專利名稱：靶向引起病毒感染的sars相關冠狀病毒刺突蛋白上的關鍵位點的合成肽以及其使用方法
技術領域：
本申請涉及定位和靶向SARS相關冠狀病毒(“SARS-CoV”)的刺突蛋白(spike protein)(“S蛋白”)上的關鍵部分或位點，所述部分或位點引起導致嚴重的急性呼吸綜合征(Severe Acute Respiratory Syndrome，“SARS”)的病毒感染。本發明還涉及用于預防和治療SARS的新的合成肽。本發明進一步涉及利用實時定量PCR測試抗病毒劑發揮的抗病毒活性。
背景技術：
2003年SARS蔓延到30余個國家。超過8000人受感染，800人失去了生命。隨后鑒定出新的SARS-CoV是SARS的病原體(1-3)，進一步證實該病毒會在獼猴(cynomolgus macaques)中導致類似的疾病(4)。盡管似乎已經成功地控制了SARS，但這種危及生命的疾病的再度出現仍有很大的可能性。近來在新加坡、臺灣地區和中國已經報道了三個實驗室獲得的和四個社區獲得的SARS病例(40)。因此，急需針對該疾病的有效疫苗或抗病毒藥物。
已經從小型哺乳動物例如靈貓和貍中分離出并鑒定出SARS-CoV樣病毒，意味著這些動物可能是SARS的來源(5)。與動物來源的新傳染病的出現有關的重要因素包括廣泛的接觸和快速的病毒進化(6)。系統發生分析已經顯示，盡管人SARS-CoV和動物SARS-CoV樣病毒與先前發現的三種冠狀病毒群體有關，但它們的不同之處足以使之成為獨立的第四種群體，其可能是在野生動物中存在的一個巨大家族。過去15年來在中國廣東對野生/飼養動物的消費需求的增加，已經提供了一種孵育環境，使種間病毒便于從野生/飼養動物向家養動物和人類傳播。由于在新宿主中的新的選擇壓力，在種間轉移的病毒中突變率將增加。
在SARS-CoV感染中，刺突蛋白(“S蛋白”)識別并結合到宿主細胞受體上，然后在S蛋白中誘導出的構象變化將便于病毒包膜與宿主細胞膜的融合。早先的研究已經清楚地確定，在編碼S蛋白的區域中有顯著的序列變異，帶有12個顯著的氨基酸替換改變(5)。這些替換可能是理解在近期的暴發中病毒為什么和如何跨越了從動物到人的物種障礙的關鍵。在近期的SARS監視研究中進一步闡明了這些位點的快速突變。通過比較2003年5月分離的動物SARS-CoV樣病毒(5)和那些在2003年10月之后分離的病毒(數據未公開)，鑒定出了這些位點中的進一步的變異，其與2003年12月在廣州從病人分離出的人SARS-CoV完全相同(7)(表1)。在這些位點中的快速突變暗示，這些突變中的至少一些突變在跨越從動物到人的物種障礙的病毒傳播中起到了重要的作用。猜測干擾這些蛋白結構域或與這些蛋白結構域競爭性結合的藥劑，將能通過破壞S蛋白的功能來抑制SARS-CoV感染。為了證實這一猜測，合成了十種跨這些可變區的肽，研究了它們在細胞培養系統中的抗病毒效果。
表1-在動物和人SARS-CoV之間S蛋白的氨基酸變異

*未公開的數據使用的縮寫人(“Hu”)；喜瑪拉雅靈貓(“Hc”)；中國雪貂-獾(“CFB”)；廣州(“GZ”)；深圳(“SZ”)。P1-P10分別是SEQ ID NO1-10。
已經證實了靶向HIV-1(8，9)、貓免疫缺陷病毒(FIV)的gp40(10)和1型人T細胞白血病病毒(HTLV-1)的卷曲螺旋結構域(11)的抗病毒肽是這些病毒感染的有效抑制物，在治療這些病毒性疾病方面具有潛在的治療價值。這些合成肽的抑制效果通過阻斷病毒蛋白與它們的細胞受體的相互作用，或另外，通過阻止膜融合來介導。基于這些發現，近期的研究已經證實靶向SARS-CoV S蛋白的七重復2區域的肽在微摩爾范圍抑制病毒感染(12)。
在本發明中，合成和鑒別了靶向S蛋白的四個區域的肽，在猴腎(FRhK-4)細胞系中有效地抑制SARS-CoV感染。當在感染前用兩種或三種這樣的肽的組合處理細胞時，觀察到了協同的抗病毒效果。3D模型表明，抗病毒多肽中的三種肽作圖于據推測對三聚體包膜粒的正確裝配極為重要的亞單位界面。這些結果表明了一種不同于先前報道的抗SARS-CoV肽的新型抑制機制，先前報道的抗SARS-CoV肽破壞七重復1一七重復2(“HR1-HR2”)相互作用。
定義在此描述的“包膜粒”是指圍繞著具有管狀核衣殼的動物病毒的衣殼的蛋白層。包膜具有脂質和病毒特定蛋白的內層，病毒特定蛋白也稱膜蛋白或基質蛋白。外層具有一種或多種類型的形態學的亞單位，稱為包膜粒，其從病毒包膜上突起，該層通常由糖蛋白組成。
“患者”應指任何動物，例如哺乳動物或鳥類，包括，但不限于，牛、馬、羊、豬、狗、貓、嚙齒動物例如小鼠或大鼠、火雞、雞和靈長類。在優選的實施方式中，患者是人。
“藥學上可接受的載體”應指本領域技術人員已知的各種運載體或載體。例如，藥學上可接受的載體包括但不限于0.01-0.1M和優選的0.05M磷酸緩沖液或0.8％鹽水。另外，這種藥學上可接受的載體可以是水性的或非水性的溶液、懸浮液或乳液。非水性溶劑的實例是丙二醇、聚乙二醇、植物油例如橄欖油、和可注射的有機酯例如油酸乙酯。水性載體包括水、酒精/水溶液、乳液和懸浮液，包括鹽和緩沖介質。胃腸外運載體包括氯化鈉溶液、Ringer’s葡萄糖、葡萄糖和氯化鈉、乳酸化的Ringer’s溶液和固定油。靜脈內運載體包括體液和營養補充物、電解質補充物例如那些基于Ringer’s葡萄糖的補充物等。也可以存在防腐劑和其他添加劑，例如抗菌劑、抗氧化劑、螯合劑、惰性氣體等。
在此描述的肽由如下氨基酸殘基的“單字母符號”來表示
AAla丙氨酸RArg精氨酸NAsn天冬酰胺DAsp天冬氨酸BAsx天冬酰胺或天冬氨酸CCys半胱氨酸QGln谷氨酰胺EGlu谷氨酸ZGlx谷氨酰按或谷氨酸GGly甘氨酸HHis組氨酸IIle異亮氨酸LLeu亮氨酸KLys賴氨酸MMet甲硫氨酸FPhe苯丙氨酸PPro脯氨酸SSer絲氨酸TThr蘇氨酸WTrp色氨酸YTyr酪氨酸VVal纈氨酸發明內容本發明的目標是開發干擾SARS-CoV的S蛋白上的變異位點或與之競爭性結合的藥劑。本發明的另一個目的是利用這些藥劑鑒定對包膜粒功能很重要的SARS-CoV的S蛋白的區域。本發明的又一個目的是使用這些藥劑通過破壞S蛋白的功能來抑制SARS-CoV感染。此處描述的藥劑是20肽，被設計以跨S基因的十二個鑒定出的變異，所述鑒定是根據人SARS-CoV和動物SARS-CoV樣病毒分離物之間的基因組序列。本發明的肽用下式表示(SEQ IDNO1-10)
SEQ ID NO1X-FKLPLGINITNFRAILTAFS-Z；SEQ ID NO2X-PTTFMLKYDENGTITDAVDC-Z；SEQ ID NO3X-VLYNSTFFSTFKCYGVSATK-Z；SEQ ID NO4X-PALNCYWPLNDYGFYTTSGI-Z；SEQ ID NO5X-RDVSDFTDSVRDPKTSEILD-Z；SEQ ID NO6X-YQDVNCTDVSTAIHADQLTP-Z；SEQ ID NO7X-SNNTIAIPTNFSISITTEVM-Z；SEQ ID NO8X-QYGSFCTQLNRALSGIAAEQ-Z；SEQ ID NO9X-GIGVTQNVLYENQKQIANQF-Z；和SEQ ID NO10 X-IQKEIDRLNEVAKNLNESLI-Z。
其中氨基酸殘基用單字母符號表示，其中X是氨基、乙酰基、9-芴基甲氧基-羰基、或疏水基團，Z是羧基、酰氨基、或疏水基團。
本發明提供定位細胞中導致病毒感染的SARS-CoV S蛋白的位點的方法，包括在SARS-CoV感染之前用具有式X-PTTFMLKYDENGTITDAVDC-Z(SEQID NO2)；X-YQDVNCTDVSTAIHADQLTP-Z(SEQ ID NO6)；X-QYGSFCTQLNRALSGIAAEQ-Z(SEQ ID NO8)；X-IQKEIDRLNEVAKNLNESLI-Z(SEQ ID NO10)的肽或其組合接觸細胞。
本發明進一步提供預防或抑制患者中的SARS-CoV感染的方法，包括向患者施用有效量的藥物組合物，所述藥物組合物包含SEQ ID NO2、SEQ IDNO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10，或其組合，和藥學上可接受的載體。
本發明還提供通過實時定量PCR用特異性正向引物、反向引物和熒光標記的探針來測試抗病毒劑發揮的抗病毒活性的方法。
附圖的簡要說明該專利或申請文件包含至少一幅彩色繪制的附圖。具有彩色附圖的本專利或專利申請出版物的副本在請求和支付了必需費用之后將由官方提供。
根據附隨的“發明的詳細說明”和此節中描述的附圖，將更好地理解本發明的前述和額外的特征和優點。


圖1 SARS-CoV基因組和合成肽的位置的圖表SARS-CoV的S蛋白包括1255個氨基酸殘基。根據假設，即在人SARS-CoV和動物SARS-CoV樣病毒之間的殘基變異可能決定了病毒在人和動物之間的感染優先，設計10條肽(P1-P10(分別為SEQ ID NO16-25))來阻斷病毒侵入。在每條肽中的氨基酸變異用斜體來突出顯示，從哺乳動物SARS-CoV樣病毒鑒定的替代的氨基酸在表1中顯示。箭頭表示每個肽在S蛋白中的位置。具有強的抗SARS-CoV活性的肽在SEQ ID NO17(“P2”)、SEQ ID NO21(“P6”)、SEQ ID NO23(“P8”)和SEQ ID NO25(“P10”)中顯示。使用的縮寫血管收縮素-轉化酶2結合區(“ACE2”)；七重復(“HR1”和“HR2”)；可讀框(“ORF”)、和跨膜結構域(“T”)。還列出了ELM和卷曲螺旋預測分析的結果。
圖2A-2F 通過SARS-CoV感染的細胞病變效果確定的肽介導的抗病毒效果病毒感染前在存在(圖2A、2C、2D和2F)或不存在(圖2B和2E)肽的情況下溫育FRhK4細胞一小時。感染后36小時，利用相差顯微鏡拍照顯示細胞形態(圖2A-2D，400X)，或用電子顯微鏡拍照顯示病毒形態(圖2E和2F)。細胞與肽一同溫育，沒有顯示細胞毒效果(圖2A)，而未處理的細胞在用SARS-CoV感染后顯示了典型的CPE(圖2B)。當用SEQ ID NO8以50μg/ml處理細胞沒有可見的CPE出現(圖2C)，或通過SEQ ID NO8以25μg/ml處理后CPE顯著地降低了(圖2D)。電子顯微鏡顯示了感染的細胞中典型的SARS-CoV形態(通過箭頭指出)(圖2E)，相比之下在用SEQ ID NO8以100μg/ml保護的細胞中沒有可見的病毒(圖2F)。
圖3A和3B 由單個有效肽介導的確定的抗病毒效果有效肽SEQ ID NO2、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8和SEQ ID NO10的抗病毒活性通過測量培養基中的病毒滴度(圖3A)和細胞中的病毒RNA拷貝數(圖3B)來確定。用不同濃度的肽(即，分別為100μg/ml、50μg/ml和25μg/ml)預先溫育FRhK4細胞。感染后36小時，在培養基中產生的相關病毒通過TCID50滴定，在用肽預處理過的組和未預處理過的組之間比較(圖3A)；細胞中的相關病毒基因組拷貝數通過實時定量RT-PCR來確定，進行三份，圖示出標準差(圖3B)。對照的相關病毒滴度或RNA拷貝數被定為100％。該實驗重復了至少兩次。
圖4 活性肽抑制病毒侵入細胞表示出了在感染后的不同時點通過Q-RT-PCR確定的病毒RNA拷貝數。未用肽處理的細胞，作為病毒對照(“VC”)，與其他細胞一樣，用相同劑量的病毒感染。未感染的細胞(標為“UIC”)用SEQ ID NO8處理，作為陰性對照。
圖5A和5B 組合兩種活性肽而介導的協同抗病毒效果在病毒感染之前，將FRhK-4細胞與不同濃度的兩種肽的混合物一同溫育一小時。在每個實驗中，混合等量(重量)的兩種肽，使用的總肽終濃度分別是100μg/ml、50μg/ml和25μg/ml。非活性肽SEQ ID NO9和活性肽SEQ IDNO8的組合用作對照。如圖3A和3B中描述的通過滴定培養基中產生的病毒(圖5A)和測量細胞內病毒RNA拷貝數(圖5B)來確定抗病毒效果。
圖6A和6B 組合三種有效肽而介導的協同抗病毒效果在SARS-CoV感染之前，將FRhK-4細胞與不同濃度的三種肽的混合物一同溫育一小時。在每個實驗中，使用等量(重量)的三種肽，使用的總肽終濃度在圖6A和6B中表示。如圖3A和3B中描述的通過滴定培養基中釋放的病毒(圖6A)和測量細胞內病毒RNA拷貝數(圖6B)來確定協同抗病毒效果。
圖7A和7B 比較人病毒衍生的肽和動物病毒衍生的肽之間的抗人病毒效果在SARS-CoV感染之前，將FRhK-4細胞與100μg和50μg人或動物衍生的肽一同溫育一小時。如圖3A和3B中描述的通過滴定培養基中釋放的病毒(圖7A)和測量細胞內的病毒RNA拷貝數(圖7B)來評估抗病毒效果。使用的縮寫病毒對照(“VC”)。
圖8A-8F 肽位置的模擬圖8A顯示了S1和S2亞單位的帶狀表示在1-1020模擬的區域中用不同的顏色顯示了八個肽，SEQ ID NO10(“P10”)處于球狀結構域中，其相應于1021-1195區域，被獨立地模擬。圖8B-8E顯示了四個S糖蛋白片段的放大的視圖，分別相應于活性肽SEQ ID NO2(“P2”)、SEQ ID NO6(“P6”)、SEQ ID NO8(“P8”)和SEQ ID NO10(“P10”)，也以同樣的顏色顯示。由于在模擬的區域之外，SEQ ID NO7無法被顯示。圖8F顯示了單體之一的主鏈，對S1和S2分別用橙色和綠色突出顯示。SEQ ID NO6(“P6”)、SEQ IDNO8(“P8”)和SEQ ID NO9(“P9”)的位置用粗線突出顯示。
圖9A-9C 提議的肽抑制模型圖9A顯示了SARS-CoV進入宿主細胞所需的未鑒定出的共受體。合成肽可能通過與共受體結合來阻斷病毒侵入。圖9B顯示了在結合到受體(ACE2)之后，每個S蛋白單體的蛋白水解位點被暴露。然后未鑒定的蛋白酶將S蛋白處理成S1和S2結構域，其觸發了構象改變和膜融合。抑制肽可以與S蛋白單體結合并阻斷蛋白酶的作用。圖9C顯示了在融合步驟之前病毒包膜粒插入宿主細胞膜所需的構象改變。合成肽可以與包膜粒結合并改變它的病毒入侵所必需的構象。
發明的詳細描述此處描述的是展現出強烈的抗病毒活性的肽。這些肽包括SEQ ID NO2、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8和SEQ ID NO10，靶向引起病毒感染的SARS-CoV的S蛋白上的特定位點。此處還描述了用于測試這種肽的抗病毒活性的分析法。最后，本發明涉及將這些肽和靶向描述的關鍵位點的其他合成肽作為治療SARS中的SARS-CoV感染抑制物的用途。
本發明提供了對SARS-CoV S蛋白的重要功能區域的認識，并提供了基于預防和抑制SARS-CoV感染的治療方法。已經報道了血管收縮素-轉化酶2(“ACE2”)是SARS-CoV的受體，并且已經闡明了與ACE2結合的S蛋白的區域(23、24、27、33)。也已經證實HR1和HR2的相互作用對于病毒包膜與宿主細胞膜的融合很重要(12)。然而，S蛋白中與病毒感染有關的其他功能區域還沒有被闡釋。
在另一個實施方式中，利用基于一種猜測設計的十個肽，即SEQ ID NO1-10探察了S蛋白的關鍵區域，所述猜測是S蛋白上的快速突變位點在跨越從動物到人的物種障礙中起到了重要的作用。
根據人SARS-CoV和動物SARS-CoV樣病毒分離物之間的基因組序列(5)設計出跨S基因的12個鑒定的變異的十種肽。結合ELM和卷曲螺旋預測分析來設計肽(圖1)。已經證實S1結構域(殘基12-672)引起受體結合(23、24)，S2結構域(殘基673-1255)參與病毒-宿主細胞融合(25、26)。人和動物病毒的序列對比顯示在S1結構域發生了七個變異，在S2結構域發生了五個變異(表1和圖1)。在設計抗病毒肽時用六個靶向S1區域的肽，即，SEQ ID NO1-6和四個靶向S2區域的肽，即，SEQ ID NO7-10覆蓋了所有這些變異。位于鑒定出的病毒受體(血管收縮素-轉化酶2，ACE2)結合區(23、27)的變異F360S和N479K(人到動物)被肽SEQ ID NO3和SEQ ID NO4覆蓋。肽8和SEQ ID NO10覆蓋了變異T894A和K1163E，分別位于病毒S蛋白的七重復1(“HR1”，殘基892-1013)和2(“HR2”，殘基1153-1198)區域(12)。其他6個肽衍生自未確定的區域(圖1)。
本發明的肽由Invitrogen(Carlsbad，CA，USA)合成。序列如下(SEQ IDNO1-10)SEQ ID NO.1X-FKLPLGINITNFRAILTAFS-ZSEQ ID NO.2X-PTTFMLKYDENGTITDAVDC-ZSEQ ID NO.3X-VLYNSTFFSTFKCYGVSATK-ZSEQ ID NO.4X-PALNCYWPLNDYGFYTTSGI-ZSEQ ID NO.5X-RDVSDFTDSVRDPKTSEILD-ZSEQ ID NO.6X-YQDVNCTDVSTAIHADQLTP-ZSEQ ID NO.7X-SNNTIAIPTNFSISITTEVM-ZSEQ ID NO.8X-QYGSFCTQLNRALSGIAAEQ-ZSEQ ID NO.9X-GIGVTQNVLYENQKQIANQF-ZSEQ ID NO.10 X-IQKEIDRLNEVAKNLNESLI-Z本發明提供了定位細胞中導致病毒感染的SARS-CoV S蛋白的位點的方法，包括在SARS-CoV感染之前，用具有式X-PTTFMLKYDENGTITDAVDC-Z(SEQ ID NO2)；X-YQDVNCTDVSTAIHADQLTP-Z(SEQ ID NO6)；X-QYGSFCTQLNRALSGIAAEQ-Z(SEQ ID NO8)；X-IQKEIDRLNEVAKNLNESLI-Z(SEQ ID NO10)的肽或其組合接觸細胞。肽可以是兩種肽的組合(例如，SEQ ID NO6+SEQ ID NO8)。肽可以位于SARS-CoV S蛋白氨基酸殘基259-278、氨基酸殘基598-617、氨基酸殘基737-756，或氨基酸殘基1161-1180。肽結合位于或鄰近于SARS-CoV S糖蛋白的ACE2結合區域或S1和S2結構域。在該方法中，肽有助于阻止、抑制或減少SARS-CoV感染。
在以上的方法中，細胞可以來自靈長類、猴細胞系(例如，FRhK-4和VeroE6)、人類、或人類細胞系(例如，Caco2、Huh7、CNE1和CNE2)。
在一個實施方式中，肽是SEQ ID NO2，并且干擾ACE2結合位點的構象變化。
在另一個實施方式中，肽是SEQ ID NO2、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8或SEQ ID NO10，肽通過模擬ACE2結合誘導的構象變化之后暴露出的區域，與S蛋白單體競爭性結合，來干擾包膜粒功能。影響的位點優選是S蛋白氨基酸殘基259-278、589-617、737-756或1161-1180。
本發明還提供在患者中預防或抑制SARS-CoV感染的方法，包括向患者施用有效量的藥物組合物，所述藥物組合物包含SEQ ID NO2、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10，或其組合，和藥學上可接受的載體。該藥物組合物可包含單個肽(例如，SEQ ID NO8)、雙肽(例如，SEQ ID NO6+SEQ ID NO8)，或其組合。在優選的實施方式中，患者是人。
以下送遞系統，其應用了一些常規使用的藥學上可接受的載體，僅僅是預想用于施用上述藥物組合物的許多實施方式的代表。
可注射的藥物送遞系統包括溶液、懸浮液、凝膠、微球體和聚合的可注射物質，并且可以包含賦形劑例如溶解度改變劑(例如，乙醇、丙二醇和蔗糖)和聚合物(例如，polycaprylactones和PLGA)。可植入系統包括棒和圓片，可包含賦形劑例如PLGA和polycaprylactone。
口服送遞系統包括片劑和膠囊劑。這些可包含賦形劑例如粘合劑(例如，羥丙基甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、其他纖維素物質和淀粉)、稀釋劑(例如，乳糖和其他糖、淀粉、磷酸二鈣和纖維素物質)，崩解劑(例如，淀粉聚合物和纖維素物質)和潤滑劑(例如，硬脂酸鹽和滑石)。
經粘膜送遞系統包括貼劑、片劑、栓劑、陰道藥栓、凝膠和藥膏，可包含賦形劑例如增溶劑和增強劑(例如，丙二醇、膽鹽和氨基酸)，和其他運載體(例如，丙二醇、脂肪酸酯、和衍生物、和親水聚合物例如羥丙基甲基纖維素和透明質酸)。
皮膚送遞系統包括，例如，水性和非水性凝膠、膏、多乳劑、微乳劑、脂質體、油膏、水性和非水性溶液、洗劑、氣霧劑、碳氫化合物基質和粉末，可包含賦形劑例如增溶劑、增透劑(例如，脂肪酸、脂肪酸酯、脂肪醇和氨基酸)，和親水聚合物(例如，polycarbophil和聚乙烯吡咯烷酮)。在一個實施方式中，藥學上可接受的載體是脂質體或透皮增強劑。
用于可重構送遞系統的溶液、懸浮液和粉末包括運載體例如懸浮劑(例如，樹膠、zanthans、纖維素和糖)、濕潤劑(例如，山梨醇)、增溶劑(例如，乙醇、水、PEG和丙二醇)、表面活性劑(例如，十二烷基硫酸鈉、Spans、Tweens和十六烷基吡啶)、防腐劑和抗氧化劑(例如，對羥基苯甲酸酯類、維生素E和C、和抗壞血酸)、防結塊劑、包埋劑和螯合劑(例如，EDTA)。
本發明進一步提供通過實時定量PCR用特異性正向引物、反向引物和熒光標記的探針來測試抗病毒劑發揮的抗病毒活性的方法。正向引物可以是SARS-CoV S 蛋白基因的DNA序列的片段，例如5’-GCTTAGGCCCTTTGAGAGAGACA-3’(SEQ ID NO11)。反向引物可以是SARS-CoV S 蛋白基因的DNA序列的片段，例如5’-GCCAATGCCAGTAGTGGTGTAAA-3’(SEQ ID NO12)。熒光標記的探針，例如5’-CCTGATGGCAAACCTTGCAC-3’(SEQ ID NO13)，也可用任何熒光物質來標記作為在任何實時PCR檢測系統中的報道分子，例如5’-(TET)CTAATGTGCCTTTCTCCCCTGATGGCA(TAMRA)-3’(SEQ ID NO14)。除了特異性正向引物、反向引物和熒光標記的探針之外，磷酸鹽探針，例如5’-(LC640)CACCTGCTCTTAATTGTTATTGGCC-3’(SEQ ID NO15)也可用于利用實時定量PCR測試抗病毒劑發揮的抗病毒活性。
從以下的“實驗部分”可以更好地理解本發明。然而，本領域的技術人員將很容易地意識到，討論的特定方法和結果僅僅是對本發明的說明，在隨后的權利要求中將更完整地描述。
具體實施例方式
實驗部分細胞培養物和病毒株按以下的描述在胎兒獼猴腎(FRhK-4)細胞培養物中測試上述肽。
在含有10％胎兒牛血清的MEM培養基(10％-MEM，Invitrogen，USA)中在37℃、5％CO2下培養和維持胎兒獼猴腎(FRhK-4)細胞。SARS-CoV毒株GZ50分離自2003年2月中國廣州SARS病人的鼻咽部洗出液，在FRhK-4細胞中維持(13，14)。在FRhK-4細胞中GZ50毒株的連續傳代持續性地產生細胞病變效果(CPEs)，滴度為107TCID50/ml。基因組測序(登記號AY304495)和系統發生分析顯示GZ50處于報道的香港毒株以及加拿大和美國毒株之間(15)。
肽接種和病毒感染在96孔板上的10％-MEM中以約5,000FRhK-4細胞每孔接種，培養過夜。用PBS洗滌細胞2次后，向培養物中添加用MEM(0％FBS)稀釋到不同濃度的肽，在37℃溫育1小時。然后用SARS-CoV GZ50毒株以0.05的感染復數(MOI)感染培養物。感染后約36小時出現CPE，在約72小時達到頂峰。所有實驗進行三份并重復至少三次。
定量RT-PCR通過實時PCR評估存在十種20肽的情況下SARS-CoV對FRhK-4細胞的感染力。用PBS洗滌細胞兩次，根據廠家的說明利用RNase Mini試劑盒(Qiagen，Hilden，Germany)提取總RNA。利用無規六聚物用ThermoScript RT系統(Invitrogen，CA)進行逆轉錄。利用正向引物5’-GCTTAGGCCCTTTGAGAGAGACA-3’(SEQ ID NO11)和反向引物5’-GCCAATGCCAGTAGTGGTGTAAA-3’(SEQ ID NO12)(終濃度200nM)、熒光標記的探針5’-CCTGATGGCAAACCTTGCAC-3’(SEQ ID NO13)和磷酸鹽探針5’-(LC640)CACCTGCTCTTAATTGTTATTGGCC-3’(SEQ ID NO15)(終濃度800nM)利用定量RT-PCR(Q-RT-PCR)(13，16，17)對細胞內病毒RNA進行定量。利用LC Faststart DNA Master Hyb Probes和LightCycler(Roche Diagnostics，Branchburg，NJ，USA)進行實時定量。應用的PCR條件是95℃10分鐘，然后95℃10秒、60℃5秒、72℃5秒和40℃30秒進行50個循環。使用從1.5pg/ml到1.5×106pg/ml質粒的10倍連續稀釋作為標準，管家基因β-肌動蛋白用作內源對照來標準化總RNA數量的樣品間變異。
病毒滴度的確定和具有抗病毒性質的肽的鑒別另外，通過利用基于CPE的TCID50測試對釋放到培養基中的病毒顆粒進行量化(17，18)來評估存在十種20肽的情況下SARS-CoV對FRhK-4細胞的感染力。病毒感染后36小時從SARS-CoV感染的細胞中收集培養物上清液，用1％-MEM以10倍系列稀釋，接種到96孔板中的FRhK-4細胞，96孔板在用SARS-CoV以0.05MOI感染前與25、50和100μg/ml的每種肽溫育1小時。感染后36小時確定CPE，來評估肽介導的對病毒感染的保護作用。
培養3天后在相差顯微鏡下評估結果，計算病毒滴度。在測試濃度下10種肽處理的細胞都沒有表現出細胞毒性效果，如圖2A中SEQ ID NO8所表示。在未處理的細胞中，36小時后觀察到的CPEs是典型的，表現為細胞變圓和脫附(圖2B)。對于肽SEQ ID NO2、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8或SEQ ID NO10觀察到了顯著的抗病毒效果。最有效的肽SEQ ID NO8在100和50μg/ml有效保護細胞免于CPEs(圖2C)，在25μg/ml顯著地減少CPEs(圖2D)。類似地，SEQ ID NO10在100和50μg/ml，以及SEQ ID NO2和SEQ ID NO6在100μg/ml觀察到了顯著的保護作用，而其他六種肽沒有可檢測性地降低CPEs水平，即使是在100μg/ml的濃度下(表2)。
表2-由CPE確定的肽的抗病毒活性

*P1-P10分別是SEQ ID NO1-10。
此外，通過電子顯微鏡觀察進一步說明使FRhK-4細胞免于SARS-CoV感染的肽介導的保護作用，收獲有或沒有SARS-CoV感染的FRhK-4細胞，并在2.5％戊二醛(Electron Microscopy Sciences，Fort Washington，PA，USA)中固定4小時，在1％四氧化鋨中后期固定1小時。然后將細胞轉移到1.5ml試管中，1,000rpm離心10分鐘。除去上清液，向細胞沉淀中添加液化的瓊脂糖溶液(2％，55-60℃；Sigma，St.Louis，MO，USA)。在凝膠固化后，切下包含細胞沉淀的約1mm3立方體，在梯度的乙醇中脫水。然后將立方體包埋入環氧樹脂(Polysciences，Warrington，PA，USA)中。制備70nm厚度的超薄切片，用乙酸鈾酯(ElectronMicroscopy Sciences，Fort Washington，PA，USA)和檸檬酸鉛(Leica Microsystem 5，Vienna，Austria)染色。在80kV在Philips EM208S電子顯微鏡下檢查切片，用100nm的刻度條標記圖象。結果顯示了在未用肽處理的細胞中SARS-CoV感染的典型形態學(圖2E)，而在SEQ ID NO8處理的細胞中沒有病毒可見(圖2F)。
由于分別覆蓋了F360S和N479K(人到動物)變異的SEQ ID NO3和SEQID NO4如所描述的位于鑒定的病毒受體(ACE2)結合區域(23，27)；并且結果顯示在本發明中肽SEQ ID NO3和SEQ ID NO4是沒有活性的，表明要么這兩個特定位點沒有活躍參與刺突-ACE2結合，要么肽不能與S蛋白競爭結合ACE2。活性SEQ ID NO10(殘基1161-1180)來自S蛋白的HR2區域(殘基1153-1198)。與HIV-1 gp41類似，SARS-CoV S蛋白的S2區域包含HR1和HR2序列，據信其形成了對于病毒-宿主膜融合很重要的卷曲螺旋結構(12，34)。SEQ ID NO10介導的抗病毒活性可能由于肽阻斷了HR1和HR2的相互作用，從而阻斷了膜融合。這與Liu等(12)和Tripet等(34)的報道一致。然而，來自HR1區域(殘基892-1013)的SEQ ID NO9(殘基890-909)沒有顯示出抗病毒活性。其他活性肽SEQ ID NO2(殘基259-278)、SEQ ID NO6(殘基598-617)和SEQ ID NO8(殘基737-756)既不位于S1-ACE2結合位點(318-510)(24)也不位于HR1和HR2區域中。
活性肽降低病毒滴度以及細胞內病毒RNA水平利用TCID50分析細胞培養基中釋放的病毒滴度，和通過Q-RT-PCR來定量感染后36小時收獲的樣品中細胞質病毒RNA水平，來進一步研究四種活性肽的抗病毒效果。如圖3A所示，活性肽以依賴于劑量的方式降低了傳染性毒粒的數目。通過用肽SEQ ID NO2或SEQ ID NO6以100μg/ml處理，釋放的病毒滴度都降低了超過5倍(相對于未處理的對照的18％)，以50μg/ml處理降低了約一半，然而，在25μg/ml沒有檢測到抗病毒效果。肽SEQ ID10在100μg/ml降低病毒滴度超過15倍(相對于對照的6％)，在50μg/ml降低10倍，在25μg/ml降低一半。肽SEQ ID NO8展現了最強的抗病毒活性，在100、50和25μg/ml分別降低病毒滴度50倍(相對于對照的2％)、15倍和10倍。計算了這些肽的90％抑制濃度(IC90)，在表3中顯示。肽SEQ ID NO8的抗病毒效果是最高的，由最低的IC90值表明，其比SEQ ID NO2或SEQ IDNO6的IC90值低4.5倍以上，比SEQ ID NO10的IC90值低3倍。圖3B顯示了在用肽SEQ D NO2、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8和SEQ ID NO10處理后細胞內病毒RNA水平也降低了。與病毒滴度分析的結果一致，SEQ IDNO8顯示了最高的抗病毒效能。
表3-由IC90評估的肽的抗病毒效果

*P1-P10分別是SEQ ID NO1-10。
IC90值被定義為相對于未處理的對照使病毒滴度降低90％的肽濃度(±標準差(“SD”))。IC90值通過擬合對數方程于對每個肽濃度確定的數據(進行三份)來計算。在肽組合中，每個肽是等量的(重量)。
活性肽抑制SARS-CoV侵入細胞為了檢測肽是否阻斷SARS-CoV侵入細胞，在病毒接種之前一小時開始肽溫育。在培養基中和細胞中的病毒RNA拷貝數在感染后的不同時點通過Q-RT-PCR確定。如圖4所示，與未經肽處理的培養物(標為病毒對照(“VC”))相比，在感染后1小時(1h-S)在肽處理的培養物的培養基中病毒RNA拷貝數較高，但在那些在感染后不同時點收獲的細胞中較低。在處理的培養物中病毒生長曲線類似于病毒對照中的曲線，但它們處于較低的水平。此外，當在病毒接種1小時后將活性肽施加到培養物中，并與感染后6和12小時未處理的病毒培養物的病毒RNA拷貝數(數據未顯示)對比，這些活性肽沒有顯示抗病毒效果。該結果說明活性肽能阻斷病毒侵入細胞，但不能抑制病毒復制。
肽組合介導的協同抗病毒效果還研究了展現出協同抗病毒效果的靶向不同結構域的肽的組合。在感染前一小時用兩種活性肽的混合物預處理FRhK-4細胞，每種肽是等量的，總肽濃度分別為100、50和25μg/ml。感染后36小時收集樣品確定病毒滴度(圖5A)和病毒RNA定量(圖5B)。滴定實驗顯示肽SEQ ID NO2與SEQ ID NO6組合，在100μg/ml降低了病毒滴度1,000倍(相對于對照的0.1％)，在50μg/ml降低了10倍。盡管在25μg/ml的濃度下，每個肽單獨地都沒有觀察到抗病毒活性(圖3A)，但雙肽處理還是降低了病毒滴度3倍(相對于對照的32％)。SEQID NO6與SEQ ID NO8組合在100μg/ml降低了病毒滴度10,000倍。SEQID NO6+SEQ ID NO8的IC90，與單獨的SEQ ID NO6相比降低了約12倍(IC909.6μg/ml對IC90113.0μg/ml)，與單獨的SEQ ID NO8相比降低了2.5倍(IC909.6μg/ml對IC9024.9μg/ml)(表3)。對于其他活性肽組合也觀察到了顯著的協同效果，但在活性肽加非活性肽的組合(例如，SEQ ID NO8+SEQ ID NO9)中沒能觀察到，在計算的IC90值(表3)和相對病毒滴度(圖5A)中都顯示了這一點。這些結果進一步被Q-RT-PCR分析證實(圖5B)。
通過在病毒接種前一小時用包含等量的三種肽的混合物溫育細胞，研究了協同抗病毒效果。有趣的是，所有的肽組合都展現了大大增強的抗病毒能力(表3)，在釋放的病毒的水平(圖6A)和細胞內病毒RNA量(圖6B)中都有反映。在用三種肽混合物以50和25μg/ml的總濃度預處理之后，基本上完全抑制了SARS-CoV感染。SEQ ID NO2和SEQ ID NO6作圖于參與結合宿主受體ACE2的S1結構域(24，39)，同時SEQ ID NO8和SEQ ID NO10作圖于在病毒粒子-膜融合中起作用的S2區域(25，26)，這些結果清楚地說明，靶向病毒S蛋白中不同區域的肽的組合顯著地增強了抗病毒效果。
來自動物病毒序列的肽的抗病毒效果為了確定來自動物SARS-CoV樣病毒的序列的肽是否也能抑制人SARS-CoV感染，合成了來自動物病毒的肽，用于在用人SARS-CoV攻擊細胞前處理FRhK-4細胞。測量上清液中的病毒滴度(圖7A)和細胞中的病毒RNA(圖7B)，并且與用來自人病毒的肽處理的對照相比。在用動物肽處理的樣品中觀察到了比對照高的病毒滴度和RNA水平，表明動物肽與人肽相比對抗人SARS-CoV的能力較低。在SEQ ID NO6上觀察到了最顯著的抗病毒能力的降低，動物SEQ ID NO6的抗病毒效力比人SEQ ID NO6的效力低2到4倍(圖7)。
包膜粒模型構建和活性肽的推定的3D位置為了探索上述的活性肽如何抑制病毒感染，在圖8A-8F中示出在其包膜粒四級裝配物中的S糖蛋白的分子模擬，其在蛋白質數據庫(“PDB”)ID編號為1T7G，該分子模型用于發現與活性肽的活性相關的潛在機制。
從PDB中檢索出SARS-CoV S蛋白的S1和S2結構域的結構(19)，ID編號分別是1Q4Z和1Q4Y。手工進行兩個結構域的對接，并通過利用Gromacs的動力學模擬(20)進行積極的優化。利用Prosa II軟件包(21)評估每個可能的包膜粒裝配的可靠性。利用程序MOLMOL(22)進行包膜粒圖象構建和暴露的表面積(“ESA”)的計算。S糖蛋白的預測的包膜粒裝配保藏在PDB中，ID標號1T7G(39)。
在模型中，發現SEQ ID NO2(“P2”)位于S蛋白的表面，與ACE2結合區相鄰(圖8A)。這表明SEQ ID NO2不直接競爭ACE2結合，但其可能妨礙結合位點構象變化。其他三個活性肽(SEQ ID NO6(“P6”)、SEQ ID NO8(“P8”)、和SEQ ID NO10(“P10”)位于S糖蛋白的S1和S2結構域的表面，表現出環形構象(圖8A)。由于這些肽占據了S糖蛋白的單體-單體界面區域，這些肽可能通過模擬在ACE2結合誘導的構象變化之后暴露的區域，通過競爭性結合S蛋白單體，來干擾包膜粒功能。這些區域可能充當共受體結合位點、蛋白酶剪切位點，和/或毒粒-細胞膜結合位點。因此這些肽可以與包膜粒競爭病毒-細胞膜相互作用(圖9A-9C)。
SEQ ID NO8(殘基737-756)，靶向S2結構域的未知功能區域(殘基673-892)，展現出對病毒感染的最高抑制活性。有趣的是，它非常接近Ho等預測的推斷的受體結合位點(殘基757-761)(35)。通過考慮HIV-1和SARS-CoV之間感染進程的相似性(感染進程包括病毒蛋白-受體結合)、病毒蛋白構象變化和病毒-細胞膜融合，殘基737-756可能是未被確定的共受體(類似于HIV-1的CCR5和CXCR4)結合位點。SEQ ID NO8可能與包膜粒競爭共受體相互作用(圖9A)。這也得到了結果的支持，該結果表明當與其他活性多肽組合時SEQ ID NO8也表現出發揮了最高的協同抗病毒效果(表3)。
對其他冠狀病毒的研究已經闡明，S1與可溶性病毒受體的結合、或暴露于37℃和升高的pH值(pH 8.0)，可以誘導伴隨著S1和S2的剪切的構象變化，這可能涉及觸發病毒-細胞膜融合(36-38)。活性肽SEQ ID NO6(殘基598-617)位于S1結構域的表面，接近S1-S2連接位點(圖8A和8F)。其抗病毒活性可能是由于SEQ ID NO6與S蛋白單體的結合干擾了對S1和S2的剪切，導致隨后在病毒包膜和宿主細胞膜之間的融合的失敗(圖9B)。
兩種和三種肽的組合的協同效果表明，可通過同時阻斷多個蛋白-蛋白或蛋白-膜相互作用位點來實現對包膜粒功能的更多的破壞。這些肽可通過競爭性地結合到S蛋白單體上而破壞包膜粒裝配或構象失常(圖9C)。
發現了與活性肽(SEQ ID NO6，8和10)相關聯的兩個共同特征。首先，它們位于S1和S2結構域的表面，單體在這里相互接觸。其次，這些活性肽展現出環形構象。與此相反，非活性肽位于暴露的包膜粒表面(SEQ ID NO1、SEQ ID NO3和SEQ ID NO4，未示出)，展現出螺旋結構(SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7和SEQ IDNO9)。活性肽僅僅是那些展現出環形構象的肽，表明環形構象是肽易于接近S蛋白單體或共受體所必需的。與這個模型一致的是，非活性肽屬于包膜粒的暴露的表面區(SEQ ID NO1、SEQ ID NO3和SEQ ID NO4)，和/或展現了螺旋構象(SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7和SEQ ID NO9)。
再現了包膜粒的環形構象的僅有的肽SEQ ID NO6、8和10，是能通過競爭性結合S蛋白單體更容易地干擾包膜粒裝配的肽。更為有序的二級結構元件，例如由SEQ ID NO1、3、4、5、7和9形成的所提及的螺旋，沒有抗病毒活性。再現包膜粒的暴露的表面區域的肽(SEQ ID NO1、3和4)完全沒有活性，因為它們的存在沒能誘導對包膜粒四級結構穩定性的干擾。因而，活性肽在構象變化的關鍵區域上與包膜粒結合，構象變化是膜融合過程所必需的。
參考文獻1.Peiris，J.S.，et al.，Lancet 361，1319-1325(2003).
2.Rota，P.A.，et al.，Science 300，1394-1399(2003).
3.Marra，M.A.，et al.，Science 300，1399-1404(2003).
4.Fouchier，R.A.，et al.，Nature 423，240(2003).
5.Guan，Y.，et al.，Science 302，276-278(2003).
6.Holland，J.J.，et al.，J.Viol.65，2960-2967(1991).
7.“The Chinese SARS Molecular Epidemiology Consortium，”Science 303，1666-1669(2004).
8.Derdeyn，C.A.，et al.，J.Virol.75，8605-8614(2001).
9.Sia，S.K.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.99，14664-14669(2002).
10.Medinas，R.J.，et al.，J Virol 76，9079-9086(2002).
11.Pinon，J.D.，et al.，J.Virol.77，3281-3290(2003).
12.Liu，S.，et al.，Lancet.363，938-947(2004).
13.He，M.L.，et al.，JAMA 290，2665-2666(2003).
14.Zhong，N.S.，et al.，Lancet 362，1353-1358(2003).
15.Guan，Y.，et al.，Lancet.363，99-104(2004).
16.He，M.L.，et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.297，185-192(2002).
17.He，M.L.，et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.295，1102-1107(2002).
18.Zheng，B.，et al.，Emerg.Infect.Dis.10，176-178(2004).
19.Berman，H.M.，et al.，Nucleic Acids Research28，235-242(2000).
20.Berendsen，H.J.C.，et al.，Comp.Phys.Comm.91，43-56(1995).
21.Sippl，M.J.17，355-362(1993).
22.Koradi，R.，et al.，J.Mol.Graph.14，51-55(1996).
23.Li，W.，et al.，Nature 426，450-454(2003).
24.Wong，S.K.，et al.，J.Biol.Chem.279，3197-3201(2004).
25.Matsuyama，S.and Taguchi，F.，Virology 295，160-171(2002).
26.Taguchi，F.and Shimazaki，Y.K.，J.Gel.Virol.81，2867-2871(2000).
27.Sui，J.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101，2536-2541(2004).
28.Spiga，O.，et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.310，78-83(2003).
29.Delmas，B.and Laude，H.，J.Virol.64，5367-5375(1990).
30.Lewicki，D.N.and Gallagher，T.M.，J.Biol.Chem.277，19727-19734(2002).
31.Sauter，N.K.，et al.，Biochemistry 31，9609-9621(1992).
32.Lin，Y.，et al.，Antiviral Therapy 9，287-289(2004).
33.Babcock，G.J.，et al.，J.Virol.78，4552-4560(2004).
34.Tripet，B.，et al.，J.Biol.Chem.279，20836-20849(2004).
35.Ho，T.Y.，et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.313，938-947(2004).
36.Gallagher，T.M.，J.Virol.71，3129-3137(1997).
37.Holmes，K.V.，et al.，Adv.Exp.Med.Biol.494，193-198(2001).
38.Sturman，L.S.，et al.，J.Virol.64，3042-3050(1990).
39.Bernini，A，et al.，Biochem.Biophys..Res.Communi.325，1210-1214(2004).
40.World Health Organization(“WHO”)，Communicable Disease Surveillance&Response(CSR)Severe Acute Respiratort Syndrome.www.who.int/csr/sars/en.
權利要求
1.定位細胞中導致病毒感染的SARS-CoV S蛋白的位點的方法，包括在病毒感染之前用具有式X-PTTFFMMLKYDENGTITDAVDC-Z(SEQ ID NO2)；X-YQDVNCTDVSTA[HADQLTP-Z(SEQ ID NO6)；X-QYGSFCTQLNRALSGIAAEQ-Z(SEQ ID NO8)；X-IQKEIDRLNEVAKNLNESLI-Z(SEQ ID NO10)的肽或其組合接觸細胞。
2.權利要求1的方法，其中所述肽是SEQ ID NO6和SEQ ID NO8的組合。
3.權利要求1的方法，其中所述肽位于SARS-CoV S蛋白氨基酸殘基259-278、598-617、737-756，或1161-1180。
4.權利要求1的方法，其中所述肽結合于或鄰近于SARS-CoV S糖蛋白的ACE2結合區域或S1和S2結構域。
5.權利要求4的方法，其中所述肽預防、抑制或減少SARS-CoV感染。
6.權利要求5的方法，其中所述肽是SEQ ID NO2并干擾ACE2結合位點構象變化。
7.權利要求5的方法，其中所述肽是SEQ ID NO2、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8或SEQ ID NO10，并且所述肽通過模擬在ACE2結合誘導的構象變化之后暴露出的區域競爭性地結合到S蛋白單體上，來干擾包膜粒功能。
8.權利要求7的方法，其中所述肽在SARS-CoV S蛋白氨基酸殘基259-278、598-617、737-756，或1161-1180與SARS-CoV S蛋白結合。
9.權利要求1的方法，其中所述細胞來自靈長類或人類。
10.預防或抑制受試者中SARS-CoV感染的方法，包括向受試者施用有效量的藥物組合物，所述藥物組合物包含SEQ ID NO2、SEQ ID NO6、SEQID NO8、SEQ ID NO10，或其組合，和藥學上可接受的載體。
11.權利要求10的方法，其中所述藥物組合物包含SEQ ID NO6和SEQID NO8的組合。
12.權利要求10的方法，其中所述受試者是牛、馬、羊、豬、狗、貓、嚙齒動物、雞或靈長類。
13.權利要求10的方法，其中所述受試者是人。
14.通過實時定量PCR用特異性正向引物、反向引物和熒光標記的探針來測試抗病毒劑的抗病毒活性的方法。
15.權利要求14的方法，進一步包括硫酸鹽探針。
16.權利要求15的方法，其中所述硫酸鹽探針是SEQ ID NO15。
17.權利要求14的方法，其中正向引物是SARS-CoV S蛋白基因的DNA序列的片段。
18.權利要求17的方法，其中所述正向引物是SEQ ID NO11。
19.權利要求14的方法，其中反向引物是SARS-CoV S蛋白基因的DNA序列的片段。
20.權利要求19的方法，其中所述反向引物是SEQ ID NO12。
21.權利要求14的方法，其中所述熒光標記的探針是SEQ ID NO13。
22.權利要求14的方法，其中所述熒光標記的探針被作為任何實時PCR檢測系統中的報道分子的任何熒光物質標記。
23.權利要求22的方法，其中所述熒光標記的探針是SEQ ID NO14。
全文摘要
本發明提供了，用于定位SARS相關冠狀病毒(SARS－CoV)的刺突蛋白(S蛋白)上的關鍵部分或位點的方法，所述部分或位點引起導致嚴重的急性呼吸綜合征(SARS)的病毒感染。本發明還提供了靶向這種SARS－CoV的S蛋白的關鍵部分或位點的新的合成肽，用于在受試者中預防或治療SARS－CoV感染。本發明進一步提供了利用實時定量PCR測試抗病毒劑發揮的抗病毒活性的方法。
文檔編號G01N33/68GK1815234SQ200510131580
公開日2006年8月9日 申請日期2005年11月22日 優先權日2004年11月22日
發明者鄭伯建, 管軼, 黃建東, 何明亮 申請人:香港大學