功能化白蛋白及其納米制劑的制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種功能化白蛋白及其納米制劑的制備方法，屬于納米藥物及傳遞載體技術領域。
【背景技術】
[0002]多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)是指腫瘤細胞長期接觸某一化療物后可產生對此種化療藥物耐藥性，而且可對其他結構和作用機制不同的多種化療藥物產生交叉耐藥性。阿霉素(Doxorubicin)是乳腺癌化療的常用藥物，乳腺癌細胞對阿霉素產生耐藥是阿霉素化療失敗的主要原因(Detwiler A, et al.，2013)，也是影響臨床腫瘤患者預后的重要因素。現今逆轉乳腺癌細胞耐藥性的方法較少，目前研究發現MDR的有效抑制劑有維拉帕米、環孢素A、三苯氧胺、類固醇激素(Goncalves RS, et al., 2012; Zhang,et al.，2013; Zhang LH, et al.，2005)等，但這些耐藥逆轉劑干擾傳統的抗癌藥物藥代動力學，且可引起嚴重的毒副作用等，至今都未取得預期的臨床效果，因此在臨床上被限制使用。
[0003]近年來納米藥物用于逆轉腫瘤耐藥性受到越來越多的重視，脂質體、高分子聚合物納米載體、膠束等納米制劑(X1ngXB, et al., 2005 ；Ling Peng, et al., 2015)已被用于逆轉腫瘤耐藥性的研究。其逆轉原理為納米制劑通過內吞作用進入腫瘤細胞內，通過響應性釋放等性質將藥物釋放在胞質中，在很大程度上避開p-gp栗對游離抗腫瘤藥物的外排作用，增加藥物的攝取量，進而增強抑制腫瘤細胞增殖的效果。
[0004]pH響應性的藥物釋放系統是一類智能藥物釋放系統，它能根據所處環境的酸堿度對藥物進行可控性的釋放。人體的腫瘤胞外環境(pH 5.7-7.8)比正常血液或組織(pH約
7.4)顯酸性，而且細胞內涵體和溶酶體的pH更分別低至5.0和4.5。該類新型納米載體可通過胞吞途徑攜載藥物進入腫瘤細胞內涵體，避免了 P-gp對藥物的識別，而后內涵體的酸化(pH的改變)使其發生解聚或溶解，造成膜內外滲透壓的變化，使內涵體快速地膨脹破裂，從而集中釋放藥物至胞漿，完成對腫瘤細胞的殺傷作用。因此，pH響應性的藥物釋放系統在生物醫藥等領域尤其是抗腫瘤領域具有廣泛的應用前景。
[0005]本發明中使用內源性分子白蛋白及配位基團修飾(如組胺二鹽酸鹽等)，通過化學反應合成功能化白蛋白，不僅能夠改變白蛋白的等電點至堿性，可使其在中性環境下形成較好的納米顆粒；同時接枝的組胺能夠提供咪唑基團，提高了載體的緩沖能力，重點是增加了能夠與金屬離子配位的基團。

【發明內容】

[0006]目的:為了克服現有技術中存在的不足，本發明提供一種功能化白蛋白，通過pH響應性金屬配位鍵包載藥物，無需有機溶劑及高壓均質技術等方式實現納米顆粒的制備，可以在水溶液中自組裝形成納米顆粒，材料的合成簡單易行、納米顆粒的制備綠色環保。
[0007]技術方案:為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案為: 一種功能化白蛋白，其特征在于:所述功能化白蛋白是通過化學反應將配位基團修飾到白蛋白游離基團上，使具有與金屬離子配位的功能。
[0008]所用白蛋白，選自牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、重組人血清白蛋白、卵清蛋白、卵白蛋白、血清白蛋白、乳白蛋白、肌白蛋白、麥白蛋白、豆白蛋白；所修飾的配位基團選自胺基、咪唑基、胍基、羥基、巰基、羧基、磺酸基、磷酸基。
[0009]本發明還提供一種功能化白蛋白納米制劑，由上述的功能化白蛋白、金屬離子、藥物組成；金屬離子同時與功能化白蛋白和藥物形成配位鍵，誘導自組裝形成納米顆粒。功能化白蛋白納米制劑是將功能化白蛋白、金屬離子和藥物通過配位誘導的組裝方式而形成的。
[0010]所述的功能化白蛋白納米制劑的制備方法，包括以下步驟:
(1)首先將藥物與金屬鹽按照配位比例為1:0.5-1:4進行混合，得藥物與金屬離子的配位復合物；
(2)在攪拌條件下，將藥物與金屬的配位復合物逐滴加入到1-5%(W/V)的功能化白蛋白水溶液中；
(3)使用0.1 M NaOH溶液調節pH至6.5-8.0，然后在0?50°C下攪拌0.5_12h ；
(4)使用截留分子量為3500-14000的透析袋在水中透析除去游離藥物后，冷凍干燥即得。可用水復溶后使用；用于靶向輸送藥物。
[0011]所述的功能化白蛋白納米制劑的制備方法，其特征在于:所述的金屬鹽為可溶性的鋅鹽、鐵鹽、銅鹽、鈷鹽、錳鹽、鎳鹽、鑭鹽、釓鹽、銀鹽、鋯鹽、鈦鹽；選自硝酸鋅，硝酸鐵，硝酸銅，硝酸鈷，硝酸錳，硝酸鎳，硝酸鑭，硝酸釓，硝酸銀，硝酸鋯，硝酸鈦，氯化鋅，氯化鐵，氯化銅，氯化鈷，氯化錳，氯化鎳，氯化鋯，氯化鑭，氯化釓，氯化銀，氯化鋯，氯化鈦，硫酸鋅、硫酸鐵、硫酸銅、硫酸鈷、硫酸錳、硫酸鎳、硫酸鑭，硫酸釓，硫酸銀，硫酸鋯，硫酸鈦中的一種或幾種。
[0012]所述的功能化白蛋白納米制劑的制備方法，其特征在于:所述藥物為含有羥基、羰基、巰基、氨基、羧基、胍基、磺酸基或磷酸基的有機化合物。
[0013]作為更優選，所述藥物為蒽環類藥物或黃酮類藥物。
[0014]作為優選方案，所述蒽環類藥物包括鹽酸柔紅霉素、鹽酸阿霉素、鹽酸伊達比星、鹽酸表阿霉素、鹽酸阿柔比星、鹽酸佐柔比星、吡柔比星、依索比星、卡柔比星、奈莫柔比星、戊柔比星、地托比星、羅多比星、美多比星、達佐霉素、絲裂霉素、博萊霉素、平陽霉素、米托蒽醌、茜素紅、鄰菲啰啉。
[0015]作為優選方案，所述黃酮類藥物包括大黃素、黃芩素、黃芩苷、槲皮素、蘆丁、陳皮素、甘草苷、水飛薊素、兒茶素、銀杏素、木犀草苷、木犀草素、葛根黃酮。
[0016]有益效果:本發明提供的功能化白蛋白與現有技術相比，具有以下優點:
該材料的合成方法簡單，使用內源性分子白蛋白及含有配位基團的分子(如組胺二鹽酸鹽等)，通過化學反應合成功能化白蛋白，不僅能夠改變白蛋白的等電點至堿性，可使其在中性環境下形成較好的納米顆粒；同時接枝的組胺能夠提供配位基團，提高了載體的緩沖能力，重點是增加了能夠與金屬離子配位的基團。該功能化白蛋白納米制劑的制備方法簡單易行，不使用有機溶劑，可使其在中性環境下在水溶液中形成較好的納米顆粒，即將藥物及功能化白蛋白通過金屬配位鍵交聯起來，并通過調節pH值至中性使其組裝成納米顆粒。本發明的自組裝納米顆粒能夠通過內吞途徑進入細胞，避開p-gp栗對藥物的外排作用，并根據PH的細微變化進行可控的藥物釋放，實現對耐藥腫瘤細胞的有效治療。
【附圖說明】
[0017]圖1為實施例1中功能化白蛋白合成示意圖。
[0018]圖2為實施例4中合成的功能化白蛋白的表征:(A)元素分析，(B)SDS-PAGE凝膠電泳實驗，(C)緩沖能力試驗。
[0019]圖3為實施例8中制備的納米顆粒的表征:(A)熒光猝滅法證明BH與Fe3+可以配位，(B)、(C)分別為 ICP-MS 測定 D0X- Fe3+配合物中的 Fe 和 N，(D) D0X、BH_ Fe 3+、D0X_Fe3+及BH- Fe 3+_D0X納米顆粒(NPs)的紫外吸收光譜，(E)BH- Fe3+-D0X納米顆粒溶解在pH值為7.4、6.5、5.5、4.5的PBS及1M HC1中的紫外吸收光譜。
[0020]圖4為實施例9中制備的納米顆粒的響應性釋放:(A) BH- Fe3+_D0X納米顆粒在pH值為7.4、6.5、5.5、4.5的PBS中的累積釋放曲線，(B)BH_ Fe3+_D0X納米顆粒在pH 7.4的PBS及ImM的去鐵胺(DF0)中的累積釋放曲線。
[0021]圖5為實施例10中制備的納米顆粒在敏感及耐藥乳腺癌細胞中不同藥物濃度下不同時間的細胞毒性:(A) MCF-7，24h、(B) MCF-7/ADR，24h (C) MCF-7，72h、(D) MCF-7/ADR，72h0
[0022]圖6為實施例10中制備的納米顆粒在敏感及耐藥乳腺癌細胞中的攝取研究:(A)在MCF-7、(B) MCF-7/ADR細胞上，對照相當量的游離藥，給予不同濃度的納米顆粒，觀察不同時間段內的攝取量，(C)在MCF-7、MCF-7/ADR細胞中分別給予相當量藥物濃度的游離藥及納米顆粒，孵育一定時間后對溶酶體及細胞核進行染色，共聚焦顯微鏡下觀察攝取情況。
[0023]圖7為實施例10中制備的納米顆粒對耐藥乳腺癌細胞株的細胞凋亡效果。
【具體實施方式】
[0024]下面結合附圖和具體實施例對本發明作更進一步的說明。
[0025]實施例1
如圖1所示，在攪拌條件下，將13.875g組胺二鹽酸鹽(HA)加入到50ml 50%(W/V)牛血清白蛋白(BSA)的中性磷酸鹽緩沖溶液中，然后使用1M HC1溶液調節體系的pH值到4.75，最后加入4.5g 1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC.Η(:1)進行催化，室溫攪拌反應6h。加入4M醋酸鹽緩沖鹽終止反應后使用截留分子量14000的透析袋在去離子水中透析3天；過濾，在-80 °C冷凍，干燥得到咪唑化白蛋白(BH)。
[0026]實施例2
在攪拌條件下，將17.2g硫酸胍基丁胺(Agm)加入到50ml 50% (W/V)人血清白蛋白(HSA)的中性磷酸鹽緩沖溶液中，然后使用1M HC1溶液調節體系的pH值到4.75，最后加入
4.5g 1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC.HC1)進行催化，室溫攪拌反應6h0加入4M醋酸鹽緩沖鹽終止反應后使用截留分子量14000的透析袋在去離子水中透析3天；過濾，在-80 V冷凍，干燥得到胍基化白蛋白(HSA-Agm)。
[0027]實施例3
在攪拌條件下，將15.252g精胺(SPE)加入到50ml 50% (W/V)人血清白蛋白(HSA)的中性磷酸鹽緩沖溶液中，然后使用1M HC1溶液調節體系的pH值到4.75，最后加入4.5g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDOHC1)進行催化，室溫攪拌反應6h。加入4M醋酸鹽緩沖鹽終止反應后使用截留分子量14000的透析袋在去離子水中透析3天；過濾，在-80 V冷凍，干燥得到胍基化白蛋白(HSA-SPE)。
[0028]實施例4
如圖2所示，BH的表征(元素分析、SDS-PAGE電泳實驗、緩沖能力試驗)
2.1首先利用元素分析儀測定BH中各元素(C、H、N)的含量，通過含氮量的變化計算組胺的接枝量，進而計算出BH的分子量。
[0029]2.2使用SDS-PAGE電泳證明接枝前后分子量發生變化，本試驗根據分子篩原理，分子大小不同的蛋白質產生不同的迀移率，電泳后在不同的水平位置出現蛋白條帶。具體操作如下:
2.2.1配制濃度為10%的SDS-PAGE凝膠電泳
2.2.2蛋白變性，稱取濃度為lmg/ml為BSA及BH，加入相應量的上樣緩沖液，在100°C沸水浴中煮沸5min。
[0030]2.2.3上樣后電泳，分別加入5yL蛋白Marker、4yL BSA、4yL BH，然后在100V電壓下進行電泳，2h后停止。
[0031]2.2.4使用去離子水清洗