036] 圖1為本發明所述的重組蛋白表達載體的構建流程圖；
[0037] 圖2為本發明所述的HNP-1-Fc重組蛋白的滅菌活性檢測結果圖；
[0038] 圖3為本發明所述的HNP-1/Fc重組蛋白對上皮細胞粘附性影響結果圖；
[0039] 圖4為本發明所述的HNP-1/Fc重組蛋白純化結果檢測圖；
[0040] 圖5為本發明所述的HNP-1/Fc重組雜交蛋白上分離HNP-1檢測圖。
【具體實施方式】
[0041] 下面結合附圖對本發明做進一步的詳細說明，以令本領域技術人員參照說明書文 字能夠據以實施。
[0042] 本發明提供了一種HNP-1-Fc重組蛋白的制備方法，包括以下步驟：
[0043]S1、從人的單克隆抗體細胞中提取攜帶hlgG2_Fc蛋白翻譯信息的mRNA，以所述 mRNA為模板合成cDNA;
[0044]S2、合成攜帶hGHRH蛋白翻譯信息的cDNA片段，并與步驟S1合成的cDNA連接，形 成hGHRH/hIgG2-Fc基因克隆片段，hGHRH蛋白是一種生長激素刺激激素，能夠幫助細胞分泌 重組蛋白，重組蛋白表達完后，能夠自動離開，類似信號肽的作用；
[0045]S3、合成包含Flag的HNP-1的cDNA片段：Flag/HNP-1，與步驟S2合成的基因克 隆片段連接，形成hGHRH/hIgG2-Fc/Flag/HNP-l基因克隆片段，將其定向克隆至真核細胞重 組載體PMPGCR5B上，構建表達載體；；所述真核細胞載體有7832bp，含有較多酶切位點， 可幫助外源基因克隆入載體；該載體含有CMV啟動子，可促進外源基因的表達；載體含有 Hygromycin